專(zhuān)利名稱(chēng)：一種當(dāng)歸苦參提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種當(dāng)歸苦參復(fù)方提取工藝。
背景技術(shù)：
痤瘡、濕疹為臨床常見(jiàn)皮膚病，影響著患者的生活質(zhì)量和美觀。西醫(yī)治療痤瘡、濕 疹等皮膚病多用激素、抗生素或其它的一些消炎抑菌藥，易產(chǎn)生過(guò)敏，肝、腎損傷，色素沉 著，停藥后反彈等副作用(參見(jiàn)王海生等主編，臨床新藥手冊(cè)[M]，天津天津科技出版社， 2000年9月，第1版1，434.)；而當(dāng)歸苦參丸是我國(guó)第一批非處方中成藥，其作用緩和，毒 副作用小，價(jià)格低廉，無(wú)需聯(lián)合用藥，是治療這些皮膚病較理想的復(fù)方。當(dāng)歸苦參丸來(lái)源于《古今醫(yī)鑒》參歸丸，原書(shū)記載“參歸丸，治酒糟鼻，乃血熱入 肺”。近代醫(yī)家在辨證基礎(chǔ)上，將其廣泛用于治療血燥濕熱所致的頭面瘡瘍，粉刺疙瘩以及 濕疹等疾病。但當(dāng)歸苦參丸多以藥材原粉入藥制成大蜜丸，不但服用不便，劑量大，雜質(zhì)多， 易霉變，而且揮發(fā)性成分易損失，質(zhì)量難以控制，大大限制了其臨床應(yīng)用。目前，對(duì)當(dāng)歸苦參 丸方藥成分提取和劑型改革方面的研究報(bào)道很少，為此，需要開(kāi)發(fā)新方法對(duì)其進(jìn)行提取研 允。當(dāng)歸苦參方中選苦參為君，該藥味苦性寒，具有清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲(chóng)之功。然苦參 屬苦燥傷陰之品，血虛生燥易加重瘙癢，故佐以當(dāng)歸，該藥味甘辛苦，性溫能養(yǎng)血潤(rùn)燥，與苦 參相伍，既可防苦參性寒助濕之弊，又可用其辛散活血、補(bǔ)血之功，阻遏濕邪重濁粘滯之性， 使之能寒溫并施，寒不助濕，溫不增燥，燥濕無(wú)妨補(bǔ)血，補(bǔ)血無(wú)礙燥濕，血活濕不得留滯，共 奏清熱活血，祛風(fēng)燥濕，殺蟲(chóng)止癢之功。有實(shí)驗(yàn)研究表明具有此類(lèi)作用的復(fù)方有較強(qiáng)的抑 制小鼠變態(tài)性接觸性皮炎的作用(參見(jiàn)涂彩霞等，四種中藥復(fù)方對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性皮炎作用的 研究[J]，中華皮膚科雜志，1998，31 (4) 244.)。現(xiàn)代藥理研究表明苦參堿具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌、皮膚致病性真菌及 變態(tài)反應(yīng)的作用(參見(jiàn)樊宏偉等，苦參堿類(lèi)生物堿的體外抑菌、抑病毒及誘生干擾素的實(shí) 驗(yàn)研究[J]，中醫(yī)藥信息，2000，17 (4) 75 ；吳玲清等，氧化苦參堿對(duì)小鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺 釋放的抑制作用及其機(jī)制的研究[J]，中華微生物和免疫學(xué)雜志，1992，12(1) 41 ；樓之岑 等，常用中藥材品種整理和質(zhì)量研究[M]，北京北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版 社，1995 343.)，裴仁九等人研究證明苦參堿對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、 血清溶血素的生成均有抑制作用(參見(jiàn)裴仁九等，苦參堿對(duì)小鼠免疫功能的影響[J]，海峽 藥學(xué)，1998，10 (2) :7.)?？鄥⒖偵飰A對(duì)金黃色葡萄球菌也有抑制作用(參見(jiàn)陳婷婷等， 苦參總堿有效成分對(duì)柯薩基B3m病毒感染的Hele細(xì)胞的保護(hù)作用[J]，中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免 疫學(xué)雜志，1997，9(1) :18.)。苦參抑制變態(tài)反應(yīng)的機(jī)制與氨茶堿相同，即苦參中的苦參總 堿能抑制環(huán)核苷酸磷酸二酯酶，提高體內(nèi)環(huán)磷腺苷，阻止肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺(參見(jiàn) 殷金珠等，苦參治療I型變態(tài)反應(yīng)性疾病的機(jī)理研究[J]，北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，25 (2) 84 ；秦萬(wàn)章主編，現(xiàn)代中醫(yī)藥應(yīng)用與研究大全·皮膚科[M]，上海上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社， 1994 :128.)。當(dāng)歸含有阿魏酸、多糖、17種氨基酸及微量金屬元素等成分，具有提高機(jī)體細(xì)
3胞免疫、體液免疫功能(參見(jiàn)韓克慧，中藥免疫實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用[M]，北京學(xué)術(shù)期刊 出版社，1999.)及類(lèi)雌激素樣作用(參見(jiàn)寇俊萍等，當(dāng)歸芍藥散對(duì)多種記憶損傷動(dòng)物模型 的影響[J]，中成藥，2002，24 (3) 191.)的作用。當(dāng)歸中的阿魏酸具有抗氧化作用，通過(guò)對(duì) 自由基的消除，阻斷了自由基的反應(yīng)而發(fā)揮抗損傷、提高免疫系統(tǒng)功能，同時(shí)還有抗菌消炎 等作用(參見(jiàn)歐仕益等，阿魏酸及其衍生物的藥理作用研究進(jìn)展[J]，中藥材，2001，24(3) 220.)。當(dāng)歸主要含揮發(fā)性和水溶性成分兩大部分，阿魏酸是水溶性成分中主要有效成分之一。中藥制劑與西藥制劑最大的差別是制劑的原料，因此中藥制劑的基礎(chǔ)研究，除與 西藥制劑一樣，包括制劑成型理論和技術(shù)、質(zhì)量控制、合理應(yīng)用等內(nèi)容，還包括對(duì)中藥或方 劑藥效物質(zhì)的提取、精制、濃縮、干燥等內(nèi)容，其中關(guān)鍵問(wèn)題是“提取”。用何種思路和方法 將中藥或方劑的藥效物質(zhì)最大限度地提取出來(lái)，以保持中藥或方劑特有的療效值得深思， 是提取方法研究的核心；同時(shí)又是減小劑量、創(chuàng)新劑型、提高臨床療效的基本前提。目前， 多數(shù)中藥制劑的制備仍局限于傳統(tǒng)的水提醇沉，或僅以提取單體成分為目的的有機(jī)溶劑提 取，前者在某些方面是合理的，但若把此種方法視為中藥提取的“通則”就絕對(duì)化了，會(huì)阻礙 復(fù)方中藥提取工藝的發(fā)展。后者則忽視了藥物間各成分的協(xié)同作用，不能體現(xiàn)復(fù)方的整體 作用，更不符合中醫(yī)臨床用藥的綜合作用特點(diǎn)。如何在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，充分利用先進(jìn)的 工藝技術(shù)，以盡可能的保留原方的活性物質(zhì)，提高藥效，是目前中醫(yī)藥界面臨的重大問(wèn)題之
ο必須指出，中醫(yī)用藥絕不是單體成分，而是多種成分相互作用的綜合結(jié)果，這種綜 合效能從化學(xué)成分上考慮，可能是一種中藥共存成分之間或(和)多種中藥成分之間的復(fù) 合作用；從藥劑學(xué)的角度考慮，可能是藥材(飲片)提取過(guò)程中生成新的化合物；從藥物代 謝過(guò)程考慮，可能是體內(nèi)發(fā)揮藥效過(guò)程中的復(fù)合作用。藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)唯一決定藥效的觀點(diǎn) 已被打破；中藥成分“無(wú)效”與“有效”的舊有界限也逐步被打破，某些過(guò)去認(rèn)為是無(wú)效的成 分，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它有新的生物活性，如人參、黃芪、枸杞子、豬苓等具補(bǔ)益作用的中藥中所含的 多糖類(lèi)成分，在增強(qiáng)人體免疫機(jī)能、抗癌等方面顯示出較強(qiáng)的生物活性；天花粉蛋白質(zhì)可用 于中期妊娠引產(chǎn)；金龍膽草中含有的樹(shù)脂具鎮(zhèn)咳平喘功能；鞣質(zhì)在注射劑中應(yīng)作為雜質(zhì)去 除，而在五倍子中是具收斂作用的成分。因此只以復(fù)方中某單體化學(xué)成分的動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn) 為指標(biāo)研究中藥提取工藝和制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有很大的局限性。“化學(xué)等值不一定生物等效”。 體內(nèi)藥效的發(fā)揮不僅包括原型藥物，更包括其代謝產(chǎn)物。多數(shù)藥物代謝后活性減弱或喪失， 但也有的藥物代謝物活性增強(qiáng)，還有的沒(méi)有生物活性的藥物經(jīng)代謝后產(chǎn)生活性物。將復(fù)方 體外與體內(nèi)藥效物質(zhì)的化學(xué)研究緊密結(jié)合起來(lái)進(jìn)行提取工藝和質(zhì)量控制研究應(yīng)該說(shuō)是一 種創(chuàng)新型研究，也是時(shí)代發(fā)展的必然。固體發(fā)酵技術(shù)(Solid-State-Fermentation Technology)是生物技術(shù)的一種，是 指某些生長(zhǎng)需水很少的微生物利用疏松而含有必需營(yíng)養(yǎng)物的固體培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵。真菌 是固體發(fā)酵最普遍被使用的微生物，因其菌絲如同植物的根能在固態(tài)表面生長(zhǎng)，并滲透到 基質(zhì)內(nèi)，產(chǎn)生多樣的胞外酵素能力，故比其他單細(xì)胞的細(xì)菌及酵母菌更適合固體發(fā)酵的環(huán)鏡。目前，發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于中藥的研究主要是液體發(fā)酵技術(shù)。固體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用中藥 復(fù)方的研究還沒(méi)有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前當(dāng)歸苦參丸多以藥材原粉入藥制成大蜜丸，不但服用不便，劑量 大，雜質(zhì)多，易霉變，而且揮發(fā)性成分易損失，質(zhì)量難以控制，并且目前，對(duì)當(dāng)歸苦參丸方藥 成分提取和劑型改革方面的研究報(bào)道很少等問(wèn)題，發(fā)明人從中藥復(fù)方中各種成分的層次 性、聯(lián)系性，復(fù)方的整體作用角度出發(fā)，根據(jù)中藥復(fù)方的作用特點(diǎn)是多成分、多途徑、多環(huán)節(jié) 和多靶點(diǎn)，意在提供一種當(dāng)歸苦參新的提取工藝，通過(guò)采用固體發(fā)酵技術(shù)預(yù)處理當(dāng)歸和苦 參后，再結(jié)合傳統(tǒng)的水煎提取工藝對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物處理，以得到抗炎作用效果更強(qiáng)的提取液產(chǎn) 物。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人提供如下的技術(shù)方案一種當(dāng)歸苦參提取工藝，包括下述步驟(1)固體發(fā)酵處理將原料按重量份當(dāng)歸和苦參400-600份、麥麩0-20份，氧化鈣1_6份及水20_40份 稱(chēng)取并混勻，混合物經(jīng)滅菌處理后接種雞腿菇，然后于溫度25-29°C下發(fā)酵培養(yǎng)25-31天，(2)水提取處理步驟⑴得到的發(fā)酵產(chǎn)物加入其重量6-10倍的水，煎提處理得到提取液。本發(fā)明固體發(fā)酵處理中，當(dāng)歸和苦參為底物，麥麩的作用是提供碳源、氮源，氧化 鈣為無(wú)機(jī)鹽，其主要作用為調(diào)節(jié)PH值。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)。主 要功用是①構(gòu)成菌體成分；②作為酶活性基的組成部分或維持酶的活性；③調(diào)節(jié)滲透壓、 PH值、氧化還原電位等；④作為自養(yǎng)菌的能源。水為溶劑，其作用為潤(rùn)濕藥材。影響固體發(fā) 酵的因素較多，如C/N、底物濃度、溫度、時(shí)間等。根據(jù)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)， 碳源和氮源以及C/N對(duì)該復(fù)方發(fā)酵的結(jié)果影響不明顯，其發(fā)酵結(jié)果基本與單獨(dú)用當(dāng)歸、苦 參最為底物的結(jié)果相同。故發(fā)明人對(duì)不同組合發(fā)酵菌種用正交設(shè)計(jì)安排一系列發(fā)酵實(shí)驗(yàn)， 探索時(shí)間、溫度、接種量等因子的實(shí)驗(yàn)室最佳水平，以選擇最佳菌種使本發(fā)明的藥材發(fā)酵。雞腿菇，學(xué)名毛頭鬼傘，別名雞腿蘑、刺蘑菇，拉丁名=Copyinds Comatus(MUILFr)Gray。發(fā)明人為了篩選出適合本發(fā)明當(dāng)歸苦參用的真菌菌種，做了大量 研究。下面就以雞腿菇、靈芝及雞腿菇靈芝混合物為例，說(shuō)明本發(fā)明選用雞腿菇作為發(fā)酵菌 種的原因。取200g當(dāng)歸(過(guò)20目篩)、200g苦參(過(guò)20目篩)，麥麩IOg及氧化鈣2g，攪 拌均勻，加入20ml的水(至藥材濕潤(rùn))，充分?jǐn)噭蚝蟮乃幜涎b入發(fā)酵培養(yǎng)袋，密封。將發(fā)酵 培養(yǎng)袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之 間，時(shí)間1. 5h。放涼后取出培養(yǎng)袋。分別選用雞腿菇、靈芝、雞腿菇靈芝進(jìn)行接種，接種量為 2g(0. 5% )。如取雞腿菇母種試管，接種針在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種 部分除去，取一部分放入貼標(biāo)簽的培養(yǎng)袋中，迅速密封放好。同樣的操作接種靈芝組、雞腿 菇靈芝組。然后將3組放入20°C恒溫箱中培養(yǎng)30天。30天后的3組菌種發(fā)酵情況是，雞 腿菇組與靈芝單種組、比雞腿菇加靈芝合種組相比，其菌絲生長(zhǎng)情況最好。雞腿菇菌種在當(dāng) 歸、苦參中發(fā)酵良好，菌絲覆蓋全部藥材，而靈芝菌種在當(dāng)歸、苦參上面基本沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)， 靈芝與雞腿菇共同發(fā)酵組，其菌絲生長(zhǎng)情況介于二者之間，故本發(fā)明選用雞腿菇做當(dāng)歸苦 參固體發(fā)酵的菌種。3組菌種發(fā)酵結(jié)果圖片(參見(jiàn)附圖la、圖Ib和圖lc)，附圖Ia是雞腿
5菇組菌種發(fā)酵圖片，可以看出，菌絲覆蓋全部藥材；附圖Ib是靈芝組菌種發(fā)酵圖片，可以看 出，菌絲沒(méi)有生長(zhǎng)；附圖Ic是雞腿菇靈芝組菌種發(fā)酵圖片，菌絲部分生長(zhǎng)。雞腿菇菌種在當(dāng)歸苦參方藥中發(fā)酵良好，其機(jī)制可能是雞腿菇更適合于當(dāng)歸苦參 藥材的發(fā)酵條件，靈芝則相反。而當(dāng)它們共同發(fā)酵的時(shí)候，發(fā)酵結(jié)果介于兩者之間，這可能 是兩種真菌相互競(jìng)爭(zhēng)抑制的結(jié)果。進(jìn)一步發(fā)明人在優(yōu)選出雞腿菇作為最佳菌種的基礎(chǔ)上，以固體發(fā)酵菌絲體質(zhì)量為 指標(biāo)，考察了藥材量(當(dāng)歸苦參按重量1 1比例配比)、生長(zhǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間及培養(yǎng)基添加 麥麩量4個(gè)因素，以L9 (34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，作多因素正交試驗(yàn)優(yōu)選固體發(fā)酵條件，因素水 平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表1正交試驗(yàn)優(yōu)選固體發(fā)酵條件 表2正交試驗(yàn)結(jié)果 注=A 藥材量(g) ；B 溫度(°C ) ；C 發(fā)酵時(shí)間(d) ；D 麩皮量(g) ；Y 菌絲體重量 (g)。表3發(fā)酵條件方差分析表由各因素的離均差平方和計(jì)算可知SSA = 9X 10_6SSd = 0. 0003. 22。以上SSA、SSd很小，這表明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響或影響甚微，可以認(rèn)為該列 的離均差平方和主要是試驗(yàn)誤差引起的。為了提高分析精度，常把它們合并在誤差離均差 平方和中一起作為試驗(yàn)誤差。注*(F0.05(2，4) =6.94)有顯著意義，# (F0. 01 (2，4)= 18. 00)有極顯著意義。 注*(F0.05(2，4) = 6. 94)有顯著意義，#(F0. 01 (2，4) = 18. 00)有極顯著意義。分析表明因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有非常極顯著的影響，C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果也有顯著影響， 而A和D的影響不顯著。結(jié)論正交試驗(yàn)方差分析原則只選取有顯著意義因素的最高水平和交互作用的最優(yōu)搭 配，確定出最佳方案，不顯著的因素，原則上可以根據(jù)實(shí)際條件(如節(jié)約、省時(shí)等)酌情確定 一個(gè)水平。由以上原則B可取B2, C可取C3，A從節(jié)約藥材的角度可選A1, D從實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的角 度考慮可選D2。綜合上訴分析，得到最佳方案為A1B2C3D2，藥材量為400g，溫度27°C，發(fā)酵時(shí) 間31d，麩皮量10g。按照優(yōu)選出工藝進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果菌絲體重量為0. 162g。中藥復(fù)方用固體發(fā)酵技術(shù)提取的主要理論依據(jù)有以下幾點(diǎn)(1)微生物及其代謝過(guò)程中產(chǎn)生豐富的酶類(lèi)，能降解大量中藥植物纖維素，降低淀 粉等高分子對(duì)中藥成分的包裹作用，利于有效成分溶出。微生物在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生成百 上千的胞內(nèi)酶，并且可以分泌幾十種胞外酶到培養(yǎng)基中去，這些酶可水解植物細(xì)胞壁的纖 維素、半纖維素、果膠質(zhì)等，使細(xì)胞破裂，細(xì)胞間隙增加，減小細(xì)胞壁、細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障 對(duì)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，利于有效成分溶出(參見(jiàn)Yang X et al, Bioconversion of corn straw by coupling ensiling and solid-state fermentation,Bioresour Technol，2001 Jul，78 (3) =277-280) 0而且淀粉等大分子物質(zhì)可以作為微生物 生長(zhǎng)代謝所需的氮源和碳源，被微生物消耗、代謝、降解、吸收，促進(jìn)有效成分的釋放(參見(jiàn) Sati SC et al,Utilization of various carbon sources for the growth ofwaterborne conidial fungi，Mycologia，2006S印-Oct，98(5) :678681)。(2)用固體發(fā)酵技術(shù)提取中藥可以使某些在體內(nèi)不能直接被利用的藥物有效活 性組分，在體外消解得以完成而被直接利用，并能除去大分子雜質(zhì)，迅速發(fā)揮應(yīng)有效能。如 中藥大多含有苷類(lèi)化合物，所含苷類(lèi)多數(shù)為藥物前體，發(fā)揮藥效的主體物質(zhì)一般都是苷元， 其含糖部分被切掉后進(jìn)入血液循環(huán)，才能更好的發(fā)揮藥理作用。藥物發(fā)酵后，苷元連接的 糖基會(huì)在體外被眾多微生物及其代謝產(chǎn)生的酶所利用而被消解掉，只剩下目標(biāo)物質(zhì)苷元， 即利用代謝酶的作用使促進(jìn)苷鍵的斷裂從而使提取率得到提高(參見(jiàn)Fujita R et al, Anti-androgenic activities of Ganoderma lucidum. J Ethnopharmaco1,2005 Oct 31, 102(1) 107-112)。(3)用固體發(fā)酵技術(shù)提取方藥時(shí)選擇具有協(xié)同作用的藥用真菌，其本身就具有補(bǔ) 充或增強(qiáng)方劑中藥物的功能，能增強(qiáng)中藥復(fù)方的臨床療效，這充分體現(xiàn)出中藥方劑的配伍 思想與理論。有益微生物還能利用中藥中的成分促進(jìn)自身的增殖，這比單一使用活菌制劑 或向提取液中加酶，或?qū)⒍吆?jiǎn)單的結(jié)合在一起使用，可能會(huì)取得明顯的增效作用。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的 當(dāng)歸和苦參按重量比1 1配料。中藥原料配比，參考中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)21冊(cè)當(dāng)歸苦參丸 (WS3-B-0537-91)。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的當(dāng)歸 和苦參的粒度要求為粉碎成20目粗粉。藥材粉碎20目的要求是本領(lǐng)域一般提取均用粗粉 的規(guī)格。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的雞腿 菇的接種量為0. 5-1. Owt%，以當(dāng)歸和苦參重量計(jì)。固體發(fā)酵接種量一般不會(huì)過(guò)大，過(guò)小會(huì) 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率；過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，而且會(huì)過(guò)多移 入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(1)中的滅菌 處理為壓力0. 1-0. 15MPa、時(shí)間1_2小時(shí)。對(duì)于本領(lǐng)域來(lái)說(shuō)，結(jié)合常用經(jīng)驗(yàn)值和本發(fā)明的 研究探索，滅菌處理的工藝條件控制在這些合理范圍內(nèi)就能夠徹底滅菌。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(2)中的煎提 處理做3次以上，煎煮時(shí)間共需3個(gè)小時(shí)以上。更有選的是，煎提處理做3次，一共煎煮3 個(gè)小時(shí)，這一工藝條件的探索研究可參見(jiàn)發(fā)明人此前的一篇文獻(xiàn)報(bào)道，即(王英姿等，均勻 設(shè)計(jì)優(yōu)選當(dāng)歸苦參丸方藥的半仿生提取工藝條件[J]，中草藥，2005，36 (2) :212-214.)。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的當(dāng)歸苦參提取工藝，其中，所述的步驟(2)中的煎 提處理的溫度為90-100°C。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，水煎提取藥材，其溫度控制在 90-100°C，其提取效果并無(wú)顯著性差異。根據(jù)本發(fā)明選用藥材的特點(diǎn)，將阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面 積和分子量< 1000的提取物得率作為指標(biāo)成分，測(cè)定指標(biāo)成分含量即可得知本發(fā)明產(chǎn)物 的提取效果。多指標(biāo)綜合評(píng)判提取方法的結(jié)果，更為合理、全面和科學(xué)，也更能體現(xiàn)中醫(yī)復(fù)
8方治病多成分綜合作用的特點(diǎn)。其中，將分子量< 1000的提取物得率作為指標(biāo)成分的原因 (參見(jiàn)孫秀梅等，用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選香附SFE-CO2萃取后藥渣的半仿生法工藝條件[J]，中國(guó) 中藥雜志，2009，34 (22) 2880-2883.)，該文獻(xiàn)指出，天然藥物和中藥中，已知單體化合物絕 大多數(shù)分子量< 1000。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明是利用生物技術(shù)提出的一種新型提取方法，既保留中藥作為多組分，多靶 點(diǎn)協(xié)同作用制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，又滿(mǎn)足開(kāi)發(fā)新型現(xiàn)代制劑的要求。與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵培養(yǎng)基單純，前處理簡(jiǎn)單，發(fā)酵條件易于操作，適合絲 狀真菌生長(zhǎng)，可以多菌種同時(shí)放在一起發(fā)酵。其發(fā)酵產(chǎn)品性能較好，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)環(huán)境污染 比較小，且利于生物循環(huán)等。與現(xiàn)有當(dāng)歸苦參水提取相比，本發(fā)明產(chǎn)品的抗炎作用更強(qiáng)，并且安全無(wú)毒。通常中藥提取是以粗提物為最終產(chǎn)物，而本研究最終產(chǎn)物是分離制得“分子量 ^ IOOODa的提取物”。分子量< IOOODa的提取物既能體現(xiàn)中藥整體、綜合、客觀、模糊的特 點(diǎn)，又可縮小服用劑量，為選用軟膠囊、滴丸等現(xiàn)代藥物劑型提供了可能，同時(shí)提高了技術(shù) 含量。因此，本發(fā)明是中藥藥效物質(zhì)提取研究設(shè)計(jì)的一種新思路。


圖1是本發(fā)明菌種發(fā)酵照片，圖Ia是雞腿菇菌種發(fā)酵照片，可見(jiàn)菌絲覆蓋全部藥 材；圖Ib是靈芝菌種發(fā)酵照片，可見(jiàn)菌絲沒(méi)有生長(zhǎng)；圖Ic是雞腿菇與靈芝混合發(fā)酵照片， 可見(jiàn)菌絲部分生長(zhǎng)。圖2是本發(fā)明生理鹽水對(duì)照組、實(shí)施例1提取液組、比較例1提取液組和陽(yáng)性對(duì)照 組對(duì)兔耳實(shí)驗(yàn)性角化模型的影響的光鏡檢查圖片(HE染色X40)，圖2A 生理鹽水組，病變 無(wú)明顯改善，表皮層仍增厚，毛囊有大量角化物；圖2B 維胺脂膠囊陽(yáng)性藥組，表皮層變薄， 毛囊角化物少且疏松或無(wú)角化物；圖2C 實(shí)施例1發(fā)酵藥材提取液組，表皮變薄，毛囊無(wú)角 化物；圖2D 比較例1未發(fā)酵藥材水提取液組，表皮層也變薄，毛囊有中等量角化物且較疏 松。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局 限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均 可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè)常用的。主要原料和設(shè)備的說(shuō)明當(dāng)歸和苦參購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)閆玉凝教授鑒定，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng) 歸AngelicasinensiS(01iV.)DielS的干燥根經(jīng)加工制成的飲片，苦參為豆科植物苦參 Sophoraflavescena Ait.的干燥根經(jīng)加工制成的飲片，均符合《中國(guó)藥典》2005年版(一 部)該藥材項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。雞腿菇菌種購(gòu)自山東省農(nóng)科院。阿魏酸、苦參堿對(duì)照品(中 國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)依次為110773200611，110805200507，供含量測(cè)定用)。
精密pH計(jì)(pHS-3C型，上海雷磁儀器廠)；高效液相色譜儀(HP1100系列，美國(guó) Agilent公司)，電子天平(YP601N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，離心沉淀機(jī)(LXJ-II 型，上海醫(yī)療器械三廠)，超聲波清洗器(KQ-100B型，昆山市超聲儀器有限公司)。實(shí)施例1取200g當(dāng)歸(過(guò)20目篩)、200g苦參(過(guò)20目篩)，麥麩IOg及氧化鈣2g，攪拌 均勻，加入20g(即20ml)的水潤(rùn)濕藥材，充分?jǐn)噭蚝蟮乃幉难b入發(fā)酵培養(yǎng)袋，密封。將發(fā)酵 培養(yǎng)袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之 間，時(shí)間1.5h。放涼后取出培養(yǎng)袋。接種雞腿菇，接種量為0.5wt% 取雞腿菇母種試管， 接種針在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標(biāo)簽的 培養(yǎng)袋中，迅速密封放好。然后將培養(yǎng)袋放入27°C恒溫箱中培養(yǎng)31天。將固體發(fā)酵以后 的藥材用“雙提法”在常壓下90-92°C加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、 6倍、6倍，提取時(shí)間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成相對(duì)密度為1. 30 1.35(20°C)的清膏(每ImL樣品液相當(dāng)于原處方藥材0.4g)。揮發(fā)油另器保存。測(cè)定指標(biāo)成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標(biāo)成分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)的單位 和量綱不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時(shí)考慮各指標(biāo)在提取中的主 次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出提取液的綜合評(píng)判參數(shù)Y值。結(jié)果見(jiàn)表4。干浸膏量的測(cè)定，按照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測(cè)定法。實(shí)施例2取250g當(dāng)歸(過(guò)20目篩)、250g苦參(過(guò)20目篩)，麥麩12g及氧化鈣2g，攪拌 均勻，加入30g(即30ml)水潤(rùn)濕藥材，充分?jǐn)噭蚝蟮乃幜涎b入發(fā)酵培養(yǎng)袋，密封。將發(fā)酵培 養(yǎng)袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間， 時(shí)間2h。放涼后取出培養(yǎng)袋。接種雞腿菇，接種量為0.7wt% 取雞腿菇母種試管，接種針 在試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標(biāo)簽的培養(yǎng)袋 中，迅速密封放好。然后將培養(yǎng)袋放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)28天。將固體發(fā)酵以后的藥材 用“雙提法”在常壓95-98°C下加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10、6、6倍，提 取時(shí)間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成相對(duì)密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當(dāng)于原處方藥材0.4g)。揮發(fā)油另器保存。測(cè)定指標(biāo)成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標(biāo)成分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)的單位 和量綱不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時(shí)考慮各指標(biāo)在提取中的主 次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出提取液的綜合評(píng)判參數(shù)Y值。結(jié)果見(jiàn)表4。干浸膏量的測(cè)定，按照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測(cè)定法。實(shí)施例3取300g當(dāng)歸(過(guò)20目篩)、300g苦參(過(guò)20目篩)，麥麩20g及氧化鈣6g，攪拌 均勻，加入40g(即40ml)水潤(rùn)濕藥材，充分?jǐn)噭蚝蟮乃幜涎b入發(fā)酵培養(yǎng)袋，密封。將發(fā)酵培 養(yǎng)袋放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間， 時(shí)間2h。放涼后取出培養(yǎng)袋。接種雞腿菇，接種量為1. 0襯％:取雞腿菇母種試管，接種針在 試管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標(biāo)簽的培養(yǎng)袋中，
10迅速密封放好。然后將培養(yǎng)袋放入29°C恒溫箱中培養(yǎng)25天。將固體發(fā)酵以后的藥材用“雙 提法”在常壓90-93°C下加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提 取時(shí)間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成相對(duì)密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當(dāng)于原處方藥材0. 4g)。揮發(fā)油另器保存。測(cè)定指標(biāo)成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標(biāo)成分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)的單位 和量綱不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時(shí)考慮各指標(biāo)在提取中的主 次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出提取液的綜合評(píng)判參數(shù)Y值。結(jié)果見(jiàn)表4。干浸膏量的測(cè)定，按照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測(cè)定法。實(shí)施例4 (根據(jù)權(quán)利要求補(bǔ)充麥麩為0的情況，請(qǐng)補(bǔ)充檢測(cè)數(shù)據(jù))取200g當(dāng)歸(過(guò)20目篩)、200g苦參(過(guò)20目篩)及氧化鈣lg，攪拌均勻，加 入20g(即20ml)的水潤(rùn)濕藥材，充分?jǐn)噭蚝蟮乃幉难b入發(fā)酵培養(yǎng)袋，密封。將發(fā)酵培養(yǎng)袋 放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，使滅菌壓力升至0. IMPa，保持壓力在0. 1-0. 15MPa之間，時(shí)間 1.5h。放涼后取出培養(yǎng)袋。接種雞腿菇，接種量為0. 取雞腿菇母種試管，接種針在試 管口放涼片刻，然后將母種表面老化的菌種部分除去，取一部分放入貼標(biāo)簽的培養(yǎng)袋中，迅 速密封放好。然后將培養(yǎng)袋放入27°C恒溫箱中培養(yǎng)31天。將固體發(fā)酵以后的藥材用“雙 提法”在常壓下90-92°C加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提 取時(shí)間依次為2h、0. 5h、0. 5h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成相對(duì)密度為1. 30 1. 35 (200C ) 的清膏(每ImL樣品液相當(dāng)于原處方藥材0.4g)。揮發(fā)油另器保存。測(cè)定指標(biāo)成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、干浸膏得率、HPLC總面積、分子量 ^ 1000的提取物量)含量。將各指標(biāo)成分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)的單位 和量綱不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影響。同時(shí)考慮各指標(biāo)在提取中的主 次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出提取液的綜合評(píng)判參數(shù)Y值。結(jié)果見(jiàn)表4。干浸膏量的測(cè)定，按照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄X · A浸出物測(cè)定法。比較例1當(dāng)歸200g、苦參200g粉碎成粗粉(20目)，混勻，用“雙提法”在常壓95_98°C下 加熱回流提取3次，加水量分別為藥材重量的10倍、6倍、6倍，提取時(shí)間依次為2h、0. 5h、 0.5h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮成相對(duì)密度為1.30 1.35(20°C)的清膏(每ImL樣品液 相當(dāng)于原處方藥材0.4g)。揮發(fā)油另器保存。測(cè)定指標(biāo)成分(阿魏酸、苦參堿、苦參總堿、 干浸膏得率、HPLC總面積、分子量< 1000的提取物量)含量。將各指標(biāo)成分所得數(shù)據(jù)進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)的單位和量綱不同，以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影 響。同時(shí)考慮各指標(biāo)在提取中的主次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，計(jì)算出提取液的綜合評(píng)判參數(shù) Y值。結(jié)果見(jiàn)表4。表4實(shí)施例1-4及比較例1提取液中各指標(biāo)成分的含量測(cè)定值及標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果
11 注1· Y =[(阿魏酸+苦參堿+苦參總堿)+3] X5+(干浸膏+HPLC總面 積)+2]X3+1000D 提取物 X2。2.括號(hào)內(nèi)的數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)化處理的結(jié)果；*P < 0. 05，< 0. 01。本實(shí)驗(yàn)加權(quán)系數(shù)的確定是按照各指標(biāo)在提取工藝選擇中的主次地位，給予不同的 加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化后的值加權(quán)后求和，即得綜合評(píng)價(jià)值。因?yàn)閱误w成分、有效部位、HPLC 總峰面積、1000D提取物得率的各真值相差較大，單體成分可能僅僅為HPLC總峰面積或者 1000D提取物得率的百分之一或千分之一。假若采用將各個(gè)指標(biāo)的真值“以同等對(duì)待進(jìn)行 加合作為綜合評(píng)分指標(biāo)”，則HPLC總峰面積或者1000D提取物得率等真值較大的指標(biāo)數(shù)值 稍有變化，往往就會(huì)掩蓋單體成分、有效部位等真值較小指標(biāo)的數(shù)值。而且單體成分、有效 部位等真值較小的指標(biāo)，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂中具有重要作用。因此，在該提取工藝選擇中單 體成分、有效部位等真值較小的指標(biāo)占主要地位，給予的加權(quán)系數(shù)大。本實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)綜合 評(píng)判Y值的關(guān)系式為Y =[(阿魏酸+苦參堿+苦參總堿)+3] X 5+(干浸膏+HPLC總面 積)+2]X3+1000D 提取物 X2。在多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，通常采用“綜合評(píng)分法”或“綜合平衡法”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本實(shí) 驗(yàn)對(duì)各單個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，求得數(shù)據(jù)的相對(duì)值，再對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值作加權(quán)求 和處理，得到一個(gè)綜合評(píng)判Y值。這樣做可以消除各指標(biāo)之間的單位和量綱的不同，以及指 標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的“拉平效應(yīng)”影響，提高了組間綜合評(píng)判數(shù)據(jù)的相關(guān)性和可比 性，更科學(xué)、合理。根據(jù)表4的結(jié)果，可以看出，綜合評(píng)價(jià)Y值的順序?yàn)閅發(fā)酵> Y未發(fā)酵，表明當(dāng)歸
12苦參丸方藥經(jīng)固體發(fā)酵后有利于藥物成分的提取。實(shí)驗(yàn)部分取實(shí)施例1和比較例1的提取液做如下實(shí)驗(yàn)1、實(shí)施例1和比較例1的提取液的主要藥效比較1. 1煤焦油致兔耳角化模型實(shí)驗(yàn)用煤焦油外涂于雄性白色家兔(體重1.5 2. 5kg)右耳管開(kāi)口處，左耳涂以橄欖 油，1次.(T1,連續(xù)14d，造成兔耳實(shí)驗(yàn)痤瘡動(dòng)物模型。雄性白色家兔24只隨機(jī)均分4組，即 模型組(只造模不給藥)，陽(yáng)性藥組(維胺脂膠囊)，實(shí)施例1發(fā)酵藥材提取液組和比較例 1未發(fā)酵藥材水提取液組。灌胃給藥，(XSg^mLil次*(1-1，連續(xù)14d。用肉眼觀察耳根厚 度，有無(wú)粉刺，進(jìn)行評(píng)分無(wú)粉刺(0)；毛囊漏斗部見(jiàn)少量致密角化物(+)；毛囊漏斗部見(jiàn)中 等量致密角化物，并向皮脂腺延伸(++)；擴(kuò)張的毛囊內(nèi)有廣泛的角化物質(zhì)，與人類(lèi)的開(kāi)放 性粉刺相似(+++)。組織學(xué)觀察(角化過(guò)度，表皮和毛囊上皮的顆粒層增厚，棘層肥厚；相 鄰擴(kuò)張的毛囊互相融合，毛囊口及漏斗部都充滿(mǎn)角化物質(zhì)，并向皮脂腺延伸；毛囊口角栓堵 塞，毛囊漏斗部充滿(mǎn)角化物質(zhì)并擴(kuò)大呈壺狀；真皮上層毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，毛囊周?chē)鷱浡?在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以小圓形細(xì)胞為主，還有少量中性粒細(xì)胞)HE染色光鏡檢查，4組實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見(jiàn)附圖2A、附圖2B、附圖2C和附圖2D。生理鹽水組，病變無(wú)明顯改善，表皮層仍增厚，毛囊 有大量角化物(圖2A)；陽(yáng)性藥組表皮層變薄，毛囊角化物少且疏松或無(wú)角化物(圖2B)；發(fā) 酵藥材提取液組表皮變薄，毛囊無(wú)角化物(圖2C)；未發(fā)酵藥材水提取液組表皮層也變薄， 毛囊有中等量角化物且較疏松(圖2D)。結(jié)果表明發(fā)酵藥材提取液組可顯著減輕兔皮膚毛 囊皮脂腺導(dǎo)管的過(guò)度角化和表皮角質(zhì)層的增厚。1. 2抗炎試驗(yàn)①對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響將40只大鼠(180_220g)隨機(jī)分為4組 (對(duì)照組、地塞米松組、實(shí)施例1發(fā)酵藥材提取液組，比較例1未發(fā)酵藥材水提取液組)，除 對(duì)照組灌胃給與飲用水Irnl · IOOg-1外，其他各給藥組灌胃給與相應(yīng)藥物Iml · lOOg—1體重， 1次· cf1，連續(xù)5d。末次給藥后lh，在大鼠右后腳足跖部皮內(nèi)注射角叉菜膠0. 1ml，于 致炎后lh，2h，3h，4h，5h，6h用軟皮尺測(cè)量足跖周長(zhǎng)，并測(cè)量左腳相應(yīng)部位的周長(zhǎng)。計(jì)算腫 脹率，并與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，見(jiàn)表5。發(fā)酵提取液組、未發(fā)酵提取液組與對(duì)照組比較，對(duì)角 叉菜膠所致大鼠足腫脹均具有顯著的抑制作用(P <0.01，P <0.05)，發(fā)酵提取液組抗炎 作用明顯強(qiáng)于未發(fā)酵提取液組(P < 0. 05)。表5 2種方法提取液對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹的影響 與對(duì)照組比較*P< 0. 05**P < 0. 01②對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響將40只小鼠(18_22g)隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、地塞米松組、實(shí)施例1發(fā)酵藥材提取液組，比較例1未發(fā)酵藥材水提取液組)，除對(duì)照組 灌胃給與飲用水Iml · IOOg-1外，其他各給藥組灌胃給與相應(yīng)藥物Iml · lOOg—1，1次· cf1， 連續(xù)5d。末次給藥后lh，在小鼠右耳部皮內(nèi)外側(cè)均勻涂予二甲苯溶液，于致炎后lh，取左 右兩耳相應(yīng)部位的耳片，精確稱(chēng)重。計(jì)算腫脹率，并與對(duì)照組進(jìn)行t檢驗(yàn)，見(jiàn)表6。結(jié)果表 明，發(fā)酵提取液組、未發(fā)酵提取液組與對(duì)照組比較，對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有顯著的 抑制作用，其腫脹抑制率分別為18. 27%和12. 97% (P < 0. 01，P < 0. 05)，發(fā)酵提取液組 抗炎作用明顯強(qiáng)于未發(fā)酵提取液組(P < 0. 05)。提示藥材發(fā)酵后抗炎作用明顯增強(qiáng)。表6 2種方法提取液對(duì)小鼠二甲苯性耳腫脹的影響 ③對(duì)棉球肉芽腫的影響將40只大鼠(180_220g)隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、地塞米 松組、實(shí)施例1發(fā)酵藥材提取液組，比較例1未發(fā)酵藥材水提取液組)，除對(duì)照組灌胃給予飲 用水Iml · IOOg"1外，其他各給藥組灌胃給與相應(yīng)藥物Iml · lOOg—1，1次· cf1，連續(xù)5d。造模動(dòng)物用水合氯醛(SSOmg^kg-1)麻醉，于腹部正中作一開(kāi)口，用止血鉗剝離皮 膚至腹股溝處，將預(yù)先高壓滅菌并加入慶大霉素0. Iml的50mg棉球植入腹股溝處，縫合皮 膚，待動(dòng)物清醒后開(kāi)始給藥。取材末次給藥后lh，斷椎處死大鼠，打開(kāi)腹部皮膚，仔細(xì)剝離棉球，置于電子天 平上稱(chēng)重，即為棉球濕重，將棉球置于110°c烘箱中，干燥48h，取出稱(chēng)量即為干重。分別用 棉球濕重、干重減去棉球重作為肉芽多少的指標(biāo)，各組計(jì)算均值和SD，并與對(duì)照組進(jìn)行t檢 驗(yàn)，見(jiàn)表7。結(jié)果表明，發(fā)酵提取液組、未發(fā)酵提取液組的抑制率分別為20. 34%、7. 91% (P <0.01, P <0. 05)，發(fā)酵提取液組能顯著抑制小鼠棉球肉芽增生腫脹，抗炎作用明顯強(qiáng)于 未發(fā)酵提取液組(P < 0.01)，提示具有明顯的抗腫消炎作用。表7 2種方法提取液對(duì)棉球肉芽腫的影響 與對(duì)照組比較*P < 0. 05**P < 0. 01通過(guò)觀察發(fā)酵前后兩種提取液對(duì)角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹、對(duì)二甲苯所致小鼠 耳廓腫脹、對(duì)小鼠棉球肉芽腫等實(shí)驗(yàn)性炎癥的影響，證實(shí)了發(fā)酵后提取液具有顯著的抗炎 和改善機(jī)體炎性反應(yīng)的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，藥材發(fā)酵后提取不僅可以抑制毛細(xì)管擴(kuò)張、通 透性增加、滲出性水腫為主的炎癥早期反應(yīng)，而且對(duì)炎癥后期肉芽組織的增生也具有抑制 作用。2.實(shí)施例1和比較例1的提取液的急性毒性實(shí)驗(yàn)方法將30只體重20士2g小鼠，隨機(jī)分成3組(比較例1、實(shí)施例1、空白)，每組 10只，實(shí)驗(yàn)前12h禁食不禁水，第二日于8:00、12:00，16:00時(shí)，將實(shí)施例1、比較例1的方 藥提取液(質(zhì)量濃度為0. 75g · mL-1)分別灌胃給藥，每只0. SmL 次_1，對(duì)照組灌胃等容量 蒸餾水，連續(xù)觀察7天，小鼠體重、行為活動(dòng)無(wú)異常變化，無(wú)1例死亡。表明該方藥經(jīng)固體發(fā) 酵后的水提取液尚未發(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)。結(jié)論為考察該方藥經(jīng)固體發(fā)酵后的安全性，對(duì)方藥發(fā)酵前后的水提取液作小鼠 急性毒性實(shí)驗(yàn)，一天的最大給藥量(gog+g-1)相當(dāng)于成人(60kg)每天用藥量(0. 3g .kg-1) 的300倍，在觀察期內(nèi)，小鼠的體重及行為活動(dòng)無(wú)異常變化，無(wú)1例死亡。表明該方藥經(jīng)固 體發(fā)酵后與發(fā)酵前一樣，均未顯示有毒性反應(yīng)，在規(guī)定劑量范圍內(nèi)使用安全。盡管發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì) 于本領(lǐng)域一個(gè)熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例作出修改和/或變通或者采用等同的替 代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)用于對(duì)本發(fā)明技術(shù) 方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
一種當(dāng)歸苦參提取工藝，其特征在于，所述的提取工藝包括下述步驟(1)固體發(fā)酵處理按重量份稱(chēng)取當(dāng)歸和苦參400 600份、麥麩0 20份，氧化鈣1 6份及水20 40份，混勻，混合物經(jīng)滅菌處理后接種雞腿菇，然后于溫度25 29℃下發(fā)酵培養(yǎng)25 31天，(2)水提取處理步驟(1)得到的發(fā)酵產(chǎn)物加入其重量6 10倍的水，煎提處理得到提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的當(dāng)歸和苦參按重 量比1 1配料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的當(dāng)歸和苦參的粒 度要求為可通過(guò)20目篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的雞腿菇的接種量 為0. 5-1. Owt%，以當(dāng)歸和苦參重量計(jì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(1)中的滅菌處理為壓 力 0. 1-0. 15MPa、時(shí)間 1-2 小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中的煎提處理做3次 以上，煎煮時(shí)間共需3小時(shí)以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取工藝，其特征在于，所述的步驟(2)中的煎提處理的溫度 為 90-100°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，公開(kāi)一種當(dāng)歸苦參提取工藝，所述的提取工藝包括將按比例配備的當(dāng)歸苦參依次經(jīng)過(guò)(1)固體發(fā)酵處理和(2)水提取處理，其中固體發(fā)酵處理選用雞腿菇作為發(fā)酵菌種。本發(fā)明得到的當(dāng)歸苦參提取物，與普通水提取處理得到的提取物相比，具有抗炎作用更強(qiáng)的特點(diǎn)，并通過(guò)了毒理驗(yàn)證，安全可靠。
文檔編號(hào)A61K36/489GK101912439SQ20101030140
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者孫秀梅, 張超, 王英姿, 韓春超 申請(qǐng)人:王英姿