專利名稱：長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法。
鸚鵡幼雛病(又稱長尾小鸚鵡幼雛病毒病)是由長尾小鸚鵡幼雛病毒引起的一種高死亡率的急性傳染病，鸚鵡類鳥多易感。自90年代以來，在世界多個地區(qū)廣泛流行，嚴(yán)重地阻礙著鸚鵡養(yǎng)殖業(yè)及各種類籠養(yǎng)鳥的向前發(fā)展。湖北省云夢縣是全國最大的籠養(yǎng)鳥基地之一，94-96年間發(fā)生了前所未有的大規(guī)模鸚鵡幼雛死亡，死亡率超過80％；迅速波及其他鸚鵡養(yǎng)殖區(qū)及外省區(qū)域，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
迄今，國內(nèi)外尚無對鸚鵡幼雛病采用疫苗防治的相關(guān)研究報道。目前“查新”中未見有相關(guān)鸚鵡幼雛病疫苗的資料。近幾年來德國、美國進(jìn)行了鸚鵡幼雛病毒分子結(jié)構(gòu)的研究，對疫苗的開發(fā)具有潛在的意義。德國墨尼黑大學(xué)Müiller教授、美國的禽病學(xué)家在研究中發(fā)現(xiàn)BFDV-DNA對甲醛具有穩(wěn)定性，對Ethylenimine(乙烯亞胺)敏感，而該試劑具有較強(qiáng)的致癌性；而且燃點(diǎn)為42℃，極不安全。
本發(fā)明的目的是提供一種長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的制備方法，采用長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，用組織細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，疫苗接種后可有效地預(yù)防長尾小鸚鵡幼雛病毒病。對鸚鵡的免疫保護(hù)率達(dá)到99．76％左右。
本發(fā)明所涉及長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，是由強(qiáng)毒型的長尾小鸚鵡幼雛病毒(Budgerigar Fledgling Disease Virus，BFDV)采用連續(xù)鸚鵡胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)接到雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)接30代以上得到的弱毒株，該弱毒株特有的重要生物活性是已喪失對其原宿主動物(鸚鵡)的致病力，保留了良好的免疫原性。長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，已于1999年12月8日交送保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC NOV99006。
鸚鵡幼雛病毒弱毒株病毒的主要生物學(xué)特性鸚鵡幼雛病毒呈二十面體對稱球形顆粒，直徑約45-50納米，無囊膜，核酸是DNA類型；此病毒對熱、凍融和氯仿、乙醇、甲醛、乙醚等化學(xué)試劑具有穩(wěn)定性；接種在雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)可引起細(xì)胞病變，細(xì)胞體腫脹變圓、細(xì)胞核腫大并出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象。對其原宿主動物(鸚鵡)的無致病力，有良好的免疫原性。
制備長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗的技術(shù)方案是將長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒按5％～10％接種于雞胚成纖維細(xì)胞，在37℃～39．5℃培養(yǎng)，收集48-72小時產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒液，采用0．9％ N．S作為稀釋液，按1∶10的比例稀釋，得到長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，可有效的預(yù)防鸚鵡幼雛病毒病的發(fā)生。該弱毒疫苗對鸚鵡的免疫保護(hù)率99．62-100％，平均為99．76％，對鸚鵡的的免疫保護(hù)期不低于8個月；該疫苗在低溫條件下有較長的保存期。
2．取長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒按5％接種雞胚成纖維細(xì)胞(單層)，置38℃培養(yǎng)(37～39℃均可)；24小時細(xì)胞出現(xiàn)病變，見細(xì)胞體腫脹變圓、細(xì)胞核腫大并出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象；收集48-72小時的病毒液(在此時間范圍內(nèi)選擇細(xì)胞病變明顯的收集)。
3．采用免疫瓊脂擴(kuò)散法檢測病毒液效價，以出現(xiàn)明顯免疫沉淀線為陽性。
4．按1∶10比例稀釋病毒液，即1∶0．9％N．S。
5．疫苗雜菌檢驗，合格后分裝冷藏。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)免疫保護(hù)性強(qiáng)采用鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，0．2ml／只，接種鸚鵡，對照組用鸚鵡幼雛病毒野毒接種；將接種疫苗的鸚鵡在第14天攻毒(野毒)，觀察20～100天，接種疫苗的鸚鵡表現(xiàn)有較強(qiáng)的保護(hù)性，免受鸚鵡幼雛病毒野的侵襲；而接種鸚鵡幼雛病毒野毒的鸚鵡則無保護(hù)；疫苗對鸚鵡的免疫保護(hù)率為99．76％。結(jié)果見表一表一鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗免疫保護(hù)率檢測結(jié)果
結(jié)果表明鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗對鸚鵡的保護(hù)率為99．76％。
(2)安全性好采用健康鸚鵡15日齡以下幼雛，接種鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗0．2ml／只，飼養(yǎng)觀察100天。結(jié)果見表二表二鸚鵡幼雛病毒不同代弱毒株安全性試驗結(jié)果鸚鵡幼雛病毒弱毒株 只死亡 存活安全率％25代 125 8 117 93．630代 117 3 114 97．435代 156 1 155 99．040代 121 1 120 99．0*平均安全率為97．25％。
(3)免疫血清抗體測試采用長尾鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗接種15齡以下雛鸚鵡，分別在免疫后10、15、25、40、60、100天取血檢測，采用免疫瓊脂擴(kuò)散法，血清稀釋按1∶100比例稀釋。結(jié)果見表三表三 鸚鵡幼雛病毒弱毒免疫血清抗體檢測結(jié)果天數(shù) 只免疫沉淀線1057 +-++1538 ++2535 ++4030 +-++6028 +100 46 +*鸚鵡幼雛病毒弱毒免疫血清抗體出現(xiàn)高峰在第10天-25天；其維持時間較長。
(4)疫苗保存期長4批疫苗(批號980906、981020、990115、990327)在-10～4℃可保存10個月左右。
(5)預(yù)防效果好用鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗(批號980906、981020、990115、990327)先后在湖北省云夢、孝感、應(yīng)城三個地區(qū)，5個鸚鵡養(yǎng)殖場、10余家養(yǎng)殖戶使用。免疫免疫雛、青年和成年鸚鵡5260余對，接種后臨床觀察2-6個月，安全，免疫效果良好。
(6)采用本法明制備鸚鵡幼雛病毒弱毒疫苗，生產(chǎn)工藝簡便，成本低。
權(quán)利要求
1．一種長尾小鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法，其特征是A．采用長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒株，保藏編號CCTCC NOV99006，制備雞胚成纖維細(xì)胞，采用9-10日齡雞胚，在無菌條件下取出胚體，勻漿，加入PH7．5的5％的胰蛋白酶消化液，混勻，置37℃水浴消化，取出離心棄消化液，裝在細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加10％小牛血清，組織培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)16-18小時的細(xì)胞形成單層；B．取長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒5％接種雞胚成纖維細(xì)胞，置38℃培養(yǎng)，24小時出現(xiàn)細(xì)胞病變；C．收集培養(yǎng)48-72小時有細(xì)胞病變的病毒液；D．免疫瓊脂擴(kuò)散法檢測其效價為陽性，按1∶10比例稀釋；E．雜菌檢驗合格后分裝冷藏。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防鸚鵡幼雛病毒病弱毒疫苗的制備方法。其步驟是:將長尾小鸚鵡幼雛病毒弱毒液5～10%接種于雞胚成纖維細(xì)胞;在37℃～39.5℃培養(yǎng)溫度,收集48—72小時產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒液;采用0.9%N.S作為稀釋液,按1∶10的比例稀釋;進(jìn)行雜菌檢驗,合格后分裝冷藏。疫苗對鸚鵡的免疫保護(hù)性強(qiáng),保護(hù)率99.62—100%、安全性好、保存期長、生產(chǎn)工藝簡便,成本低;可有效的預(yù)防鸚鵡幼雛病毒病。
文檔編號A61K39/12GK1289621SQ00114489
公開日2001年4月4日 申請日期2000年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月17日
發(fā)明者李天憲, 陳繩亮, 馮峰, 夏韋, 趙林 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所