專利名稱：含氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠的制備方法及其在制備術后疤痕抑制劑上的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠的制備方法及其在制備術后疤痕抑制劑上的應用，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
青光眼是一種能夠導致失明的眼科疾病，其臨床癥狀為眼壓過高壓迫視盤和損傷視神經(jīng)。目前濾過手術是一種治療青光眼的常用方法，但術后傷口過度愈合反應形成的瘢痕組織往往導致青光眼濾過手術的失效。術后瘢痕形成的主要原因是術后炎癥反應和結膜下組織纖維化。在臨床上，為了有效抑制術后炎癥反應以及結膜下組織纖維化，術后一到兩周內抗增生藥物水劑需要多次注射到患者眼內。多次藥物注射不僅會給患者帶來一定病痛，而且容易引起眼部組織的毒副作用。如多次注射抗增生藥物5-氟尿嘧啶水劑往往引起結膜和角膜上皮細胞的毒性反應、傷口組織液滲漏等癥狀。因此，研究和開發(fā)出具有抑制術后炎癥反應和組織纖維化作用的新型制劑是眼科學研究者的當務之急。核心蛋白多糖(Decorin)是由一個富含亮氨酸殘基的核心蛋白和一條氨基葡萄糖多聚糖鏈組成。諸多研究表明，在腎、肌肉、肺以及眼睛等器官的手術后使用Decorin可以有效抑制傷口的炎癥反應和組織纖維化，其作用的主要機理是抑制瘢痕形成中起著重要作用的轉化生長因子P (TGF-P)的活性。TGF-P廣泛分布在血小板以及巨噬細胞等表面， 其受體存在于所有細胞上。TGF-P的主要生物學效應是調控細胞增殖和結締組織合成、刺激間質細胞增生、促進成纖維細胞和平滑肌細胞等合成分泌膠原蛋白及纖維連接蛋白和抑制基質降解酶的產(chǎn)生并促進基質沉積。但核心蛋白多糖人工合成非常困難，而且目前使用的方法多為水劑注射法，造成成本增加。在多肽分子結構中引入氨基葡萄糖單元可以得到與核心蛋白多糖結構類似的糖肽。由于多肽及其衍生物具有良好的自組裝性能，通過上述糖肽自組裝有望于得到具有抑制傷口組織瘢痕化作用的凝膠態(tài)制劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明首先所要解決的技術問題是提供一種含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠的制備方法。其制備方法是(I)利用固相合成技術制備含疏水性端基的三肽，然后純化；所述三肽結構的氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，疏水性端基為N-芴-9-甲氧羰基、萘乙?；蜍哦□；?；(2)將純化的三肽與氨基葡萄糖縮合得到糖肽，然后純化；(3)將糖肽分散在磷酸鹽緩沖溶液中，通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽凝膠。上述方案中，固相合成技術所采用的樹脂為2-氯-3-苯甲基氯樹脂，肽鏈的延長為碳端到氮端。上述方案中，合成糖肽的縮合劑為N，N_ 二環(huán)己基碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺。上述方案中，含疏水性端基的三肽和糖肽可以采用將粗產(chǎn)品用少量良溶劑溶解， 然后在大量不良溶劑中沉淀的方法純化。所述的良溶劑可為三氟乙酸、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等。所述的不良溶劑可選擇乙醚、石油醚等。上述方案中，磷酸緩沖溶液的pH為7. 4。通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽凝膠時，可以首先升高溶液溫度至80度使糖肽完全溶解，隨后在室溫下緩慢冷卻。本發(fā)明其次所要解決的技術問題在于提供上述制備的含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠制備術后疤痕抑制劑上的應用。多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質，是介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物，由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。通過分子間氫鍵作用、疏水性作用和堆積作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液自組裝形成具有納米纖維微觀結構的水凝膠。由于在制備過程無需加入化學交聯(lián)劑，高含水量的多肽凝膠可以被直接注射到靶向位點，因此廣泛應用于組織工程、藥物控釋等領域。本發(fā)明在多肽分子結構中引入氨基葡萄糖單元，得到與核心蛋白多糖結構類似的糖肽。由于多肽及其衍生物具有良好的自組裝性能，上述糖肽自組裝得到具有抑制術后組織瘢痕化作用的凝膠態(tài)制劑。使用這種新型糖肽凝膠制劑將具有以下兩個優(yōu)點。一、通過注射法很容易將凝膠置于手術位點。二、由于固定在凝膠內部氨基葡萄糖不會在傷口區(qū)域擴散，因此應用時只需一次性注射，這就簡化治療過程并能夠節(jié)約成本。


圖I.含氨基葡萄糖單元的糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine結構式。圖2. NIH/3T3成纖維細胞在糖肽水凝膠表面培養(yǎng)48小時后細胞形態(tài)。圖3.只進行濾過手術后兔眼的濾過泡(濾過手術組)和術后注射糖肽凝膠的兔眼濾過泡(凝膠組)生存時間曲線。圖4.只進行濾過手術后兔眼(濾過手術組)和術后注射糖肽凝膠的兔眼(凝膠組)眼內壓。圖5.只進行濾過手術14天后兔眼的組織學切片HE染色圖。圖6.濾過手術后注射糖肽凝膠7天后兔眼的組織學切片HE染色圖。圖7.濾過手術后注射糖肽凝膠14天后兔眼的組織學切片HE染色圖。圖8.濾過手術后注射糖肽凝膠21天后兔眼的組織學切片HE染色圖。圖9.只進行濾過手術14天后兔眼的組織學切片Masson三色染色圖。圖10.濾過手術后注射糖肽凝膠7天后兔眼的組織學切片Masson三色染色圖。圖11.濾過手術后注射糖肽凝膠14天后兔眼的組織學切片Masson三色染色圖。圖12.濾過手術后注射糖肽凝膠21天后兔眼的組織學切片Masson三色染色圖。圖13.含氨基葡萄糖單元的糖肽Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine結構式。圖14.含氨基葡萄糖單元的糖肽Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine結構式。
具體實施例方式實施例I(I)含疏水性N-芴-9-甲氧羰基的三肽FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制備以2-氯-三苯甲基氯樹脂(樹脂上有效氯的取代度為1.32mm0l/g)為固相載體，使用多肽固相自動合成儀制備短肽FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu)-0H。肽鏈在樹脂上從碳端向氮端延長。具體的合成步驟如下稱取I. 5g 2-氯-三苯甲基氯樹脂(有效氯含量為I. 5 X I. 32 = I. 98mmol)，分別用IOmL 二氯甲烷(CH2Cl2)和N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)洗滌3次，然后用IOmL DMF浸泡樹脂30分鐘。抽去DMF，加入溶有 FMOC-Asp (OtBu) -OH(3X1. 98mmol)和二異丙基乙胺(DiEA, 4X I. 98mmol)的 DMF 溶液到樹脂中，于室溫下振蕩反應30分鐘。抽去反應液，用DMF洗滌樹脂3次后加入IOmL體積比為2 8的哌啶和DMF混合液到樹脂中，于室溫下振蕩反應20分鐘，脫去FMOC保護基。抽去反應液，用IOmL DMF洗滌樹脂3次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2X1. 98mmol)、 DiEA(3X1.98mmol)、并三氮唑-N，N，N，N，-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU，2. 4X I. 98mmol) 及I-羥基苯并三氮唑(H0Bt，2. 4X1.98mmol)的DMF溶液到樹脂中，于室溫下振蕩反應I. 5 小時。抽走DMF，用IOmL DMF洗滌樹脂3次后，重復上述脫保護和縮合的步驟。待肽鏈合成結束后，分別用IOmL DMF和CH2Cl2洗滌樹脂3次，室溫下干燥樹脂。加入20mL切落劑(體積比為I : 2 7的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)將產(chǎn)品從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。(2)含氨基葡萄糖單元的糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成將上述合成的三妝FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu)-OH(Immol)、N, N' - 二環(huán)己基碳酸亞胺(DCC，I. 2mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，I. 2mmol)溶于20mL無水四氫呋喃中， 于冰浴下攪拌反應4小時。抽濾除去沉淀，加入4mL溶有氨基葡萄糖鹽酸鹽(3mmol)和 NaHC03(6mmol)的水溶液到濾液中，于室溫下攪拌反應24小時。濃縮除去溶劑，加入15mL 體積比為3 7的三氟乙酸和CH2Cl2-合溶液，室溫下攪拌反應I小時。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。用高效液相色譜(HPLC)純化糖肽(HPLC分離柱為C18柱，用含0. Iwt%氨水的乙腈和含0. Iwt%氨水的去離子水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結構式見附圖I。(3)糖肽凝膠的制備將糖肽分散在磷酸緩沖溶液(PBS)中，加熱至80°C讓其溶解形成澄清溶液(濃度為9mg/mL)。緩慢降低溶液溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠。(4)糖肽凝膠的生物安全性評價將上述糖肽凝膠轉移至24孔細胞培養(yǎng)板中用紫外光照射除菌。將含有NIH/3T3 成纖維細胞的DMEM培養(yǎng)液加入到糖肽凝膠的表面。待細胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)一段時間后，分別加入溴乙啡錠二聚體(EthD-I)和鈣黃綠素(calcein AM)到糖肽凝膠表面進行細胞死活染色。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間后，用激光共聚焦顯微鏡觀測凝膠表面的細胞形態(tài)。檢測結果表明絕大部分NIH/3T3成纖維細胞可以粘附在糖肽凝膠表面，細胞存活率約為87%，具體的細胞形態(tài)見附圖2。(5)兔眼濾過手術濾過手術前首先對糖肽凝膠做消毒處理。具體方法如下使用濾膜將糖肽溶液過濾除菌，然后再將凝膠置于紫外光下照射除菌。濾過手術在兔子的右眼進行，左眼作為參照。在濾過手術中，向深層肌肉注射氯胺酮和甲苯噻嗪對兔子做全身麻醉，使用地卡因對兔子右眼做局部麻醉。12只成年白兔平均分為兩組第一組兔眼只進行濾過手術，第二組兔眼在濾過手術中注射糖肽凝膠。具體的濾過手術操作如下在共軸照明立體顯微鏡下，用眼瞼擴張器暴露眼球，做以角膜緣為基底的結膜瓣，分離結膜下組織并暴露鞏膜。結膜瓣下做厚為1/2、大小為4X4mm的鞏膜瓣，其基底至透明角膜內1_。隨后，在鞏膜瓣下沿角膜緣切穿至前房， 切除1X3_大小的角鞏膜組織。做虹膜周切后，用10-0型尼龍線縫合鞏膜瓣兩角至鞏膜床。隨后縫合結膜瓣，在縫合最后一針前，將糖肽凝膠注射到第二組兔眼的結膜下。最后在兩組兔眼上均勻涂抹四環(huán)素眼膏。(6)臨床觀察用裂隙燈顯微鏡觀察兔眼術后濾過泡形態(tài)及生存時間，使用生存分析軟件分析濾過泡的生存時間。用Log-rank檢驗分析兩組兔眼中濾過泡的生存時間差異，并對結果作 Kaplan-Meier生存曲線。使用Tono-pen型眼壓計測量兔眼眼壓，測量時使用地卡因對兔子右眼做局部麻醉。對手術眼和對照眼的實驗結果進行統(tǒng)計學分析，Student’ s T檢驗用于分析眼壓結果，P < 0. 05有統(tǒng)計學意義。兔眼術后濾過泡生存時間以及眼內壓結果分別見附圖3和4。臨床觀察結果表明相對于只進行濾過手術組，術后注射糖肽凝膠可以顯著延長濾過泡的生存時間(可以延遲至術后21天，附圖3)和降低兔眼眼內(術后21天內均保持在較低水平，附圖4)。(7)組織學分析在濾過手術后的7 21天內，向心臟注射致死劑量的戊巴比妥處死手術兔。摘除眼球并保存在多聚甲醛溶液中進行組織固定。隨后用石蠟包埋眼組織，做成4 u m的病理切片，切片包含結膜、周邊房角及手術濾過泡區(qū)域等眼組織結構。將切片染色進行組織學分析，同時將切片Masson三色染色用于觀察組織膠原的分布沉積情況。HE染色和Masson 三色染色切片結果分別見附圖5-8和9-12。組織學分析結果表明濾過手術后注射糖肽凝膠可以顯著抑制結膜下組織成纖維細胞增生和降低傷口組織的膠原蛋白沉積，濾過泡在術后21天內依然清晰可見，而只進行濾過手術組的兔眼濾過泡則由于成纖維細胞大量增生而關閉，說明濾過手術后注射糖肽凝膠可以顯著抑制傷口組織瘢痕的形成。實施例2(I)含疏水性萘乙酰基的三肽Nap-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制備參照實例I的方法在2-氯-三苯甲基氯樹脂上延長肽鏈，待肽鏈合成結束后，加入溶有萘乙酸(2X1.98mmol)、DiEA (3 X I. 98mmol)、HBTU (2. 4X1. 98mmol)和 HOBt (2. 4X1. 98mmol)的DMF溶液到樹脂中，室溫下振蕩反應I. 5小時。抽走DMF，分別用 IOmL DMF和CH2Cl2洗滌樹脂3次，室溫下干燥樹脂。加入20mL切落劑(體積比為I : 2 : 7 的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)將產(chǎn)品從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。(2)含氨基葡萄糖單元的糖肽Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成將上述合成的三妝Nap-Phe-Phe-Asp (OtBu)-OH(Immol)、DCC (I. 2mmol)和 NHS (I. 2mmol)溶于20mL無水四氫呋喃中，于冰浴下攪拌反應4小時。抽濾除去沉淀，加入4mL溶有氨基葡萄糖鹽酸鹽(3mmol)和NaHC03 (6mmol)的水溶液到濾液中，于室溫下攪拌反應24小時。濃縮除去溶劑，加入15mL體積比為3 7的三氟乙酸和CH2Cl2混合溶液，室溫下攪拌反應I小時。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。用高效液相色譜(HPLC)純化糖肽(HPLC分離柱為C18柱，用含0. 1%氨水的乙腈和含0. I %氨水的去離子水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結構式見附圖13。(3)糖肽凝膠的制備將糖肽分散在磷酸緩沖溶液(PBS)中，加熱至80°C讓其溶解形成澄清溶液(濃度為10mg/mL)。緩慢降低溶液溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠。與實例I中糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，實例2中的糖肽 Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine只是其一端疏水性基團改變。因此類似與實例I中的糖肽水凝膠，上述實例2中制備的自組裝糖肽水凝膠理論上也具有抑制術后傷口組織瘢痕形成的作用。實施例3(I)含疏水性芘丁酰基的三肽Py-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制備參照實例I的方法在2-氯-三苯甲基氯樹脂上延長肽鏈，待肽鏈合成結束后，加入溶有芘丁酸(2X1.98mmol)、DiEA (3 X I. 98mmol)、HBTU(2. 4X I. 98mmol)和 HOBt (2. 4X1. 98mmol)的DMF溶液到樹脂中，室溫下振蕩反應I. 5小時。抽走DMF，分別用 IOmL DMF和CH2Cl2洗滌樹脂3次，室溫下干燥樹脂。加入20mL切落劑(體積比為I : 2 : 7 的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)將產(chǎn)品從樹脂上切落，收集濾液并濃縮。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。(2)含氨基葡萄糖單元的糖肽Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成將上述合成的三妝Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine (Immol)、DCC (I. 2mmol)和 NHS (I. 2mmol)溶于20mL無水四氫呋喃中，于冰浴下攪拌反應4小時。抽濾除去沉淀，加入 4mL溶有氨基葡萄糖鹽酸鹽(3mmol)和NaHC03 (6mmol)的水溶液到濾液中，于室溫下攪拌反應24小時。濃縮除去溶劑，加入15mL體積比為3 7的三氟乙酸和CH2Cl2混合溶液，室溫下攪拌反應I小時。加入大量冷乙醚沉淀出產(chǎn)品，過濾并用乙醚多次洗滌，室溫下將產(chǎn)品干燥過夜。用高效液相色譜(HPLC)純化糖肽(HPLC分離柱為C18柱，用含0. I %氨水的乙腈和含0. I %氨水的去離子水做梯度淋洗，紫外檢測波長為254nm)，結構式見附圖14。(3)糖肽凝膠的制備將糖肽分散在磷酸緩沖溶液(PBS)中，加熱至80°C讓其溶解形成澄清溶液(濃度為6mg/mL)。緩慢降低溶液溫度至室溫時，糖肽可以自組裝形成穩(wěn)定的超分子水凝膠。與實例I中糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，實例3中的糖肽 Py-Phe-Phe-Asp- glucosamine只是其一端疏水性基團改變。因此類似與實例I中的糖肽水凝膠，上述實例3中制備的自組裝糖肽水凝膠理論上也具有抑制術后傷口組織瘢痕形成的作用。
權利要求
1.一種含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠的制備方法，其特征是，包括如下步驟1)利用固相合成技術制備含疏水性端基的三肽，然后純化；所述三肽結構的氨基酸序列為苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，疏水性端基為N-芴-9-甲氧羰基、萘乙?；蜍哦□；?；2)將純化的三肽與氨基葡萄糖縮合得到糖肽，然后純化；3)將糖肽分散在磷酸鹽緩沖溶液中，通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽凝膠。
2.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于，固相合成技術所采用的樹脂為 2-氯-3-苯甲基氯樹脂，肽鏈的延長為碳端到氮端。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，合成糖肽的縮合劑為N，N-二環(huán)己基碳二亞胺或N-羥基琥珀酰亞胺。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，含疏水性端基的三肽和糖肽采用將粗產(chǎn)品用少量良溶劑溶解，然后在大量不良溶劑中沉淀的方法純化。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的良溶劑為三氟乙酸、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷；所述的不良溶劑為乙醚或石油醚。
6.根據(jù)權利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述的磷酸緩沖溶液的pH為7. 4。
7.根據(jù)權利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，通過加熱溶解-冷卻法制備糖肽凝膠時，首先升高溶液溫度至80度使糖肽完全溶解，隨后在室溫下冷卻。
8.根據(jù)權利要求I 7所述方法制備的含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠在制備術后疤痕抑制劑上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及一種含有氨基葡萄糖單元的糖肽水凝膠的制備方法。它是通過含有氨基葡萄糖單元的糖肽在生理條件下自組裝形成的水凝膠。由于其結構中氨基葡萄糖單元可以抑制術后疤痕形成的作用，該糖肽水凝膠有望用做抑制術后疤痕形成的凝膠態(tài)制劑。使用這種新型糖肽凝膠制劑將具有以下兩個優(yōu)點。一、通過注射法很容易將凝膠置于手術位點。二、由于固定在凝膠內部氨基葡萄糖不會在傷口區(qū)域擴散，因此應用時只需一次性注射，這就簡化治療過程并能夠節(jié)約成本。
文檔編號A61K9/06GK102600067SQ20121010265
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月10日 優(yōu)先權日2012年4月10日
發(fā)明者馮俊, 卓仁禧, 姜發(fā)綱, 張先正, 梁亮, 許小丁 申請人:武漢大學