專利名稱：抗流感病毒的免疫方法及其組合疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于預防流感病毒傳播的方法，以及構(gòu)成所述方法的因素，以及尤其地涉及組合疫苗和其免疫方法。流感組合疫苗的基本思路是使用不同的流感血凝素蛋白或者其編碼基因來進行序貫(sequential)免疫，所述序貫免疫的意思是在多個疫苗免疫步驟中使用不同的流感血凝素蛋白或者其不同的編碼基因，從而得到具有高滴度且抗多種流感病毒的廣譜抗性的中和抗體。在本發(fā)明中所涉及的流感組合疫苗可以用于預防由多種亞型所引起的流感病毒感染。
背景技術(shù)：
流行性感冒(以下簡稱“流感(flu)”)是由流感病毒(以下簡稱“流感病毒(fluvirus)”)引起的急性呼吸道疾病。其通過呼吸道傳播，具有相對高的感染率，并且其中的一些可以導致嚴重的發(fā)病率和致死率。流感病毒的傳播根據(jù)其特征可以劃分為以下幾類。1.季節(jié)性流感。季節(jié)性流感是流感最常見的形式，其每年爆發(fā)，并且在秋天或者冬天所述的爆發(fā)通常大規(guī)模發(fā)生。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)所估計，每年約有6億人被感染，并且300-500萬人患有重度病癥，并且其導致25-50萬例死亡。在醫(yī)療資源豐富的發(fā)達國家，大多數(shù)死亡病例是在年老人群中發(fā)生的。在美國，據(jù)估計每年有36000人死于季節(jié)性流感，并且約90%是65歲以上的(Thompson et al.Am J Public Health.2009)。當前市場上針對季節(jié)性流感的疫苗包括用于肌肉注射的滅活病毒疫苗和裂解疫苗以及用于黏膜接種的減毒活疫苗，其都由三種不同類型的流感病毒抗原所組成，所述的流感病毒抗原即H1N1、H3N2和乙型流感。2.流感大流行。流感大流行是由于流感病毒基因重排導致的抗原轉(zhuǎn)換引起的。該流感大流行對社會具有極 大的危害，由于人很少針對基因組中如此大片段的突變產(chǎn)生免疫力。在上個世紀，有三次這樣的流感大流行爆發(fā)，并且各次的爆發(fā)導致大量的感染和死亡，并且對經(jīng)濟和社會帶來了巨大的損失。據(jù)估計，1918-1920年間暴發(fā)的“西班牙流感(Spainflu)”，歷史上最嚴重的自然災害之一，感染了約5億人(世界人口的三分之一)，并且導致4-5千萬人的死亡，這占當時世界人口的3%。隨后，于1957年和1968年發(fā)生的“亞洲流感”和“香港流感”也導致了數(shù)百萬病例死亡。隨著社會的發(fā)展，國家和地區(qū)之間的交流日益增多，并且更加便利和頻繁，這也使得流感大流行的傳播更容易。WHO認為，過去流感大流行傳播到全世界需要6-9個月，而現(xiàn)在只需要3個月。據(jù)估計，下一次流感大流行會在發(fā)達國家?guī)鞩億3千萬門診病人，200萬人入院治療以及65萬人死亡。在發(fā)展中國家，其影響會更加嚴重，甚至有數(shù)百萬人死亡。因此，該流感大流行對于全球公共健康是極大的風險。WHO和各國衛(wèi)生當局也對2009年的HlNl進行了極大的關注，由于其顯示出流感大流行的特征。3.禽流感。此感染是由突變的禽類病毒所引起的。盡管在人群中尚未觀察到爆發(fā)，但是極高的病死率給人類健康帶來了嚴重的威脅。并且，由于其野生宿主不斷遷徙，該高致病性的禽流感病毒很難得到控制，從而給全球公共健康帶來了新的挑戰(zhàn)。到2010年3月30日為止WHO報道了 492例，并且有291例死亡(數(shù)據(jù)來自www.pandemicflu.ac.cn)
各國的公共衛(wèi)生部門進行了努力來預防該危險，并且WHO建立了全球監(jiān)控網(wǎng)絡，并且希望能夠根據(jù)該監(jiān)控來進行預警。到現(xiàn)在為止，控制感染性疾病傳播的最有效方法是疫苗。尤其對于流感病毒來說，流感疫苗接種是預防和控制流感病毒傳播的最有效的手段。盡管三種類型的流感傳播對應于不同的上市疫苗，當前的疫苗僅僅保護對象免受與疫苗株相同或者相似的流感病毒感染，并且不太可能克服病毒突變，從而預防由多種流感病毒導致或者與疫苗株不同的流感病毒所導致的感染。因此，在各個流感季節(jié)，用于季節(jié)性流感病毒的候選疫苗株將要由WHO根據(jù)流行趨勢重新評估，并且疫苗株每年都要更新。所選擇的疫苗株可能和季節(jié)性傳播的病毒株不匹配，從而疫苗的效果存在風險。已報道的數(shù)據(jù)表明，流感病毒血凝素(HA)蛋白是一種保護性抗原，其通過誘導中和抗體(nAb)來保護宿主。因此，流感疫苗是對HA的含量來進行評價的，并且疫苗的效果是通過血凝素抑制抗體的滴度來評價的。如本領域技術(shù)人員所熟知的，HA是甲型流感(A-flu)中具有最多突變的蛋白。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了 16種HA的亞型，并且HA抗原之間的抗原性是不相同的。盡管保護相關的表位集中在HA中，而且現(xiàn)有的疫苗可以誘導具有高滴度的抗體，然而，具有高度免疫原性的表位不斷地變化。疫苗僅僅對于相同或者相似株的病毒株有效，并且不針對其他的株或者新的株顯示出廣泛的保護能力。從本質(zhì)上來說，當前的疫苗技術(shù)不能克服病毒株之間的突變，從而實現(xiàn)廣泛的交叉保護。還期待得到具有廣泛保護能力，并且保持對甲型流感Hl亞型的強保護作用的疫苗。2009年，HlNl流感在全世界傳播，并且導致了大量的死亡。因此針對Hl流感的保護能力對于疫苗來說是重要的因素。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，術(shù)語“共享序列”與“共有序列”可以交換地使用，并且“血凝素”與“ HA ”可以交換地使用。本發(fā)明提供了一種抗流感病毒的新型的組合疫苗及其組合方法。在本發(fā)明中，將多種不同的流感疫苗 按順序組合，從而得到新的特性，所述的新的特性不能由單個的疫苗或者所述疫苗的混合物達到。本發(fā)明的關鍵點在于使用不同的流感病毒HA抗原按照一定的順序接種，從而誘導抗大量流感病毒的中和抗體。本發(fā)明人于2009年5月25日遞交了 “抗多種艾滋病病毒的組合疫苗及其組合方法”(申請?zhí)?00910027615.2)的專利申請，其中描述了序貫接種的原理。本發(fā)明是將該技術(shù)原理應用在流感疫苗上。本發(fā)明提供了抗多種流感病毒的普遍類型的流感免疫方法，其特征在于將兩種或更多種不同的流感疫苗按照特定的順序進行接種，并且每種流感疫苗接種至少一次，并且總接種次數(shù)為兩次或更多次；其中每種流感疫苗包括一種或更多種抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因，并且進一步包括不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的編碼基因。優(yōu)選地，所述的抗原是流感病毒血凝素蛋白(HA)。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，本發(fā)明的流感疫苗可以選自:滅活疫苗、減毒疫苗、重組HA亞單位疫苗、攜帶流感病毒血凝素編碼基因的DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗或者重組酵母載體疫苗、表達血凝素的重組病毒樣顆粒疫苗，以及上述疫苗的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的HA選自甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 亞型的 HA 和乙型流感的 HA0在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的HA選自甲型流感的Hl、H3、H5亞型的HA和乙型流感的HA。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的HA選自甲型流感HA的H1、H3和H5亞型的HA。優(yōu)選地，所述的兩種或多種流感疫苗包含Hl亞型的一種或多種HA或者其編碼基因。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的流感病毒血凝素蛋白來自甲型或乙型流感病毒或者來自流感病毒的不同亞型，以及所述的亞型包括但不限于H1N1、H3N2、H5N1或者H7N7 ;或者所述的流感病毒血凝素蛋白來自一種病毒株的不同血凝素蛋白類型，例如來自同一病毒株的HAl或HA2。所述的 流感病毒血凝素蛋白可以選自HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。所述的流感病毒血凝素編碼基因可以是針對人進行密碼子優(yōu)化的。在特別指出的實施例中，所述的流感病毒血凝素蛋白選自甲型流感的Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16亞型或乙型流感的血凝素蛋白或者其組合；優(yōu)選地，甲型流感的H1、H3或H5亞型的血凝素蛋白。更優(yōu)選地，所述的流感病毒血凝素蛋白是同一亞型的共享序列或者祖先序列。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且三次免疫按順序進行，并且a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型；b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且Hl疫苗的HA是A/Texas/05/2009 (HlNl)，H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。在本發(fā)明再進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且所述的Hl疫苗是PVAX1-TE09H1,所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是pVAXl-CON H5 ；其中PVAX1-TE09H1是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且按順序進行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感病毒的Hl亞型。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且Hl疫苗的HA來自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。在本發(fā)明再進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且三種Hl疫苗是PVAX1-BR07HU pVAXl-BR07Hl 和 rvv_TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表達流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，并且rvv_TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組疫苗性病毒載體疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，按順序進行四次免疫，并且a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA來自乙型流感；b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型；c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。在本發(fā)明進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且BHA疫苗的HA來自B/Brisbane/60/2008, Hl 疫苗的 HA 來自 A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且 H3 疫苗的 HA 是 2006到2009的H3亞型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。在本發(fā)明再進一步優(yōu)選的方面，提供了免疫方法，并且所述的BHA疫苗是PVAX1-BR08BHA,所述的Hl疫苗是pVAXl_TE09Hl，所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3,以及所述的 H5 疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表達 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重組DNA疫苗，pVAXl-TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。本發(fā)明的抗流感的免疫方法可以針對禽類和哺乳類動物，優(yōu)選地針對人。在本發(fā)明的抗流感的免疫方法中，兩次接種之間的間隔是至少I周；優(yōu)選為2周或更多周，最多四周。在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于上述流感免疫方法中任一種的流感組合疫苗，其包含兩種或更多種用于序貫接種的流感疫苗，其特征在于每種流感疫苗包含一種或多種抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因，并且進一步地包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的編碼基因。所述的兩種或多種流感疫苗按照一定的順序進行接種，并且每種流感疫苗接種至少一次，并且總接種次數(shù)為兩次或更多次。優(yōu)選地，所述的抗原是流感病毒HA，或者流感病毒HA的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的兩種或更多的流感疫苗選自:滅活疫苗、減毒疫苗、重組HA亞單位疫苗、攜帶流感病毒HA編碼基因的DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗或者重組酵母載體疫苗、表達HA的重組病毒樣顆粒疫苗，或者上述疫苗的組合。任意的上述疫苗包含流感病毒HA抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因。優(yōu)選地，所述的HA 選自甲型流感的 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16亞型的HA和乙型流感的HA。 在本發(fā)明另一個優(yōu)選的方面，所述的兩種或更多種流感疫苗包含來自Hl亞型的一種或多種HA或者其編碼基因。在本發(fā)明另一個優(yōu)選的方面，所述的流感病毒HA選自HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的HA序列是相同亞型的共享序列或祖先序列。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的HA的編碼基因是針對人進行密碼子優(yōu)化的。在本發(fā)明的一個方面，按順序進行四次接種，并且a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA來自乙型流感；b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型；c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，BHA疫苗的HA來自B/Brisbane/60/2008，Hl疫苗的HA來自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。在本發(fā)明的一個方面，按順序進行三次免疫，并且a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型；b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，Hl疫苗的HA來自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的
共享序列。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，三次免疫按順序進行，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，Hl疫苗的HA來自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。在本發(fā)明優(yōu)選的方面，所述的疫苗針對哺乳動物，優(yōu)選地針對人。本發(fā)明還提供了所 述流感組合疫苗中的任一種在預防或治療流感病毒感染中的用途。在本發(fā)明的另一個方面，提供了所述流感組合疫苗中的任一種在制備用于預防或治療流感病毒感染的藥物中的用途。針對具有多亞型、且在亞型之間具有豐富的突變的流感病毒，將受試者使用來自一個株的免疫原進行一次或多次接種，或者將所述的受試者使用來自多個株的多個免疫原進行多次接種不提供廣譜的交叉保護。通過按順序接種來自兩個或更多個株的免疫原，優(yōu)選地激活了一致的或共有的表位(兩個或更多個株所共有的表位)，并且針對該表位的免疫反應在隨后的疫苗接種中被增強。該免疫反應被認為是廣譜的交叉免疫反應，并且針對所接種的兩種或多種株顯示出抗性?？紤]到共有的或者一致的表位對于具有高突變潛力的病毒至關重要，并且不輕易地變化，組合疫苗對于其他未經(jīng)接種的或者新的株也顯示出抗性。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于在本發(fā)明中的組合疫苗針對不同的Hl流感病毒表現(xiàn)出非常強的保護。如在下文的實施例中所表明的，組合疫苗相對于大多數(shù)的傳統(tǒng)病毒Hl顯示為更強，并且因此在針對頻繁發(fā)作的感染進行接種中有用。
實施例在本發(fā)明中，攜帶來自不同流感亞型或者來自同一亞型的不同毒株的HA抗原或者HA編碼基因的流感疫苗按順序接種，從而得到組合疫苗，并且從而得到了廣譜的中和抗體，從而預防流感的感染。在本發(fā)明中，第一次注射可以攜帶來自甲型流感的H1-16中任意的亞型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一種或多種的組合的抗原；優(yōu)選地，所述的抗原選自甲型流感的H1、H3和H5亞型。第二次注射可以攜帶來自甲型流感的H1-16中任意的亞型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一種或多種的組合的抗原；優(yōu)選地，所述的抗原選自甲型流感的H1、H3和H5亞型，以及在第二次注射中的至少一種HA與第一次注射不同。所述的流感組合疫苗可以包括疫苗的第三次注射，并且所述的第三次注射可以攜帶來自甲型流感的H1-16中任意的亞型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一種或多種的組合的抗原；優(yōu)選地，所述的抗原選自甲型流感的Hl、H3和H5亞型，以及在第三次注射中的至少一種HA與第一次或第二次注射不同。所述的流感組合疫苗可以包括額外注射的疫苗，第四次或者更多次的注射可以攜帶來自甲型流感的H1-16中任意的亞型毒株或者乙型流感的HA，或者上述的一種或多種的組合的抗原；優(yōu)選地，在額外注射中的至少一種HA與前面的注射不同。在本發(fā)明中，使用了以下的動物、病毒株、疫苗和化學品:
DNA瘡苗構(gòu)律和制各流感毒株A/Texas/05/2009 (HlNl) HA (Gebank ACP41934) (TE09H1)氨基酸序列(如SEQ.1D.N0.1所示的)是密碼子優(yōu)化的，并且密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(如SEQ.1D.N0.2所示的)通過Generay biotechnology化學合成。隨后通過已知的分子生物學方法,將此核苷酸序列轉(zhuǎn)移到DNA疫苗載體pVAXl (Invitrogen, V260-20, CA, USA)。所構(gòu)建的質(zhì)粒DNA疫苗在此命名為PVAX1-TE09H1,并且通過測序來確認(Invitrogen,上海，中國)。通過Endo-FReePlasimd Giga Kits (QIAGEN, GE)來成批制備此疫苗。2006到2009流感毒株的流感病毒H3亞型氨基酸序列的共享序列(CON H3)(如SEQ.1D.N0.3)是密碼子優(yōu)化的，并且密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(如SEQ.1D.N0.4所示的)通過Generay biotechnology化學合成。隨后通過已知的分子生物學方法,將此核苷酸序列轉(zhuǎn)移到DNA疫苗載體pVAXl (Invitrogen, V260-20, CA, USA)。所構(gòu)建的質(zhì)粒DNA疫苗在此命名為pVAXl-CON H3并且通過測序來確認(Invitrogen,上海，中國)。通過Endo-FRee PlasimdGiga Kits(QIAGEN, GE)來成批制備此疫苗。在本發(fā)明中使用的其他DNA疫苗可以按照上述方法進行構(gòu)建和制備。BR07H1(SEQ.1D.N0.5中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.6中所示的核酸序列)，BR07H3 (SEQ.1D.N0.7中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.8中所示的核酸序列)，CON H5(SEQ.1D.N0.9中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.10中所示的核酸序列)，BR08BHA (SEQ.1D.N0.11中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.12中所示的核酸序列)全部都用于構(gòu)建疫苗。所述氨基酸序列和核酸序列在序列表中顯示。本文中所使用的所有DNA疫苗都是由本發(fā)明人按照以下的方案進行構(gòu)建和制備的。所有的HA抗原序列是密碼子優(yōu)化的，并且通過Generay biotechnology合成。隨后通過已知的分子生物學方法，將此抗原序列轉(zhuǎn)移到DNA疫苗載體pVAXl (Invitrogen,V260-20, CA，USA) 。所構(gòu)建的DNA疫苗通過測序來確認(Invitrogen，上海，中國)，并且該DNA疫苗的HA表達通過蛋白質(zhì)免疫印跡來確認。構(gòu)建的所有DNA疫苗通過Endo-freePlasimd Giga Kits(QIAGEN)來制備。重組疫苗載體疫苗的構(gòu)建和制備在本文中使用的全部重組痘苗載體疫苗都是由本發(fā)明人根據(jù)公知的方案(FredM.Ausubel, et al.Current Protocols in Molecular Biology, 2002)來構(gòu)建和制備的。全部的重組痘苗載體疫苗是在Vero細胞中制備和滴定的(上海生命科學研究院細胞研究中心(Cell Research Center of ShanghaiInstitutes for Biological Sciences),上海X動物和免疫SPF雌性BAL B/c小鼠購自Slac實驗動物(上海)并且在蘇州大學試驗動物中心中保管。所有的免疫是通過肌肉內(nèi)注射進行的?；诩俨《镜闹泻蜋z測假病毒化驗作為普遍接受的方案，被用于評估組合疫苗對流感病毒的不同毒株的保護效果。此方法充分描述在Wei等人.Science27August2010:329(5995), 1060-1064中。在本發(fā)明中，假病毒通過以下的方案來制備。將5X 106293T包裝細胞(上海生命科學研究院細胞研究中心，上海)與5 μ g的慢病毒載體pNL4-31uc.R-E-和2.5 μ g的HA表達質(zhì)粒以及2.5μ g的NA表達質(zhì)粒使用Turbofect(Fermentas)進行共轉(zhuǎn)染。所有的HA和NA由Generay biotechnology化學合成。所有的表達質(zhì)粒根據(jù)上述的方法進行構(gòu)建和制備。細胞過夜孵育之后，將其使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次并且在5ml的完全DMEM (Hyclone)中培養(yǎng)16到20小時。收獲假病毒的上清，并且在-80° C的冰箱中以小份儲存，直到在中和檢測中使用。在實施方案中采用了來自13個毒株的HA編碼 DNA。所述的 NA 來自 A/Shanghai/37T/2009 (HlNl) (GenBank N0.ACS27784)。假病毒的HA編碼序列和其所表達的蛋白質(zhì)序列列于下文:I)A/Singapore/6/1986 (HlNl)HA(GenBank N0.AB038395)DNA序列示于SEQ.1D.N0.13，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.14。2)A/NewCaledonia/20/1999(HlNl)HA(GenBank N0.AY289929)
DNA序列示于SEQ.1D.N0.15，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.16。3)A/SolomonIslands/3/2006(HlNl)HA(GenBank N0.ABU99109)DNA序列示于SEQ.1D.N0.17，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.18。4)A/Brisbane/59/2007 (HlNl)HA(GenBank N0.ACA28844)DNA序列示于SEQ.1D.N0.19，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.20。5)A/Texas/05/2009 (HlNl)HA(GenBank N0.ACP41934)DNA序列示于SEQ.1D.N0.2，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.1。6)A/Moscow/10/1999(H3N2)HA(GenBank N0.AAT08002)DNA序列示于SEQ.1D.N0.21，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.22。7)A/Fujian/411/2002(H3N2)HA(GenBank N0.ABB71825)DNA序列示于SEQ.1D.N0.23，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.24。8)A/Wisconsin/67/2005(H3N2)HA(GenBank N0.ACF54576)DNA序列不于SEQ.1D.N0.25,以及所表達的氨基酸序列不于SEQ.1D.N0.26。9)A/Brisbane/10/2007(H3N2)HA(GenBank N0.ABW23353)DNA序列不于SEQ.1D.N0.27，以及所表達的氣基酸序列不于SEQ.1D.N0.28。10)A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)HA(GenBank N0.AAW80717)DNA序列示于SEQ.1D.N0.29，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.30。11)A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1)HA(GenBank N0.ABB43059)DNA序列示于SEQ.1D.N0.31，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.32。12)B/Brisbane/60/2008(Victoria lineage)HA(GenBank N0.ACN29380)DNA序列示于SEQ.1D.N0.33，以及所表達的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.34。13)B/Florida/4/2006(Yamagata-1ineage)HA(GenBank N0.ACA33493)。DNA序列不于SEQ.1D.N0.35,以及所表達的氨基酸序列不于SEQ.1D.N0.36。14)A/Shanghai/37T/2009(HlNl) NA GenBank N0.ACS27784DNA序列不于SEQ.1D.N0.37，以及所表達的氣基酸序列不于SEQ.1D.N0.38。假病毒、HA表達質(zhì)粒、流感毒株的名稱及其Genbank登錄號顯示在下表I中。表I
權(quán)利要求
1.一種抗多種流感毒株的通用型流感免疫方法，其特征在于將兩種或更多種不同的流感疫苗按照特定的順序進行接種，并且每種流感疫苗接種至少一次，并且總接種次數(shù)為兩次或更多次；其中，每種流感疫苗包含一種或多種抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因，并且進一步包含一種不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的編碼基因。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗原是流感病毒血凝素(HA)。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的兩種或多種流感疫苗選自:滅活疫苗、減毒疫苗、重組HA亞單位疫苗、攜帶HA編碼基因的DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗或者重組酵母載體疫苗、表達HA的重組病毒樣顆粒疫苗，以及上述疫苗的組合ο
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA選自:甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 亞型的 HA 和乙型流感的 HA0
5.權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA選自:甲型流感的H1、H3、H5亞型的HA和乙型流感的HA。
6.權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA選自:甲型流感HA的H1、H3和H5亞型的HA。
7.權(quán)利要求2-6中任一項所述的方法，其特征在于所述的兩種或多種流感疫苗包含來自Hl亞型的一種或多種HA或者其編碼基因。
8.權(quán)利要求2-6中任一項所述的方法，其特征在于所述的HA選自HAO、HAl、HA2或其免疫原性片段。
9.權(quán)利要求2-8中任一項所述的方法，其特征在于所述HA的氨基酸序列是同一亞型的HA的共享序列或者祖先序列。
10.權(quán)利要求2-9中任一項所述的方法，其特征在于所述的流感病毒HA編碼基因是針對人進行密碼子優(yōu)化的。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于按順序進行三次免疫，并且 a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型； b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且 c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于Hl疫苗的HA來自A/Texas/05/2009(HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是pVAXl_C0N H5 ;其中pVAXl_TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。
14.權(quán)利要求1到10中任一項所述的方法，其特征在于按順序進行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于Hl疫苗的HA來自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于三種Hl疫苗是pVAXl-BR07Hl、pVAXl-BR07Hl和 rvv-TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表達流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的 HA的重組DNA疫苗，并且rvv-TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組痘苗病毒載體疫苗。
17.權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于按順序進行四次免疫，并且 a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA來自乙型流感； b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型； c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且 d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于BHA疫苗的HA來自B/Brisbane/60/2008，Hl疫苗的HA來自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于所述的BHA疫苗是pVAXl-BR08BHA，所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，以及所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表達 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重組 DNA 疫苗，pVAXl-TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。
20.權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其特征在于所述的免疫方法針對禽類和哺乳動物，優(yōu)選地針對人。
21.權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其特征在于兩次接種之間的間隔是至少I周；優(yōu)選為2周或更多周,最多4周。
22.一種流感組合疫苗，其包含兩種或更多種用于序貫接種的流感疫苗，其特征在于每種流感疫苗包含一種或多種抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因，并且進一步地包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的編碼基因。
23.權(quán)利要求22所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的兩種或更多種流感疫苗按照一定的順序進行接種，并且每種流感疫苗接種至少一次，并且總接種次數(shù)為兩次或更多次。
24.權(quán)利要求23所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的抗原是流感病毒HA，或者流感病毒HA的組合。
25.權(quán)利要求22所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的兩種或更多流感疫苗選自:滅活疫苗、減毒疫苗、重組HA亞單位疫苗、攜帶流感病毒HA編碼基因的DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗或者重組酵母載體疫苗、表達HA的重組病毒樣顆粒疫苗，以及上述疫苗的組合。
26.權(quán)利要求23到25中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的HA選自:甲型流感的 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 亞型的 HA和乙型流感的HA。
27.權(quán)利要求22到26中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的兩種或更多種流感疫苗包含Hl亞型的一種或多種HA或者其編碼基因。
28.權(quán)利要求22到27中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的流感病毒HA選自:HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。
29.權(quán)利要求22到28中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的HA序列是相同亞型的共享序列或者祖先序列。
30.權(quán)利要求22到29中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的HA編碼基因是針對人進行密碼子優(yōu)化的。
31.權(quán)利要求22所述的流感組合疫苗，其特征在于按順序進行四次免疫，并且 a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA來自乙型流感； b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型； c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且 d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。
32.權(quán)利要求31所述的流感組合疫苗，其特征在于BHA疫苗的HA來自B/Brisbane/60/2008, Hl 疫苗的 HA 來自 A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且 H3 疫苗的 HA 是 2006到2009的H3亞型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。
33.權(quán)利要求31所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的BHA疫苗是pVAXl-BR08BHA，所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，且所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表達 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重組 DNA 疫苗，pVAXl-TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組 DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。
34.權(quán)利要求22所述的流感組合疫苗，其特征在于按順序進行三次免疫，并且 a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型； b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA來自甲型流感的H3亞型；并且 c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA來自H5亞型。
35.權(quán)利要求34所述的流感組合疫苗，其特征在于Hl疫苗的HA是A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亞型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亞型的共享序列。
36.權(quán)利要求34所述的流感組合疫苗，其特征在于所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，以及所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，并且所述的H5疫苗是pVAXl-CON H5 ;其中PVAX1-TE09H1是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表達2006到2009的H3亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表達2006到2009的H5亞型HA的共享序列的重組DNA疫苗。
37.權(quán)利要求22所述的流感組合疫苗，其特征在于，按順序進行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA來自甲型流感的Hl亞型。
38.權(quán)利要求37所述的流感組合疫苗，其特征在于，Hl疫苗的HA來自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)
39.權(quán)利要求37所述的流感組合疫苗，其特征在于，三種Hl疫苗是pVAXl-BR07Hl、PVAX1-BR07H1 和 rvv_TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表達流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的HA的重組DNA疫苗，并且rvv_TE09Hl是表達流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重組痘苗病毒載體疫苗。
40.權(quán)利要求22到37中任一項所述的流感組合疫苗，其特征在于，所述的疫苗針對哺乳動物，優(yōu)選地針對人。
41.權(quán)利要求22到40中任一項所述的流感組合疫苗在預防或治療流感病毒感染中的用途。
42.權(quán)利要求22到40中任一項所述的流感組合疫苗在制備用于預防或治療流感病毒感染的藥物中的 用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預防流感病毒傳播的方法，和構(gòu)成所述方法的因素，以及尤其地涉及一種組合疫苗和其免疫方法。將兩種或更多種疫苗按照特定的順序進行接種，并且每種流感疫苗至少接種一次，并且總接種次數(shù)為兩次或更多次；其中每種流感疫苗包含一種或多種抗原、其免疫原性片段或者其編碼基因，并且進一步包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或編碼基因。與傳統(tǒng)疫苗相比，該組合疫苗還對不同毒株或者新的毒株顯示出更好的抗性。
文檔編號A61K39/145GK103221064SQ201180042517
公開日2013年7月24日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者徐建青, 黃楊 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)唯可達生物科技有限公司