專利名稱：在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚合物生物材料與細(xì)胞生長因子的復(fù)合技術(shù)，具體說是關(guān)于在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法背景技術(shù)組織工程是指將種子細(xì)胞接種于可降解的支架中并將支架移植于體內(nèi)幫助人體修復(fù)受損組織的現(xiàn)代治療技術(shù)。對于制備組織工程支架的生物材料，除了要求其表面能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附以外，還要求其能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。實現(xiàn)這一目的的方法是制備復(fù)合有細(xì)胞生長因子的生物材料。細(xì)胞生長因子是一類通過細(xì)胞間信號傳遞影響細(xì)胞活動的多肽類信號分子。它對細(xì)胞具有促進(jìn)或抑制其分裂增殖、遷移、分化和基因表達(dá)的作用。生長因子均為多肽類蛋白質(zhì)大分子，其制備過程復(fù)雜，價格較昂貴，但很小濃度的生長因子就會對細(xì)胞的生理活動有重要的調(diào)節(jié)作用，因此生長因子被廣泛用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長過程。生長因子與生物材料的復(fù)合是組織工程領(lǐng)域中的重要的研究課題之一。復(fù)合有生長因子的生物活性材料可以更好地促進(jìn)細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞向特定的組織或器官分化。因此在組織工程技術(shù)中，該類生物活性材料是對通常的細(xì)胞相容性材料的發(fā)展與提高，可以更好地促細(xì)胞生長與分化，而且其作用的靶向性更為專一。將生長因子與生物材料復(fù)合如直接將細(xì)胞生長因子溶液涂層于生物材料表面，則材料表面的生長因子很容易流失；且在疏水性的聚合物材料表面生長因子水溶液也無法均勻鋪展。采用化學(xué)接枝的方法將生長因子化學(xué)固定在材料表面，一方面需要較高濃度的生長因子溶液作為反應(yīng)液從而使成本過高、生長因子的利用率降低，另一方面化學(xué)反應(yīng)極易破壞生長因子的天然構(gòu)象從而使其活性降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，以制備復(fù)合有細(xì)胞生長因子的活性生物材料。
本發(fā)明的在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，具體步驟為1)將聚合物生物材料浸入濃度為10～40％的過氧化氫溶液中，在紫外光輻照下氧化，氧化溫度20～80℃，時間0.1～10小時，在材料表面引入大分子過氧化氫團(tuán)，去離子水沖洗，除去游離的過氧化氫分子；
2)氮氣保護(hù)下，將材料浸于濃度為0.1～50v％的丙烯酸、甲基丙烯酸或其它含羧基的乙烯基單體的溶液中，在亞鐵離子存在下，引發(fā)單體在材料表面的接枝聚合反應(yīng)，亞鐵離子的濃度為0.0001～0.01摩爾/L，反應(yīng)溫度20～60℃，時間20～80分鐘，反應(yīng)后去離子水洗滌；3)將材料浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，在0～40℃溫度下，反應(yīng)1～24小時，使材料表面的羧基活化；4)將細(xì)胞生長因子與濃度為1～100mg/ml的生物大分子溶液物理混合，其中細(xì)胞生長因子的含量為1μg-10mg/ml；5)將步驟(3)制備的材料取出，浸入步驟(4)制備的混合有細(xì)胞生長因子的生物大分子溶液中，使材料表面活化后的羧基與生物大分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)時間1～24小時，反應(yīng)后將材料取出后直接干燥。
本發(fā)明中的聚合物生物材料主要是但不限于聚乳酸，可以采用如聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU)等常用聚合物生物材料。聚合物生物材料的形態(tài)包括二維的平面膜和三維的多孔支架。
所說的生物大分子包括明膠、膠原、殼聚糖、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙基胺等含有氨基的生物大分子。
所說的細(xì)胞生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素(IL)等。
本發(fā)明的方法操作簡單、重復(fù)性好、無不良副作用，該方法在材料表面引入的細(xì)胞生長因子被物理包埋于生物大分子涂層中，使生長因子受到了生物大分子的保護(hù)，其天然構(gòu)像得以維持，因而能夠隨生物大分子涂層穩(wěn)定地存在于生物材料表面，并具有較高的生物活性，可提高生長因子的利用效率，同時由于包埋在生物大分子涂層中的生長因子向材料表面以外的釋放需要穿過生物大分子涂層的阻礙，因此具有緩慢釋放的效果。


圖1軟骨細(xì)胞在未改性的PLLA膜、膠原涂層的PLLA膜、復(fù)合有BMP的PLLA膜以及復(fù)合有bFGF的PLLA膜表面的MTT活性隨培養(yǎng)時間的變化曲線。接種密度60000/孔，24孔培養(yǎng)板。
圖2a軟骨細(xì)胞在復(fù)合有BMP的PLLA膜表面的光學(xué)顯微鏡照片。接種密度40000/cm2，培養(yǎng)時間2天，蘇木精染色。
圖2b軟骨細(xì)胞在復(fù)合有bFGF的PLLA膜表面的光學(xué)顯微鏡照片。接種密度40000/cm2。培養(yǎng)時間2天，蘇木精染色。
圖3軟骨細(xì)胞在未改性的PLLA多孔支架、膠原涂層的PLLA多孔支架、復(fù)合有BMP的PLLA多孔支架以及復(fù)合有bFGF的PLLA多孔支架中的MTT活性。接種密度600×104/ml。
圖4a軟骨細(xì)胞在復(fù)合有BMP的PLLA多孔支架中的激光共聚焦顯微鏡照片。接種密度600×104/ml，培養(yǎng)時間2星期，F(xiàn)DA染色。
圖4b軟骨細(xì)胞在復(fù)合有bFGF的PLLA多孔支架中的激光共聚焦顯微鏡照片。接種密度600×104/ml，培養(yǎng)時間2星期，F(xiàn)DA染色。
具體實施例方式
通過下述實施例可更好地理解本發(fā)明，但這些實例并不用來限制本發(fā)明。
實施例1骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在聚-L-乳酸(PLLA)平面膜表面的引入。
將BMP或bFGF與膠原/乙酸溶液(pH＜4)均勻混合，得到了含有BMP或bFGF的膠原溶液，其中膠原溶液濃度為2.5mg/ml，BMP和bFGF的濃度分別為0.3mg/ml和900單位/ml。
將PLLA平面膜浸于30％的過氧化氫溶液中，在250w的紫外燈照射下氧化1小時，氧化溫度為50℃。去離子水清洗以除去游離的過氧化氫。在氮氣保護(hù)下，將光氧化后的PLLA平面膜浸于濃度為5v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩爾/L的硫酸亞鐵胺)，在30℃下引發(fā)甲基丙烯酸在PLLA膜表面的接枝聚合反應(yīng)，反應(yīng)時間1小時，從而在材料表面引入羧基。將PLLA膜浸于10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDAC)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，反應(yīng)溫度為4℃，反應(yīng)時間為4小時，反應(yīng)過程中材料表面的羧基被活化。然后將PLLA膜浸入上述含有BMP或bFGF的膠原/乙酸溶液中，4℃下反應(yīng)24小時。反應(yīng)后將PLLA膜從膠原溶液中取出，并保留物理涂附在材料表面的膠原溶液，直接干燥，在PLLA膜表面得到均勻穩(wěn)定的并含有BMP或bFGF的膠原涂層。
圖1為含有BMP或bFGF的PLLA平面膜表面軟骨細(xì)胞的MTT活性，由圖可看出引入細(xì)胞生長因子以后的PLLA膜表面軟骨細(xì)胞的MTT活性與空白對照相比明顯提高。圖2a、圖2b分別為軟骨細(xì)胞在含有BMP或bFGF的PLLA膜表面的光學(xué)顯微鏡照片，由圖可見活性PLLA膜表面的軟骨細(xì)胞分布均勻，鋪展良好。
實施例2骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在PLLA多孔支架中的引入。
將BMP或bFGF與膠原/乙酸溶液(pH＜4)溶液混合均勻，得到了含有BMP或bFGF的膠原溶液，其中膠原溶液濃度為2.5mg/ml，BMP和bFGF的濃度分別為0.3mg/ml和900單位/ml。
將PLLA多孔支架浸于30％的過氧化氫溶液中，通過抽真空的方法使支架中的空氣放出，然后恢復(fù)壓力將過氧化氫溶液壓入支架內(nèi)部，在250w的紫外燈照射下氧化1小時，氧化為溫度50℃。通過離心的方法將支架中的過氧化氫溶液去除。將去離子水壓入支架內(nèi)部，然后離心去除，反復(fù)多次以清洗多孔支架中的過氧化氫。在氮氣保護(hù)下，將光氧化后的PLLA支架浸于濃度為10v％的甲基丙烯酸溶液中(含有0.0015摩爾/L的硫酸亞鐵胺)，將甲基丙烯酸溶液壓入多孔支架內(nèi)部，在30℃下引發(fā)甲基丙烯酸在PLLA多孔支架內(nèi)部表面的接枝聚合反應(yīng)，反應(yīng)時間1小時，從而在材料表面引入羧基。將去離子水壓入支架內(nèi)部，然后離心去除，反復(fù)多次以清洗多孔支架中未反應(yīng)的甲基丙烯酸單體。將PLLA多孔支架浸于10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDAC)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，并將液體壓入支架內(nèi)部。反應(yīng)溫度為4℃，反應(yīng)時間為4小時，反應(yīng)過程中材料表面的羧基被活化。離心去除多孔支架中的EDAC溶液，將多孔支架浸入上述含有BMP或bFGF的膠原/乙酸溶液中，并將液體壓入支架內(nèi)部，4℃下反應(yīng)24小時。反應(yīng)后將PLLA多孔支架從膠原溶液中取出，干燥，在PLLA多孔支架內(nèi)部得到均勻穩(wěn)定的且含有BMP或bFGF的膠原涂層，從而制備了含有細(xì)胞生長因子的活性多孔支架。
圖3為含有細(xì)胞生長因子的PLLA多孔支架內(nèi)部的軟骨細(xì)胞的MTT活性，由圖可見引入細(xì)胞生長因子以后支架內(nèi)部軟骨細(xì)胞的活性明顯提高。激光共聚焦顯微鏡照片顯示(圖4a、圖4b)，含有細(xì)胞生長因子的PLLA支架內(nèi)部的軟骨細(xì)胞分布均勻，鋪展良好。上述結(jié)果表明引入細(xì)胞生長因子BMP或bFGF的PLLA多孔支架材料具有優(yōu)良的細(xì)胞相容性。
權(quán)利要求
1.在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，包括以下步驟1)將聚合物生物材料浸入濃度為10～40％的過氧化氫溶液中，在紫外光輻照下氧化，氧化溫度20～80℃，時間0.1～10小時，在材料表面引入大分子過氧化氫團(tuán)，去離子水沖洗，除去游離的過氧化氫分子；2)氮氣保護(hù)下，將材料浸于濃度為0.1～50v％的丙烯酸、甲基丙烯酸或其它含羧基的乙烯基單體的溶液中，在亞鐵離子存在下，引發(fā)單體在材料表面的接枝聚合反應(yīng)，亞鐵離子的濃度為0.0001～0.01摩爾/L，反應(yīng)溫度20～60℃，時間20～80分鐘，反應(yīng)后去離子水洗滌；3)將材料浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，在0～40℃溫度下，反應(yīng)1～24小時，使材料表面的羧基活化；4)將細(xì)胞生長因子與濃度為1～100mg/ml的生物大分子溶液物理混合，其中細(xì)胞生長因子的含量為1μg-10mg/ml；5)將步驟(3)制備的材料取出，浸入步驟(4)制備的混合有細(xì)胞生長因子的生物大分子溶液中，使材料表面活化后的羧基與生物大分子中的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，反應(yīng)時間1～24小時，反應(yīng)后將材料取出后直接干燥。
2.按權(quán)利要求書1所述的在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，其特征是所說的聚合物生物材料包括聚乙醇酸(PGA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚氨酯(PU)等聚合物生物材料。
3.按權(quán)利要求書1所述的在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，其特征是所說的生物大分子包括明膠、膠原、殼聚糖、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚烯丙基胺等含有氨基的生物大分子。
4.按權(quán)利要求書1所述的在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法，其特征是所說的細(xì)胞生長因子包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素(IL)等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在聚合物生物材料表面引入細(xì)胞生長因子的方法。該方法采用預(yù)先將細(xì)胞生長因子與生物大分子溶液物理混合，然后利用“接枝－涂層”技術(shù)將混有細(xì)胞生長因子的生物大分子溶液穩(wěn)定地涂層在生物材料表面，使細(xì)胞生長因子物理分散于生物大分子涂層中，制備出復(fù)合有細(xì)胞生長因子的活性生物材料。包埋于生物大分子涂層中的細(xì)胞生長因子能夠穩(wěn)定地存在于生物材料表面，并具有良好的生物活性。該方法操作簡單、重復(fù)性好、無不良副作用，所制備的含有細(xì)胞生長因子的活性生物材料對細(xì)胞的生長和活性有良好的促進(jìn)作用。
文檔編號A61L27/50GK1453354SQ0311708
公開日2003年11月5日 申請日期2003年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月19日
發(fā)明者高長有, 馬祖?zhèn)? 龔逸鴻, 沈家驄 申請人:浙江大學(xué)