專利名稱：創(chuàng)傷性腦損傷的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶在制備用于治療創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)的藥物制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EP-A10 296 721公開了一類哌啶或1，2，3，6-四氫吡啶化合物，其5-位被一個(gè)5-元雜環(huán)基取代，包括一組任意取代的5-四唑基-1，2，3，6-四氫吡啶化合物。已揭示此類化合物對中樞膽堿能受體具有高親和性，特別是對中樞毒蕈堿M1受體具有高親和性，因此，可用于治療阿爾茨海默病，老年癡呆癥，以及學(xué)習(xí)和記憶功能障阻。
Moltzen等人J.Med.Chem.1994，37，4085-4099描述了該一組化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系。已報(bào)導(dǎo)其中一種化合物，即5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶對毒蕈堿受體具有選擇性作用，并對M1受體比對M2和M3受體具有高幾倍的親和性(毒蕈堿受體的亞型，第六屆國際學(xué)術(shù)討論會(huì)，Nov.9-12，1994，F(xiàn)ortLauderdale)。其功能作用被描述為M1受體的部分激動(dòng)劑，以及M2和M3受體的拮抗劑。并且，已報(bào)導(dǎo)的體內(nèi)試驗(yàn)中唯一突出的作用是分別對幼大鼠和成年大鼠空間記憶獲得的效力。
在人群中由物理的或神經(jīng)的狀態(tài)，或者各種疾病所引起的TBI，其重要性正在不斷增加，因此，對用于治療這種疾病及其后遺癥有效并安全的藥物有巨大的需求。
現(xiàn)在已驚奇地發(fā)現(xiàn)，化合物5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶在用于治療TBI及其后遺癥中，顯示出有益的作用。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，或它的酸加成鹽在制備用于治療創(chuàng)傷性腦損傷或其后遺癥的藥物制劑中的應(yīng)用。
在說明書和權(quán)利要求書中，名詞“創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)”意指包括與腦或脊髓創(chuàng)傷有關(guān)的所有病癥，例如，由作用于腦底(Scull)或脊柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦血栓形成或栓塞，AIDS所致神經(jīng)障礙，大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的與腦或脊髓創(chuàng)傷有關(guān)的病癥。
本發(fā)明所用的該化合物的可藥用的酸加成鹽，是以無毒的有機(jī)或無機(jī)酸形成的鹽。這類有機(jī)鹽的實(shí)例有下列有機(jī)酸形成的鹽馬來酸，富馬酸，苯甲酸，抗壞血酸，雙羥萘酸，琥珀酸，草酸，雙-亞甲水楊酸，甲磺酸，乙二磺酸，乙酸，丙酸，酒石酸，水楊酸，檸檬酸，葡糖酸，乳酸，蘋果酸，扁桃酸，肉桂酸，檸康酸，尺冬氨酸，硬脂酸，棕櫚酸，衣康酸，乙醇酸，對-氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，和茶葉堿乙酸，以及8-鹵代茶葉堿，如8-溴代茶葉堿。這類無機(jī)鹽的實(shí)例有以鹽酸，氫溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸和硝酸形成的鹽。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所用的化合物對治療TBI是有用的。例如，它能改善中度創(chuàng)傷性腦損傷之后的識(shí)別能力，以及能夠降低膽堿能神經(jīng)元的損傷退化性減少。而且還發(fā)現(xiàn)，在被認(rèn)為是臨床適合的劑量下，它不引起有害的心博或其它的副作用。
另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或治療人TBI的方法，包括對需要這種治療的病人給予治療有效量5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其酸加成鹽的步驟。
本發(fā)明所用的化合物及其可藥用的酸加成鹽，可通過任何適當(dāng)?shù)耐窘?jīng)給藥，例如口服或非經(jīng)腸道給藥，并且，該化合物還可以以任何適當(dāng)?shù)男问浇o藥，例如以片劑，膠囊，粉劑或糖漿劑的形式，或者溶液或分散體的注射劑型。
本發(fā)明化合物或其可藥用的鹽，其有效的日劑量是10μg/kg體重-10mg/kg體重，優(yōu)選的是25μg/日/kg體重-1.0mg/日/kg體重。因此，適合的日劑量是500μg/日-600mg/日，優(yōu)選的是1.0mg/日-100mg/日。
本發(fā)明所用的化合物可按照EP-A10 296 721中所述的方法得到，其酸加成鹽可通過本領(lǐng)域熟知的方法容易地制備。藥理學(xué)通過如下公認(rèn)的可靠方法，對本發(fā)明所用的化合物進(jìn)行了測定TBI之后的識(shí)別功能按照Dixon.C.E等人J.Neurosurgery，67(1987)110-119所述的方法，使大鼠形成中樞流體沖擊創(chuàng)傷性腦損傷。對受損傷的動(dòng)物從受傷后24小時(shí)開始治療，以生理鹽水或5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，以3.6μmol/kg或15μmol/kg的劑量，每日皮下注射給藥1-15天。
按照Dixon et al 1987，同上文獻(xiàn)的方法測定動(dòng)物TBI后的翻正反射抑制。
在動(dòng)物受損傷之前和受損傷后1-5天記錄體重，并按照Hamm.R.J.等人J.Neurotreuma，11(1994)187-196中的方法，在受傷后1-5天測定動(dòng)物旋轉(zhuǎn)桿的能力。旋轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)可用于測定TBI后的運(yùn)動(dòng)能力。
最后，在受傷后11-15天，測定動(dòng)物在Morris水迷宮中找到目標(biāo)平臺(tái)的平均消耗時(shí)間(+S.E.M.)。借助于ANOVA對此結(jié)果進(jìn)行分析。在水迷宮試驗(yàn)過程中，對所有的動(dòng)物在水迷宮測定前10分鐘進(jìn)行了注射治療。
試驗(yàn)中還包括用于對比的假損傷動(dòng)物(使動(dòng)物受損傷，但未受到中樞流體沖擊)。
TBI之后對ChAT神經(jīng)元的定量測定如上所述使大鼠形成中樞流體沖擊創(chuàng)傷性腦損傷，并進(jìn)行治療。以生理鹽水(n＝5)或待測化合物(5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，15μmol/kg)(n＝5)對動(dòng)物作皮下注射。對假損傷大鼠也以生理鹽水(n＝4)或待測化合物15μmol/kg(n＝4)注射(皮下)治療。
如上所述測定翻正反射的抑制。
通過對前腦基底部膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)免疫反應(yīng)性神經(jīng)元進(jìn)行定量計(jì)數(shù)，可測定TBI之后膽堿能神經(jīng)元的可能損失。在受損傷后15天(最后一次注射給藥后的2-4小時(shí))，將所有的動(dòng)物用戊巴比妥麻醉(90mg/kg腹膜內(nèi)注射)后，先用200-250ml等滲鹽水，隨后用以0.1M磷酸鹽緩沖液配制的500ml 4.0％多聚甲醛/0.2％苦味酸，在室溫下，以500ml/30分鐘的速度作主動(dòng)脈灌流。灌流完成之后，選取修整成二塊腦組織，并在相同的溶液中，10℃后固定24小時(shí)。通過前腦各神經(jīng)核，在振動(dòng)切片機(jī)上切取40μm厚的冠狀切片，并對每個(gè)核的第5片切片作ChAT免疫反應(yīng)性處理。對平行的切片以結(jié)晶紫作Nissi體物質(zhì)染色，用于定量測定前腦基底部神經(jīng)核中膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元的任何可能的損失。
將前腦切片在以含有0.1％triton、X-100的0.01M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配制的1.0μg/ml最終ChAT抗體濃度(1∶50)中作自由漂浮孵育。然后對前腦切片進(jìn)行修整，并在培養(yǎng)板中，以第一抗體在室溫下孵育24小時(shí)(4片/300μl/孔)。
在PBS中洗4次后，將這些切片在第二抗體(馬抗小鼠IgG、VectorLaboratories，Burlingame，CA)中37℃孵育1小時(shí)。在PBS中洗3次后，以小鼠親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)(Vector)技術(shù)(Hsu et al，J.Histochem.Cytochem29，1981，577-580)將切片在37℃孵育2小時(shí)。用PBS洗3次，用0.1M Tris緩沖鹽水(TBI)洗1次之后，借助于Shu et al，Neurosci.Lert.85 1988，169-171所述的葡萄糖氧化酶-二氨基聯(lián)苯胺-鎳法、對自由漂浮的切片進(jìn)行處理。通過將切片轉(zhuǎn)移到TBS中使反應(yīng)停止。將切片鋪裱在明膠-鉻明礬涂布的載玻片上，并使之在室溫下干燥過夜，在遞增濃度的乙醇和二甲苯中進(jìn)行脫水，然后以Permount作蓋玻片封片。
用微型計(jì)算機(jī)圖象處理系統(tǒng)(MCID)(Imaging Research Inc.Ontario.Canada)，對中隔核(MSN)，對角帶頂葉核(VDB)和外側(cè)基底核中的ChAT免疫反應(yīng)性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。把MSN和VDB之間的界面定義為前連合。NMB被定義為位于黃白球和內(nèi)囊鄰接部中的免疫標(biāo)記神經(jīng)元。從每只動(dòng)物，對通過前腦各神經(jīng)核0.2mm間隔得到的切片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對于每個(gè)前腦神經(jīng)核，細(xì)胞數(shù)目以每10000μm2的組平均數(shù)表示。
對于以結(jié)晶紫染色的平行切片，其MSN，VDB和NMB中的神經(jīng)元也通過MCID進(jìn)行計(jì)數(shù)。因?yàn)樵谌磕憠A能和非膽堿能神經(jīng)元中，整個(gè)這些區(qū)域被結(jié)晶紫染色的神經(jīng)元數(shù)量很多，所以，對每個(gè)神經(jīng)核進(jìn)行雙側(cè)樣品神經(jīng)元計(jì)數(shù)。將預(yù)先確定面積和網(wǎng)狀方格尺用于每個(gè)神經(jīng)核的細(xì)胞計(jì)數(shù)。對于MSN和VDB核，對每側(cè)3個(gè)2000μm2的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)(這樣，在被計(jì)數(shù)的4片切片中的每片切片，每個(gè)神經(jīng)核取樣的取樣的總面積為12000μm2)。對于NMB，每側(cè)計(jì)數(shù)一個(gè)12000μm2的區(qū)域(在被計(jì)數(shù)的4片切片中的每片切片，計(jì)數(shù)的總面積＝24000μm2)。僅對具有明顯體細(xì)胞Nissi體的，并具有非常典型神經(jīng)元細(xì)胞核的大細(xì)胞(直徑＞20μm)作定量測定。結(jié)果TBI后，在受損傷的任何動(dòng)物之間，翻正反射的抑制沒有顯著差異。這表明，在每次實(shí)驗(yàn)中，損傷組動(dòng)物受到了同等程度的損傷。假損傷動(dòng)物的翻正動(dòng)作顯著地快于TBI的任何動(dòng)物(每一比較中P＜0.0001)。假損傷組動(dòng)物翻正反射的抑制是由于損傷前所用的氣體麻醉引起的。
在受傷組的任何動(dòng)物之間，TBI后體重下降沒有顯著差異，再次表明受傷組動(dòng)物有同等的損傷程度。
受損傷組的任何動(dòng)物之間，在受損傷后1-5天旋轉(zhuǎn)桿的能力沒有顯著差異。因?yàn)槭窃趽p傷后1-15天給予待測化合物，所以這些試驗(yàn)也表明，該藥物對損傷后的體重或旋轉(zhuǎn)桿能力沒有影響。
ANOVA分析表明，每日以待測化合物注射(皮下)治療的受損傷動(dòng)物，在Morris水迷宮中比注射鹽水治療的受損傷動(dòng)物有更好的表現(xiàn)。以待測化合物15μmol/kg治療的受損傷動(dòng)物，具有顯著改善的能力，P＜0.01。
對于分別以鹽水和待測化合物治療的大鼠，TBI都引起了VDB和NMB中ChAT-1R神以元數(shù)量顯著減少。但是，本發(fā)明化合物顯著地降低了ChAT-1R神經(jīng)元的損傷退化性減少(VDB中，與鹽水治療的受損傷組相比較，降低了32％，NMB中降低于51％)。結(jié)晶紫染色的平行切片顯示，MSN，VDB或NMB中細(xì)胞數(shù)目未減少，表明ChAT-1R神經(jīng)元的損失并不是由于細(xì)胞死亡所致。
制劑實(shí)施例本發(fā)明的藥物制劑可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備。
例如片劑可通過將活性成分與通常的佐劑和/或稀釋劑混合，然后在常用的壓片機(jī)內(nèi)將此混合物壓片。佐劑或稀釋劑的實(shí)例包括玉米淀粉，乳糖，滑石粉，硬脂酸鎂，明膠，樹膠等等。任何其它的佐劑或添加的色素，香料，防腐劑等，只要它們與該活性成分是可配伍的都可加入。
注射液可通過如下程序制備先將活性成分和可能的添加劑溶解于部分賦形劑中，優(yōu)選的賦形劑是無菌水，并將此溶液校準(zhǔn)至所需的體積，再將此溶液滅菌，然后灌裝入適當(dāng)?shù)陌碴郴蛩幤恐?。還可以加入本領(lǐng)域常規(guī)使用的任何適合的添加劑，如滲壓調(diào)節(jié)劑，防腐劑，抗氧化劑等。
本發(fā)明制劑的典型制劑實(shí)例如下(活性成分的量是以游離堿計(jì)算)1)片劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-120mg-甲基吡啶乳糖60mg玉米淀粉30mg羥丙基纖維素2.4mg微晶纖維素 19.2mgA型Croscarmellose鈉 2.4mg硬脂酸鎂0.84mg2)片劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-110mg-甲基吡啶乳糖46.9mg玉米淀粉23.5mg聚烯吡酮1.8mg微晶纖維素 14.4mgA型Croscarmellose鈉 1.8mg硬脂酸鎂0.63mg3)糖漿劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-15.0mg-甲基吡啶山梨醇 500mg羥丙基纖維素15mg甘油50mg對羥苯甲酸甲酯 1mg對羥苯甲酸丙酯 0.1mg乙醇0.005ml芳香劑 0.05mg糖精鈉 0.5mg水 加至1ml4)溶液5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-11.0mg-甲基吡啶山梨醇 5.1mg乙酸0.08mg注射用水加至1ml
權(quán)利要求
1. 5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽在制備用于治療創(chuàng)傷性腦損傷藥劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所制備的藥劑含有單位劑量形式的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于所制備的藥劑含有500μg-600mg/日，優(yōu)選地為1.0mg-100mg/日劑量的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一權(quán)項(xiàng)的應(yīng)用，其特征在于所制備的藥劑用于治療由作用于腦底或脊柱的物理力，局部缺血，中風(fēng)，呼吸停止，心跳停止，腦血栓形成或栓塞，AIDS所致神經(jīng)障礙，大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術(shù)后事件，腦感染，震蕩或顱內(nèi)壓升高所引起的創(chuàng)傷性腦損傷，和/或用于治療這樣一種病癥的后遺癥。
全文摘要
式(Ⅰ)化合物5－(2－乙基－2H－四唑－5－基)－1,2,3,6－四氫－1－甲基吡啶,能改善創(chuàng)傷性腦損傷動(dòng)物的識(shí)別能力,并能降低膽堿能神經(jīng)元損傷退化性減少,因此可用于制備治療創(chuàng)傷性腦損傷的藥劑。
文檔編號(hào)A61K31/44GK1207039SQ9619946
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月5日
發(fā)明者B·R·派克 申請人:H·隆德貝克有限公司