專利名稱：“脂質(zhì)體”的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷用注射組合物，該組合物含有包被著一種或多種顯影劑的脂質(zhì)體。
在廣泛的診斷影像領(lǐng)域，造影劑被用來(lái)增強(qiáng)影像的強(qiáng)度，最重要的是用于X-射線成像，磁共振成像、超聲波成像和核醫(yī)學(xué)成像。
X-射線成像(包括計(jì)算機(jī)輔助X-射線斷面照相術(shù)(CT)和數(shù)字遞減血管照相術(shù)(DSA))中，反差的產(chǎn)生是由于電子密度的差異。當(dāng)前，X-射線造影劑通常用的是重的元素，包括鋇鹽如硫酸鋇(可用于增強(qiáng)腸胃系統(tǒng)影像的顯現(xiàn))和碘化造影劑(可用于腸胃系統(tǒng)及非腸胃系統(tǒng)的研究)。
碘化X-射線造影劑一般都包含碘化苯基基團(tuán)，最典型的是含有至少一個(gè)2，4，6-三碘苯基團(tuán)且在其3位和/或5位上具有選自下列基團(tuán)的取代基羧基，氨甲?；?，N-烷基氨甲?；?，N-羥基烷基氨甲?；?，酰氨基，N-烷基酰胺基和酰氨基甲基，這一類的離子X-射線造影劑包括甲基泛影酸，泛影酸，腦影酸，碘克沙酸及這些酸的鹽。
非離子型碘化X-射線造影劑，由于其低滲透性及該性質(zhì)所導(dǎo)致的較小的血液動(dòng)力學(xué)影響，通常其毒性基本上要比離子型造影劑低，這些造影劑包括碘海醇(iohexol)，碘噴托(iopentol)，碘帕醇(iopamidol)，碘克沙醇(iodixanol)，碘普羅胺(iopromide)，碘曲侖(iotrolan)和甲泛葡胺(metrizamide)。其中那些被稱為二聚體的(如，碘克沙醇和碘曲侖)，當(dāng)其濃度在300mg/ml或更高時(shí)，就其滲透壓而言，可以配成同血液等滲。
最近，基于重金屬絡(luò)離子/螯合物的腸胃外X-射線造影劑引起人們的興趣，可參見WO-A-9114460和WO-A-9217215中所述。
由于其親水性到目前為止所提及的所有X-射線造影劑，幾乎具有相同的胞外生物分布且因此而有相類似的臨床指征并且均由腎臟排出。因而，試圖發(fā)現(xiàn)對(duì)器官更特異的造影劑。比如，將碘苯基團(tuán)同大分子底物如淀粉相連，以圖提高碘化造影劑在血管中的半衰期。
以可被生物降解粒子為基礎(chǔ)的一些可能的肝臟造影劑已經(jīng)被提出，(比如參見WO-A-8900988和WO-A-9007491)并且包含離子或非離子X-射線造影劑的脂質(zhì)體也已被提及。但由于穩(wěn)定性和毒性等問題，迄今為止還沒有上市或是已進(jìn)入晚期臨床階段，故而，需要一種更穩(wěn)定，無(wú)毒性且器官特異性的X-射線造影劑，而這一需求尚未得到滿足。
在磁共振成像中，能被造影劑所影響的主要的對(duì)比參數(shù)是自旋弛豫時(shí)間(T1)和自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)。順磁性螯合物(比如錳離子(2+)，釔離子(3+)和鐵離子(3+))可減少自旋-晶格弛豫時(shí)間(T1)從而增加信號(hào)強(qiáng)度。磁共振造影劑若用磁性/超順磁性物質(zhì)，則會(huì)減少自旋-自旋弛豫時(shí)間(T2)，從而導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度的減弱。
鏑元素順磁螯合物及其它高劑量的順磁化合物也能減弱磁共振信號(hào)強(qiáng)度?？v觀磁共振造影劑，一些正在研制發(fā)展中，一些已經(jīng)上市，詳情可查D.D.stark和W.G.Bradley磁共振成像，Mosby 1992，Chapter 14。
一些親水螯合物，如GdDTPA GdDOTA，GdHPDO3A和GdDTPA-BMA分布于胞外，且被腎消除。這樣的復(fù)合物可用于觀察諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害等。其它的對(duì)器官或組織特異性更強(qiáng)的造影劑包括MnDPDP，GdBOPA，GdEOB-DTPA，順磁性卟啉，大分子化合物，粒子及脂質(zhì)體等。
各種順磁性金屬離子及其螯合物曾被包被于脂質(zhì)體中。比如有不同類脂組分，不同表面電荷及不同直徑的小單層脂質(zhì)體顆粒(SUVs)，大單層脂質(zhì)體顆粒(LUVs)和多層脂質(zhì)體顆粒(MLVs)曾被提出用作磁共振的造影劑(例如見S.E.Seltzer.放射學(xué)171(1989)第19頁(yè)；S.E.Seltzer等實(shí)驗(yàn)放射學(xué)23(1988)第131頁(yè)；C.Tilcock等放射學(xué)171(1989)第77頁(yè)；C.Tilcock等生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1022(1990)第181頁(yè)；E.C.Unger等實(shí)驗(yàn)放射學(xué)25(1990)第638頁(yè)；E.C.Unger等實(shí)驗(yàn)放射學(xué)23(1988)第928頁(yè)；E.C.Unger等放射學(xué)171(1989)第81頁(yè)；E.C.Unger等磁共振成像7(1989)第417頁(yè)及J.Vion-Dury等藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療學(xué)雜志250(1989)第111頁(yè))。但是，盡管有許多關(guān)于用脂質(zhì)體做磁共振造影劑的報(bào)導(dǎo)，目前尚無(wú)此類產(chǎn)品商業(yè)化或進(jìn)入晚期臨床發(fā)展階段。
超聲成像的原理是基于超聲波的穿透性，例如一頻率為1-10兆赫茲的超聲波，通過一換能器，穿透人或動(dòng)物的身體，超聲波將與體內(nèi)組織和體液的表面互相作用。超聲圖像的反差的形成就是由于在這些表面，超聲波被不同程度地反射/吸收引起的；圖像效果可用多譜勒技術(shù)來(lái)增強(qiáng)，包括運(yùn)用彩色多譜勒來(lái)判定血液的流動(dòng)。
運(yùn)用造影劑來(lái)增強(qiáng)不同組織/體液間的聲學(xué)特性的差異可能對(duì)超聲成像有好處，這一點(diǎn)久已為人所識(shí)，自從1968年運(yùn)用第一個(gè)超聲波造影劑，靛藍(lán)花青綠以來(lái)，已經(jīng)有許多造影劑，包括超聲波誘導(dǎo)劑，被測(cè)試。其中包括乳劑，固體顆粒，水溶性化合物，游離氣泡及各種類型的含氣體的有外被的造影劑系統(tǒng)。通常約為易壓縮的低密度造影劑在產(chǎn)生聲波反向散射上是非常有效的；因而含氣或產(chǎn)氣的造影劑系統(tǒng)較其它類型系統(tǒng)有效得多。
現(xiàn)在，有三種超聲波造影劑已能商業(yè)供貨或已處于晚期臨床發(fā)展階段，它們是Echovist，一種含氣體的半乳糖微晶； Levovist，含有用脂肪酸包被的含氣體的半乳糖微晶；Infoson，含有被不完全變性的人血清白蛋白包被的氣泡。然而，由于其較短的造影半衰期(就是說(shuō)其在體內(nèi)相對(duì)來(lái)說(shuō)不穩(wěn)定)和/或它們的有限的存貯期，這些造影劑的臨床應(yīng)用受到了限制。
因而，對(duì)于超聲波造影劑的需求仍未改變，特別是需要可用來(lái)心臟和非心臟的灌注研究的造影劑，這就要求該造影劑不但要有好的存貯穩(wěn)定性，還應(yīng)在體內(nèi)研究中也穩(wěn)定，在心臟或非心臟的灌注分析中，造影劑最好能夠至少維持幾次循環(huán)。
盡管有眾多的出版物建議用脂質(zhì)體或其它技術(shù)來(lái)增加各種造影劑的組織或器官特異性，但卻均有不足之處，因而當(dāng)前尚無(wú)這種類型的產(chǎn)品在市場(chǎng)上出售或已進(jìn)入晚期臨床發(fā)展階段。這一結(jié)果是由于以下問題造成的低的包被率，毒性，短的存貯期和/或體內(nèi)的不穩(wěn)定性或短的造影半衰期；此外，現(xiàn)有的一些產(chǎn)品含有非常復(fù)雜的成分。因而，仍需要不存在這些問題的造影劑。在超聲波成像領(lǐng)域，特別需要這樣的造影劑該造影劑應(yīng)在體內(nèi)有很高的穩(wěn)定性，以便可以用來(lái)作心臟或非心臟的灌注并且其本身必須穩(wěn)定，也便能有效地使肝成像，以進(jìn)行診斷。
一般來(lái)說(shuō)，脂溶性藥物易于混合進(jìn)脂質(zhì)體中。另一方面，對(duì)于水溶性藥物，通過藥物所帶電荷同帶電脂類間的靜電作用或是靠脂質(zhì)體內(nèi)外pH梯度，水溶性電解質(zhì)也可被包被在脂質(zhì)體內(nèi)部水相中(見日本專利申請(qǐng)No.2-187370和WPI 88-271022/38)。
然而，用上述方法包被的藥物量很低。更有甚者，一旦藥物是一種水溶性的非電解質(zhì)物質(zhì)，上述方法將行不通，因而有效地用脂質(zhì)體包被一種水溶性的非電解質(zhì)藥物并非易事。為了有效地將水溶性的非電解質(zhì)包裝于脂質(zhì)體內(nèi)層水相中，人們提出了反相蒸發(fā)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol75(9)，第4194頁(yè)，1978)，乙醚注射法(ibid，Vol443，第629頁(yè)，1975)及其它方法。
但是，這些方法中用到的乙醚是一種低熔點(diǎn)物質(zhì)，因此這些方法不能用于工業(yè)化生產(chǎn)大量的脂質(zhì)體。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 88/09165描述了一種可供注射用的脂質(zhì)體的制劑。該脂質(zhì)體含有一種X-射線造影劑溶液，脂質(zhì)體又懸浮于生理鹽緩沖液連續(xù)相中。盡管脂質(zhì)體是在含X-射線造影劑的水介質(zhì)中形成的，但用于注射時(shí)，脂質(zhì)體要先離心分離并重懸于緩沖液中。由于通過在無(wú)菌條件下由各種組分來(lái)制備脂質(zhì)體組合物中既不可靠又成本高昂，所以如果在脂質(zhì)體制備后能夠高壓滅菌以提供注射所需的無(wú)菌組合物，這將有事半功倍的好處；從理論上說(shuō)，脂質(zhì)體懸液可用過濾除菌，但實(shí)際上，只有當(dāng)脂質(zhì)體所有顆粒的直徑均小于0.22μm時(shí)，過濾除菌才是可行的。由于存在一遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高壓時(shí)溫度(大約121℃)的相轉(zhuǎn)變溫度(Tc)，所以以前脂質(zhì)體懸液的高壓幾乎無(wú)一例外地不成功；然而kikuchi等在Chem.Pharm.Bull.39(4)1018-1022頁(yè)，1991的報(bào)告中提出，當(dāng)被包被的溶質(zhì)和類脂雙分子層帶有相反電荷時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生例外。我們發(fā)現(xiàn)若對(duì)WO 88/09165中提及的那種只在其內(nèi)部含有X-射線造影劑的脂質(zhì)體進(jìn)行高壓，則造影劑會(huì)從脂質(zhì)體內(nèi)逸出，進(jìn)而，我們又發(fā)現(xiàn)這一問題可按下述方法解決即在一連續(xù)相中高壓脂質(zhì)體，該連續(xù)相中造影劑濃度同脂質(zhì)體內(nèi)部液相中造影劑濃度基本相等。這樣的高壓滅菌一般在一密封容器中進(jìn)行，該容器在冷卻及存儲(chǔ)中均保持密封，直至注射前即開即用。
本發(fā)明還基于這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)即通過用中性的類脂和帶電荷類脂來(lái)構(gòu)成脂質(zhì)體的膜，并使脂質(zhì)體顆粒的平均直徑相對(duì)較小，比如在50-3000nm之間，由此可以使用于成像的脂質(zhì)體造影劑在以下各方面均有改良包裝效率，毒性，生產(chǎn)流程和/或存貯期。脂質(zhì)體所帶的負(fù)電荷所產(chǎn)生的膜間靜電排斥力可使之有高的包裝能力，例如，至少達(dá)到5ml/g。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特性，我們提供一種可用于人或動(dòng)物的診斷用組合物，該組合物含有多層脂質(zhì)體，一般可含有也可不含有單層脂質(zhì)體，脂質(zhì)體中包被至少一種顯影劑并且脂質(zhì)體被懸浮于含有該種顯影劑的水介質(zhì)中，其中，脂質(zhì)體包括中性的磷脂和帶電荷磷脂，脂質(zhì)體的平均顆粒直徑為50至3000nm并且脂質(zhì)體內(nèi)部水相中顯影劑的濃度基本同懸浮脂質(zhì)體的水介質(zhì)中顯影劑的濃度相同。
本發(fā)明的組合物中填充在脂質(zhì)體中的液體也包括與含造影劑的脂質(zhì)體在一起的外部的由一般造影劑所構(gòu)成的連續(xù)相(這些造影劑可滿足血液等形成影像的要求)，這些包含在脂質(zhì)體內(nèi)部的造影劑將定位到肝和脾中，以增強(qiáng)這些器官的成像。
本發(fā)明的脂質(zhì)體懸液在其內(nèi)部的水相中有高的包被容量(例如至少5ml/g類脂，更有可能是至少6ml/g)，因此，能夠容納大量的水溶性藥物，并且該懸液不但能耐受高壓滅菌而且在血液中或在貯藏中均是穩(wěn)定的。
本發(fā)明的組合物用于X-射線成像時(shí)，比如可將本發(fā)明組合物按上文所述方法與現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何碘化X-射線造影劑或重金屬簇形化合物/螯合物X-射線造影劑相混合。
本發(fā)明組合物中的碘化X-射線造影劑每分子最好包含有3個(gè)或更多的碘原子并且通常包含一個(gè)或多個(gè)碘化苯基基團(tuán)。非離子型的顯影劑更佳，特別是那些被稱作非離子二聚體，例如碘克沙醇(iodixanol)和碘曲侖(iotrolan)，這些非離子二聚體顯影劑有很高的親水性并且即使在高濃度，也僅產(chǎn)生較低的滲透壓。該組合物中造影劑的濃度可有很大的不同且造影劑濃度將受到以下因素的影響例如造影劑的性質(zhì)，該組合物用何種途徑使用以及臨床指征等等。
例如，典型的濃度范圍將是每毫升組合物包被有10-300mg(優(yōu)選是60-300mg，更優(yōu)選是70-110mg)的碘。而每毫升組合物中的總的碘量?jī)?yōu)選是40-450mg，更優(yōu)選是160-320mg。本發(fā)明組合物的給藥途徑通常為靜脈注射且注射劑量同樣變化較大，比如用量常常取定于臨床指征；通常，用于血管或肝成像的典型劑量是每千克體重用5-300mg的碘。
本發(fā)明脂質(zhì)體制劑中重金屬簇形化合物/螯合物優(yōu)選含有至少二個(gè)金屬原子，其元素序數(shù)應(yīng)均高于碘；這類有代表性的造影劑有鎢簇形化合物/螯合物，詳述見WO-A-9114460和WO-A-9217215。簇形化合物/螯合物可以是優(yōu)選的。
用于磁共振成像的本發(fā)明組合物，比如可按上文所述方法與現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何順磁性物質(zhì)相混合。這些順磁性造影劑可以是包被在顆粒中，也可以是共價(jià)地同多空腔的顆粒結(jié)合，也可以是非共價(jià)地嵌合在脂質(zhì)體的膜中。
順磁性造影劑可以是生理上可接受的順磁性金屬鹽或金屬螯合物，也可以包括自由基，優(yōu)先考慮的是一氧化氮型自由基。一旦順磁性物質(zhì)是自由金屬離子，則錳鹽(2+)應(yīng)優(yōu)先考慮。螯合物造影劑最有可能是錳離子(2+)，釓離子(3+)，鏑離子(3+)或鐵離子(3+)的螯合物并且可含有在一些文章中所描述的螯合劑(比如，可參看WO-A-9110645)， 其中有NTA，EDTA，HEDTA，DTPA，DTPA-BMA，BOPTA，TTHA，NOTA，DOTA，DO3A，HP-DO3A，EOB-DTPA，TETA，HAM，DPDP，卟啉及其衍生物。
這些順磁物質(zhì)在本組合物中的濃度如可以是1mM-0.5M。本磁共振診斷用造影劑一般是靜脈給藥，肝磁共振成像的典型用量是每千克體重用0.02mmol的包被著的金屬螯合物。同樣，濃度和劑量均受下列因素影響如順磁性物質(zhì)的性質(zhì)，給藥的途徑及臨床的指征。
用于磁共振成像的脂質(zhì)體的造影劑的制劑是如通過包被來(lái)與超順磁物質(zhì)或鐵磁性物質(zhì)(比如現(xiàn)有技術(shù)中已知)。這類物質(zhì)中優(yōu)先選擇的包括磁鐵礦，γ-Fe2O3，混合鐵氧體及其它有磁性的鐵化合物，包括有機(jī)鐵磁性化合物。被脂質(zhì)體包被的物質(zhì)可以是無(wú)衣殼的，也可以是有衣殼的，比如，用一些可以穩(wěn)定磁性的材料，如葡聚糖，脂肪酸或其它生物可容許的化合物包被；該物質(zhì)作腸胃外使用時(shí)，則其衣殼也應(yīng)是可被生物降解的。這種造影劑一般以水懸浮的顆粒狀態(tài)存在，其顆粒的直徑在4nm到1μm，優(yōu)選4-40nm。
這類診斷劑的濃度如可是0.01mM-0.1M。劑量將受造影劑性質(zhì)的影響，也會(huì)受到其生物分布及臨床指征的影響；在靜脈注射時(shí)用于血管成像(包括灌注)或用于肝成像的典型的劑量是每千克體重用0.1-100μmol的包被的鐵元素。
在超聲成像及其它所有的超聲技術(shù)中(包括多譜勒技術(shù))，均可使用脂質(zhì)體組合物。該組合物中優(yōu)選包含下列脂質(zhì)體包被有生理可接受氣體的脂質(zhì)體或包被有該種氣體前體的脂質(zhì)體或是含有能同脂質(zhì)體共價(jià)結(jié)合的氣體的脂質(zhì)體。
任何可被生物相容的氣體一般均可用于本發(fā)明的組合物中，比如空氣，氮?dú)猓鯕?，氫氣，一氧化氮，二氧化碳，更好的是一些水溶性氣體，比如氦氣，氬氣，六氟化硫，可選擇性氟化的低分子量的烴諸如甲烷，乙烯，四氟化碳或C2-7全氟化烷如全氯化丙烷，全氟化丁烷，全氟化戊烷，也可以是以上氣體的混合物。本文所使用的“氣體”包括在37℃正常體溫下處于氣態(tài)的任意物質(zhì)，因此，包括一些低沸點(diǎn)液體，比如乙醚或一些全氟化烷。
氣體前體包括，丙二酸氨；碳酸鹽及碳酸氫鹽類如碳酸鋰，碳酸氫鋰，碳酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸氨，碳酸鈣和碳酸氫鎂；另有生理可接受的重氮基化合物；含有諸如-CO.O.CR1R2.O.CO.OR3等基團(tuán)的碳酸酯；β-酮酸等。
這些氣體前體可能通過各種反應(yīng)方式產(chǎn)生含氣體的脂質(zhì)體。比如，由于體內(nèi)到處是酸性pH條件，故碳酸鹽或碳酸氫鹽在給藥后將立即在體內(nèi)產(chǎn)生二氧化碳；重氮化合物則有可能被諸如紫外光等照射從而產(chǎn)生氮?dú)?；碳酸酯則是與體內(nèi)非特異性的酯酶相互作用而降解產(chǎn)生二氧化碳；β-酮酸將通過自發(fā)的脫羧產(chǎn)氣。
本發(fā)明的超聲用組合物如可以是腸道使用，也可非腸道使用，盡管在特定的場(chǎng)合下，直接給藥于體腔比如輸卵管可能會(huì)更好。然而，一般情況下，常見的是血管內(nèi)給藥-最普遍的是通過靜脈注射，這樣可增強(qiáng)包括心臟和心外灌注研究中血管影像的效果。靜脈注射后，由于該組合物的穩(wěn)定性高，因而網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)將攝取許多該組合物，這一過程主要發(fā)生在肝中，所以可以使肝的超聲反差增強(qiáng)。
低密度超聲造影劑的一個(gè)理想特征就是它的易壓縮性。由于本發(fā)明的組合物中的脂質(zhì)體基本上包含非固體的基質(zhì)，所以此組合物有著很大的延展性。這將增強(qiáng)該組合物的可壓縮性并且因此增強(qiáng)了本發(fā)明的這種含氣超聲組合物的反射波信號(hào)的能力。
組成脂質(zhì)體膜的基本成分之一是中性磷脂，該磷脂包含至少一個(gè)基本飽和脂肪酸殘基。脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)優(yōu)選至少是15個(gè)或更多，更優(yōu)選的是至少有16個(gè)碳原子的脂肪酸殘基。一旦脂肪酸殘基中碳原子數(shù)少于14，則脂質(zhì)體保持其內(nèi)部水相的能力是低的而且用藥后脂質(zhì)體在血液中的穩(wěn)定性也是差的。另一方面一旦脂肪酸殘基中碳原子數(shù)是28個(gè)或更多，脂質(zhì)體的生物相容性將降低，并且在生產(chǎn)脂質(zhì)體時(shí)需非常高的溫度。
形成本脂質(zhì)體膜的另一基本組分是帶電磷脂，帶電磷脂至少含有一基本飽和脂肪酸殘基。該殘基中碳原子數(shù)通常至少為14，優(yōu)選至少有15個(gè)碳原子，更優(yōu)選至少有16個(gè)碳原子。一旦脂肪酸殘基中的碳原子數(shù)少于14，同樣，脂質(zhì)體無(wú)論是保持其內(nèi)部水相的能力還是在血液中的穩(wěn)定性均要降低。另一方面，若脂肪酸殘基中碳原子數(shù)是28或更多，則脂質(zhì)體的生物相容性就會(huì)降低而且在生產(chǎn)脂質(zhì)體時(shí)將需要非常高的溫度。
上文中的“基本飽和”是指中性磷脂或帶電磷脂的脂肪酸殘基是完全飽和的(就是說(shuō)不含碳碳雙鍵)，也可以指二者的不飽和度是極低的，比如碘值不超過20，更好的是碘值不超過10。一旦不飽和度過高，脂質(zhì)體將易被氧化且難于加熱滅菌。
在本發(fā)明中有用的中性磷脂包括中性甘油磷脂，比如部分或完全還原型的天然產(chǎn)生的(如由大豆或蛋黃來(lái)源的)或合成的磷脂酰膽堿，特別是半合成或合成的二軟脂酰磷脂酰膽堿(DPPC)或二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)。
在本發(fā)明中有用的帶電磷脂包括帶正電或帶負(fù)電的甘油磷脂。帶負(fù)電的磷脂包括磷脂酰絲氨酸，比如部分或完全還原型的天然產(chǎn)生的(如大豆或蛋黃來(lái)源的)或半合成的磷脂酰絲氨酸，特別是半合成或合成的二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)或二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS)；磷脂酰甘油，比如部分或完全還原型的天然產(chǎn)生的(如由大豆或蛋黃衍生的)或半合成的磷脂酰甘油，特別是半合成或合成的二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)或二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)；磷脂酰肌醇，比如部分或完全還原型的天然產(chǎn)生的(如由大豆或蛋黃衍生的)或半合成的磷脂酰肌醇，特別是半合成或合成的二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPI)或是二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)；磷脂酸，比如部分或完全氫化的天然產(chǎn)生的(如由大豆和蛋黃來(lái)源的)或半合成的磷脂酸，特別是半合成或合成的二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或是二硬脂酰磷脂酸(OSPA)。一般只用一種上述的帶電磷脂，但也有可能用一種以上的帶電磷脂。當(dāng)用不只一種帶電磷脂時(shí)，優(yōu)選所用的二種帶電磷脂帶同種電荷，即全帶正電或全帶負(fù)電，這樣可以防止凝集。
帶正電荷的脂包括磷脂酸同氨基醇形成的酯，比如二棕櫚酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸同羥基乙二胺形成的酯。
依據(jù)本發(fā)明，中性磷脂和帶電磷脂的重量比一般是200∶1到3∶1，優(yōu)選是60∶1到4∶1，更優(yōu)選40∶1到5∶1，比如大約是10∶1。
本脂質(zhì)體除了含有上述提及的二種基本成分外，還可能含有各種可有可無(wú)的組分。比如，作為抗氧化劑，可加入維生素E(α-生育酚)和/或維生素E乙酸酯，加入量一般是脂類總量的0.01-2molar％，優(yōu)選總量的0.1-1molar％。
為了增加脂質(zhì)體中造影劑的包裹量，對(duì)于含上述磷脂的脂質(zhì)體的診斷組合物來(lái)說(shuō)，組合物中脂類總量的濃度一般是20mg/ml到100mg/ml，優(yōu)選是40mg/ml到90mg/ml，更優(yōu)選50mg/ml到80mg/ml。
造影劑優(yōu)選被包被在脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體是由適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)所溶或懸浮而形成等滲溶液或懸液形式(同體內(nèi)的生理滲透壓相比)，以便在用藥后脂質(zhì)體能穩(wěn)定地維持于體內(nèi)。水，緩沖液諸如Tris-HCl緩沖液，磷酸緩沖液，檸檬酸緩沖液等可用作溶解或懸浮脂質(zhì)體的介質(zhì)。
在室溫下，較佳的pH范圍是6.5-8.5，優(yōu)選的pH范圍是6.8-7.8。一旦造影劑是非離子型的X-射線造影劑(該造影劑含有多個(gè)羥基)比如碘海醇(iohexol)、碘克沙醇(iodixanol)或者碘帕醇(iopamidol)時(shí)，那么正如美國(guó)專利4278654中所述，溫度-pH值負(fù)相關(guān)的緩沖液更合適一些。胺緩沖液有此特性，特別是TRIS。這類緩沖液在高壓滅菌的溫度下pH值較低，這樣可增加X-射線造影劑在高壓滅菌時(shí)的穩(wěn)定性，當(dāng)降回到室溫時(shí)，這類緩沖液的pH值又返回到生理更易接受的pH值。Tris緩沖液還可大大延長(zhǎng)造影劑的存貯期。
為了獲得等滲溶液或懸浮液，造影劑以產(chǎn)生等滲溶液的濃度溶解或懸浮于介質(zhì)中。當(dāng)由于造影劑本身溶解性差等原因，等滲溶液不能由造影劑單獨(dú)形成時(shí)，則要在介質(zhì)中加入一些無(wú)毒的可溶物，以便形成等滲溶液，這些物質(zhì)可以是氯化鈉等鹽類，也可以是諸如mantitol，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇等的糖類。
正如前文所述，本發(fā)明組合物的優(yōu)點(diǎn)之一就是可以耐受高壓滅菌。本組合物還有高的包被能力且其包被率相對(duì)于其脂組分來(lái)說(shuō)也是高的。
另外，本發(fā)明診斷用組合物有良好的成像特性和副作用低的優(yōu)點(diǎn)，這將在下文述及。
本發(fā)明中的脂質(zhì)體可以用制造多層脂質(zhì)體的傳統(tǒng)工藝制造。這些工藝包括Bangham法(分子診斷學(xué)雜志，13.238-252，1965)，多價(jià)醇法(日本實(shí)審專利公開(KoKoKu)4-36734)，脂溶液法(日本實(shí)審專利公開(KoKoKu)4-36735)以及機(jī)械化學(xué)法(日本實(shí)審專利公開(KoKoKu)No.4-28412)。
一般來(lái)說(shuō)，多層脂質(zhì)體可以按如下方法制備將前文提及的磷脂溶于一種揮發(fā)性的有機(jī)溶劑中，比如氯仿，甲醇，二氯甲烷，乙醇等，或是溶于有機(jī)溶劑和水的混合溶劑中，然后除去溶劑，再將所得到的剩余物同一含有造影劑的水相相混合，振搖或攪拌這一混合物即可。
在上文所述的除去溶劑這一步中，Bangham法用的是蒸發(fā)的方法，但也可用噴霧干燥法或冷凍干燥法。
在前文所述的脂質(zhì)體制備過程中，所使用的相對(duì)于脂的溶劑量不太重要，任何能夠使類脂溶解的溶劑用量均可接受。從脂和溶劑的混合物中去除溶劑這一步可按傳統(tǒng)方法進(jìn)行，比如可以是減壓蒸發(fā)，如果必要，蒸發(fā)可在惰性氣體存在下進(jìn)行。實(shí)際上，上文所提到的揮發(fā)性有機(jī)溶劑可以用來(lái)配制包含10份該有機(jī)溶劑和高達(dá)1份水的混合溶劑。
若用冷凍干燥來(lái)去除溶劑，則選擇這樣一種溶劑在減壓條件下，約0.005-0.1Torr以及低于其凝固點(diǎn)的溫度下(一般為-30℃到-50℃)，該溶劑可被去除。若用噴霧干燥法去除溶劑，所需條件是氣壓一般控制在1.0kg/cm2，空氣流速為0.35cm2/分鐘，進(jìn)氣溫度調(diào)至高于所用溶劑的沸點(diǎn)。比如，溶劑是氯仿，進(jìn)氣溫度調(diào)至60℃到90℃，噴霧干燥可按一般流程進(jìn)行。
將這樣得到的脂殘余物，在溫度同所用脂的相轉(zhuǎn)變溫度(Tc)相同或高于相轉(zhuǎn)變溫度下，與含有造影劑的水溶液相混合，然后，在等于或高于Tc溫度下，劇烈地振搖或輕輕地?cái)嚢柙摶旌衔?，就可得到懸浮于含造影劑的水相中的所需脂質(zhì)體。在含造影劑的水溶液中的電解質(zhì)離子濃度應(yīng)該盡量低，以免對(duì)脂質(zhì)體包裹效率等產(chǎn)生不好影響；一般說(shuō)來(lái)，除造影劑外，正離子和負(fù)離子的總濃度應(yīng)不超過40mM，更好的是不要超過20mM。
盡管脂質(zhì)體顆粒大小可用平均顆粒大小來(lái)表示，然而在確定包裹能力方面，用重量平均顆粒大小更優(yōu)。
本發(fā)明脂質(zhì)體的平均顆粒大小一般為50nm到3,000nm，優(yōu)選150nm到1000nm，更優(yōu)選是200nm到500nm。為了得到上述大小的脂質(zhì)體顆粒，將含有大顆粒的脂質(zhì)體經(jīng)一次或多次過濾，過濾方法為頂出法(見生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)Vol，557，p9(1979))，濾膜孔徑預(yù)定(比如約1微米)。
本發(fā)明中的脂質(zhì)體至少有一部分是有多層膜的。一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)按上述工藝制成的脂質(zhì)體剛剛形成時(shí)，其為多層膜，但正如上文所述的過濾法，當(dāng)脂質(zhì)體懸液一次或多次通過濾膜時(shí)，比如通過孔徑為1微米的濾膜時(shí)，有些脂質(zhì)體外膜將被剝下，從而使濾后脂質(zhì)體成為含多層膜和含單層膜的脂質(zhì)體混合物，通常含多層膜的脂質(zhì)體所占重量百分比不少于30％，更可能是不少于40％。就脂質(zhì)體穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)，含多層膜的脂質(zhì)體有其優(yōu)勢(shì)，但混合物中單層膜脂質(zhì)體的百分比較大也是可以的，特別是因?yàn)檫@樣可以有比多層膜脂質(zhì)體更高的包裹力。
這樣制得的脂質(zhì)體懸浮于水介質(zhì)中(外液)，并可用來(lái)做診斷組合物。在脂質(zhì)體形成時(shí)，未被包入其中的含造影劑的溶液就作為外液?；蛘撸庖阂部捎闷渌后w代替，但外液中的顯影劑濃度應(yīng)同內(nèi)液中的相同。在任何情況下，外液(分散介質(zhì))應(yīng)同脂質(zhì)體內(nèi)部水相中等滲的。這樣制備得到的脂質(zhì)體懸液中電解質(zhì)離子濃度應(yīng)盡可能低；一般來(lái)說(shuō)，除造影劑外，正負(fù)離子總濃度應(yīng)該不超過40mM，最好是不超過20mM，這樣是為了增加脂質(zhì)體在加熱滅菌和長(zhǎng)期存貯時(shí)的穩(wěn)定性。
如上所述，本發(fā)明脂質(zhì)體包被水相的能力一般是至少5ml/g脂，優(yōu)選至少6ml/g脂。
當(dāng)用本發(fā)明的方法來(lái)包被碘化X-射線造影劑時(shí)，在最初水溶液中造影劑的濃度應(yīng)該高，這樣可使產(chǎn)物有較高的碘/脂比，從而可以減少成本及潛在的毒性。然而，根據(jù)本發(fā)明，較優(yōu)選的碘/脂重量比范圍應(yīng)在1.3-1.45間。這要低于一些現(xiàn)有技術(shù)中的比值在WO 88/09165中，給出的下限是1.5。
本發(fā)明中最優(yōu)選的X-射線造影劑組合物含有作為中性磷脂的氫化磷脂酰膽堿和作為帶電磷脂的氫化磷脂酰絲氨酸，優(yōu)選的比例為10∶1。這種組合物可以有大于7ml/g的包裹能力。用于該組合物的最好的X-射線造影劑是碘克沙醇(iodixanol)。脂質(zhì)體內(nèi)和脂質(zhì)體外的水介質(zhì)優(yōu)選每毫升含有400mg碘克沙醇(iodixanol)，而且還含有調(diào)節(jié)等滲的物質(zhì)比如山梨醇，穩(wěn)定劑比如EDTA Na2Ca和Tris緩沖液(pH值約為7.4)。
可通過本發(fā)明的方法來(lái)制備供磁共振成像用的脂質(zhì)體組合物，比如用脂質(zhì)體包被諸如GdHPDO3A之類的順磁性磁共振造影劑的水溶液或包被諸如四氧化三鐵之類超順磁性磁共振造影劑的懸浮液，其顆粒大小約為10nm；這種懸液可以通過控制四氧化三鐵的沉降使之同亞鐵(2+)鹽和鐵鹽(3+)分開而制得。
制備含有造影劑同脂質(zhì)體膜共價(jià)相聯(lián)的脂質(zhì)體，可以用類似于US-A-5135737中所描述的方法進(jìn)行制備。
用于超聲成像的含氣體組合物可以用各種方法制備，比如用以前所描述的制備含氣體的單層和多層顆粒的方法制備。這些技術(shù)在諸如US-A-4544545，US-A-4900540，WO-A-9109629和WO-A-9115244中有所闡述。比如說(shuō)用這些方法，脂質(zhì)體可將一種對(duì)pH值敏感的氣體前體溶液包被，此后使系統(tǒng)的pH值變化，使得該前體在脂質(zhì)體中產(chǎn)生氣體。
在上述情況下，將一種或多種的離子載體嵌合于脂質(zhì)體膜上是有益的，因其可以幫助轉(zhuǎn)運(yùn)氫離子或氫氧離子跨膜，從而可促進(jìn)系統(tǒng)pH值的變化-有關(guān)這樣的例子，可參見前文提到的WO-A-9109629。
另一種方法是將一種非特異性的人的酯酶同碳酸酯溶液一起包被于脂質(zhì)體中，然后將所得脂質(zhì)體保溫(比如37℃)5天，。此后，分離并制備那些漂浮的，含二氧化碳?xì)怏w的脂質(zhì)體，這些脂質(zhì)體可認(rèn)為是所需要的。
另一種制備含氣體脂質(zhì)體的方法是對(duì)已包裝了水介質(zhì)的脂質(zhì)體懸液施以氣體外壓。一般來(lái)說(shuō)，氣體應(yīng)以極高的壓力施用，比如至少應(yīng)有5個(gè)大氣壓左右的壓力。
另一種制備含氣脂質(zhì)體的方法如下先將選定的磷脂分散于水介質(zhì)或水和有機(jī)溶劑組成的混合溶劑中，該有機(jī)溶劑應(yīng)是水溶性，能為生物體所接受，并且知道能穩(wěn)定磷脂溶液，比如甘油或丙二醇(Propylenglycol)，然后在所選氣體或氣體混合物存在的情況下，劇烈攪動(dòng)該溶液。另外，可以在所選氣體及氣體混合物存在的情況下，對(duì)所述磷脂溶液進(jìn)行超聲處理，這樣可形成所需的脂質(zhì)體。
任何前文所提及的生物體相容氣體均可用于制備本發(fā)明的超聲造影劑。
通常，用于各類成像的本發(fā)明的組合物，如果需要，均可用其它物質(zhì)修飾，比如用聚乙二醇修飾來(lái)增加脂質(zhì)體在血液循環(huán)中的半衰期。這在應(yīng)用時(shí)，包括用于心血管成像中，是一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)。
以下例舉非限定性的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。測(cè)試技術(shù)(1)測(cè)定顆粒大小脂質(zhì)體的重力平均顆粒大小用準(zhǔn)彈性光散射的方法進(jìn)行測(cè)定，該方法使用的儀器是動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)(Otsuka Electronics Co.，Ltd生產(chǎn))(2)包被能力的測(cè)定脂質(zhì)體內(nèi)部水相體積是通過計(jì)算包含于脂質(zhì)體內(nèi)部的碘克沙醇的比例得到的；也就是說(shuō)若碘克沙醇的包被率是40％，則1ml的脂質(zhì)體制劑中，有0.4ml是其內(nèi)部的水相。
包裹能力被定義為每克脂中內(nèi)部水相的體積。比如，脂質(zhì)體制劑中脂濃度是0.056g/ml，并且在脂質(zhì)體中的碘克沙醇的百分率是40％，因此在1ml脂質(zhì)體中，0.056g的脂中有0.4ml的內(nèi)部水相，因此，包裹力就是7.1ml/g脂。
脂質(zhì)體制劑中蔗糖的包裹率是用凝膠過濾法測(cè)得的。此方法中，脂質(zhì)體制劑通過一凝膠過濾柱(載體Sephadgx G 50，pharmacia；柱直徑為16mm；柱高為30mm)，用生理鹽水作為流動(dòng)相，將洗脫出的液體分部收集(2.5ml/部分)。每部分中取出0.8ml，再加入2ml甲醇和1ml氯仿到這0.8ml中，振蕩使整個(gè)液體清澈。再加入1ml氯仿，振蕩后，加入1.2ml蒸餾水，再次振蕩后，將之放入一冷凍離心機(jī)(Kuboka ShojiK.K.，KR-702型)中離心(3500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，室溫下)，分相后，上層相(水-甲醇相)中回收的碘克沙醇的濃度通過測(cè)其在246nm下的光吸收值測(cè)出。若碘克沙醇在萃取物中的濃度過高，可用蒸餾水適度稀釋洗脫液，再取0.8ml出來(lái)，用甲醇，氯仿及蒸餾水萃取。
包裹率可按下法求得用空體積洗脫液中碘克沙醇的量去除以收集的所有洗脫液中碘克沙醇的量(25個(gè)洗脫組分中碘克沙醇的總量)，其值即為包裹率。注意終點(diǎn)處洗脫液中碘克沙醇的含量是最低的。實(shí)施例1包被X-射線造影劑，碘克沙醇將下列物質(zhì)在燒瓶中混合0.64g蛋黃衍生的氫化的磷脂酰肌醇(HEPC)，0.064g由HEPC合成的磷脂酰絲氨酸(HEPS)，60ml的氯仿，甲醇和水的混合物(體積比為100∶20∶0.1)。在65℃的水浴上加熱并使磷脂溶解，所得的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下蒸去溶劑。
所得剩余物再經(jīng)真空干燥2小時(shí)形成脂膜。將含有碘克沙醇(1，3-二(乙酰氨基)-N，N’-二〔3，5-二(2，3-二羥基丙胺羰基)-2，4，6-三碘苯基〕-2-羥丙烷)(0.4g/ml)和蔗糖(0.05g/ml)的水溶液加熱到65℃，將10ml熱溶液同所得脂膜混合，用攪拌器攪拌10分鐘，同時(shí)在65℃下加熱。該混合物加壓過濾一次，濾膜為孔徑是1.0μm的聚碳酸酯濾膜，所得到的就是大小合適的多層膜脂質(zhì)體顆粒(MLV)。
將得到的MLV放在玻璃器皿中，在121℃下，高壓滅菌20min，結(jié)果如表1所示。
包裹能力按照上文(2)中給出的方法測(cè)得。重力平均顆粒大小按(1)中所述的方法測(cè)得。
表1高壓滅菌前 高壓滅菌后顆粒大小(nm) 260±116251±120(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)包裹能力 6.4 6.5(ml/g脂)碘/脂重量比 1.3 1.3包裹率(％) 45.145.8實(shí)施例2碘克沙醇的包裹根據(jù)實(shí)施例1中所述的方法制備含有碘克沙醇的脂質(zhì)體劑型。
結(jié)果見表2。
表2制劑中各物質(zhì)濃度顆粒大小(nm) 包裹能力碘/ 脂重量比(mg/ml) (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差) (mg/g脂)HEPC HEPS Iodixanol 高壓滅菌前 高壓滅菌后 高壓滅菌前 高壓滅菌后 高壓滅菌前 高壓滅菌后64.0 6.4 400260＋11251＋120 6.4 6.4 1.3 1.3664.0 6.4 200273±125 275+118 7.8 8.0 0.8 0.8實(shí)施例3實(shí)施例1中得到的脂質(zhì)體懸液，用等滲的葡萄糖稀釋至濃度為50mg包被碘/ml。稀釋中，懸液將變成乳白色。乳濁液經(jīng)顯微鏡鏡檢，末發(fā)現(xiàn)有脂質(zhì)體凝集成團(tuán)。將此液體存貯一年后觀察，也未發(fā)現(xiàn)包被的碘克沙醇的量及顆粒的大小分布受到影響。實(shí)施例4實(shí)施例3中得到的組合物被靜脈注射入大鼠體內(nèi)。注射后，證實(shí)大部分的包被的碘克沙醇分布于肝中，但在脾中也發(fā)現(xiàn)了高濃度的碘克沙醇。隨著注射后時(shí)間的推移，組織中的碘克沙醇含量不斷減少直至在肝和脾中不能檢測(cè)出碘克沙醇的存在。其他器官中碘克沙醇的水平也不斷減少，并且同血液中碘克沙醇的減少相平行。大部分的注射進(jìn)去的碘克沙醇可在尿中回收。實(shí)施例5從實(shí)施例3中制得的組合物被靜脈注射到患有肝癌的大鼠中，大鼠已帶有多個(gè)肝癌的轉(zhuǎn)移腫瘤。分別以50mg和100mg包被碘/kg體重用藥，在肝的正常區(qū)域分別觀察到42個(gè)和62個(gè)漢普森氏單位(HU)的X-射線衰減，但在轉(zhuǎn)移腫瘤中卻很少有衰減。顯微鏡鏡檢表明所探測(cè)到的腫瘤直徑小于5mm。實(shí)施例6將從實(shí)施例3中制得的組合物，以200-7500mg包被碘/kg體重的劑量，靜脈注射入多組小鼠中。在其后14天中，觀察體重變化及是否死亡。
分析結(jié)果表明，所有小鼠均可承受劑量高達(dá)3g包被碘克沙醇/千克體重的脂質(zhì)體的注射。同未注射小鼠相比，這些小鼠在觀察期中體重?zé)o變化。當(dāng)注射劑量增至4g和5g包被碘克沙醇/千克體重時(shí)，可觀察到輕微的，劑量依賴性的降低，并且出現(xiàn)死亡。所以估計(jì)半致死量為5g脂質(zhì)體包被碘克沙醇/千克體重。實(shí)施例7從實(shí)施例1中制得的組合物，以劑量100-1000mg包被碘/千克體重對(duì)大鼠進(jìn)行單次和重復(fù)靜脈注射(注射3次/周，3周)，然后對(duì)各種與組織固著的酶在血液中的水平進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)所有重要器官進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同只注射鹽水的對(duì)照鼠相比，試驗(yàn)鼠血清中各酶只受到很小的影響。在試驗(yàn)鼠的肝和脾中觀察到由吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的吞噬空泡的增多，且該種增多是劑量依賴性的，除此之外，末檢測(cè)到任何由脂質(zhì)體誘導(dǎo)引起的組織學(xué)變化。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由吞噬細(xì)胞引起的空泡化程度也減弱，這一結(jié)果與肝和脾中碘克沙醇的量隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低相平行。實(shí)施例8包含有碘克沙醇的脂質(zhì)體一種診斷用組合物包括碘克沙醇(總量) 400mg/ml(包被碘) 80mg/ml山梨醇 20mg/ml氨丁三醇(TRIS) 0.097mg/mlEDTANa2Ca 0.1mg/ml氫化磷脂酰膽堿 51.2mg/ml氫化磷脂酰絲氯酸 5.1mg/ml注射用水加至 1ml(約0.9ml)該組合物經(jīng)溶解磷脂于氯仿/甲醇/水(體積比為4∶1∶0.025)中，再蒸干溶劑(旋轉(zhuǎn)蒸干)而制成。制備含有碘克沙醇和山梨醇的等滲液并加熱至60-70℃，以后各步中也要維持這一溫度。攪拌下加入磷脂混合物，這樣就制成了脂質(zhì)體。為了控制脂質(zhì)體顆粒的大小，將制成的脂質(zhì)體勻漿(用轉(zhuǎn)子/定子勻漿器)。然后，脂質(zhì)體被擠壓通過孔徑為1μm的7層一疊的聚碳酸酯濾膜。
用含有碘克沙醇和山梨醇的等滲溶液稀釋產(chǎn)物，再加入氨丁三醇和EDTA。將產(chǎn)物灌入玻璃瓶中并高壓滅菌(121℃，15分鐘)。實(shí)施例9含有碘曲侖的脂質(zhì)體按實(shí)施例8所述方法制備該脂質(zhì)體，但用碘曲侖代替碘克沙醇。實(shí)施例10含氫化磷脂酰甘油的包含有碘曲侖的脂質(zhì)體脂質(zhì)體的制作過程與實(shí)施例8中所述方法相同，但用氫化磷脂酰甘油代替氫化磷脂酰絲氨酸。實(shí)施例11磁共振造影劑(釓元素)含氫化磷脂酰膽堿和氫化磷脂酰絲氨酸的脂質(zhì)膜按照例1中所示方法制作。
10ml 0.5M的Gd HPDO3A溶液加熱至65℃。在該溫度下，用攪拌器攪動(dòng)該混合物15分鐘。將該混合物加壓濾過一層孔徑是1.0μm的聚碳酸酯濾膜，就可制得多層膜脂質(zhì)體顆粒(MLV)。
將MLV裝入一玻璃瓶中，并在121℃下高壓20分鐘以滅菌。
這種MLV包含有GdHPDO3A。實(shí)施例12磁共振造影劑(錳元素)按照實(shí)施例11中所述方法制備脂質(zhì)體，但用一種錳的螯合物溶液(0.07M)代替GdHPDO3A，該螯合物溶液是按照WO 93/21960(Nycomed Imaging AS)中所述方法制備的，該螯合物學(xué)名為3，6-二〔N-(2，3-二羥丙基)-N-甲基氨甲酰甲基〕-3，6-重氮基辛二酸。
此MLV中含有錳的螯合物。實(shí)施例13磁共振造影劑(鏑元素)按實(shí)施例11中所述方法制備脂質(zhì)體，但用0.5M的DyDTPA-BMA(0.5M)溶液代替GdHPDO3A。
此MLV中包含有Dy DTPA-BMA實(shí)施例14磁共振造影劑(氧化鐵)按實(shí)施例11中所述方法制備脂質(zhì)體，但用10mM磁性氧化鐵懸液(10mM，粒子大小為10-30nm)代替GdHPDO3A。
此MLV中含有磁性氧化鐵。實(shí)施例15脂質(zhì)體GDHPD03A(HEPC-HEPS)將含有640mg由卵黃來(lái)源的氫化磷脂酰膽堿和64mg由HEPC合成的氫化磷脂酰絲氨酸有混合物(按照實(shí)施例1中所述的方法制得的)加到裝有10ml含有250mM GdHPD03A(加多利道(gadoteridol))的5％葡萄糖溶液(等滲溶液)小瓶中。在65℃下將混合物攪拌30分鐘然后將該混合物再在65℃放置1小時(shí)。所得脂質(zhì)體溶液經(jīng)過5次的凍-融循環(huán)處理后再在65℃下加壓過濾5次，濾膜是2張疊在一起的孔徑為400nm的多聚碳酸酯濾膜，最終獲得的產(chǎn)物就是脂質(zhì)體GDHPD03A。實(shí)施例16脂質(zhì)體GdHPD03A(DPPC/DPPG)按照實(shí)施例1中提供的方法，制備含有640mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和64mg二軟脂酰磷脂酰甘油(DPPG)的類脂混合物，將之加入到裝有10ml含250mM GdHPD03A的5％葡萄糖溶液(等滲溶液)的小瓶中。在50℃下攪拌30分鐘后，，再將此混合物置于該溫度1小時(shí)。所得脂質(zhì)體溶液經(jīng)過5次凍-融循環(huán)處理后再在50℃下加壓過濾5次，濾膜是2張疊在一起的孔徑為400nm的聚碳酸酯濾膜。實(shí)施例17脂質(zhì)體GdDTPA-BMA制備此物質(zhì)的方法除了用含250mM GdDTPA-BMA(加多半特(gadodiamide))的水溶液代替GdHPD03A外，其余均與實(shí)施例15中的方法相同。實(shí)施例18脂質(zhì)體DyTTHA制備該物質(zhì)的步驟與實(shí)施例15中所述方法相同，但以含250mMDyTTHA的水溶液代替GdHPD03A(DyTTHA就是三乙烯四胺六醋酸同鏑形成的絡(luò)合物)。實(shí)施例19超聲造影劑脂質(zhì)體的制備按實(shí)施例11所示方法進(jìn)行，其中以鹽水代替GdHPP03A。以氮?dú)鈱?duì)此混合物加壓(70psi)一小時(shí)。除去多余的氮?dú)猓缓髮⑺玫闹|(zhì)體混合物過濾，濾膜為孔徑為1.0μm的一層多聚碳酸酯濾膜。
得到的MLV中含有氮?dú)?。?shí)施例20將實(shí)施例8中制得的組合物靜脈注射給大鼠。在劑量為75mg和100mg包被碘/千克體重時(shí)，可觀察到鼠肝中X-射線衰減分別為47個(gè)和70個(gè)漢普森氏單位(HU)。實(shí)施例21將從實(shí)施例8中得到的組合物靜脈注射給大鼠。發(fā)現(xiàn)半致死量大約是2000mg包被碘/千克體重。
權(quán)利要求
1.可用于人體或動(dòng)物體的診斷用組合物，該組合物含有多層脂質(zhì)體，也可含有或不含有單層脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體中含有至少一種顯影劑且脂質(zhì)體被懸浮在含有同種顯影劑的水介質(zhì)中，其中，脂質(zhì)體包括中性磷脂及帶電磷脂，其平均顆粒直徑為50到3000nm并且充滿脂質(zhì)體內(nèi)部水相中的顯影劑的濃度基本上與懸浮脂質(zhì)體的水介質(zhì)中的顯影劑濃度相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的診斷用組合物，其中懸浮脂質(zhì)體的水介質(zhì)是等滲的。
3.權(quán)利要求1或2的診斷用組合物，其中中性磷脂和/或帶電磷脂包含至少一種基本飽和的含至少14個(gè)碳原子的脂肪酸殘基。
4.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中中性磷脂和/或帶電磷脂包含至少一種基本飽和的含最高達(dá)28個(gè)碳原子的脂肪酸殘基。
5.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中中性磷脂是磷脂酰膽堿。
6.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中帶電磷脂是磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸或是磷脂酸與氨基醇形成的酯。
7.權(quán)利要求5或6的診斷用組合物，其中磷脂?；鶊F(tuán)是合成的或半合成的二棕櫚酰磷脂酰基團(tuán)或是二硬脂酰磷脂?；鶊F(tuán)。
8.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中脂質(zhì)體顆粒的平均大小是150nm到1000nm。
9.上述任一項(xiàng)權(quán)利要求的診斷用組合物，其中脂質(zhì)體的包裹能力至少是5ml/g。
10.權(quán)利要求9的診斷用組合物，其中脂質(zhì)體的包裹能力至少是6ml/g。
11.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中中性磷脂與帶電磷脂的重量比是60∶1到4∶1。
12.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中類脂的總濃度是20mg/ml到100mg/ml。
13.權(quán)利要求12的診斷用組合物，其中脂的總濃度是50mg/ml到80mg/ml。
14.上述任一權(quán)利要求的診斷用組合物，其中顯影劑是X-射線、磁共振成像或者超聲波造影劑。
15.權(quán)利要求14的診斷用組合物，其中X-射線造影劑含有一個(gè)或多個(gè)碘苯基基團(tuán)或重金屬簇形化合物或重金屬螯合物。
16.權(quán)利要求15的診斷用組合物，其中造影劑是碘克沙醇。
17.權(quán)利要求14的診斷用組合物，其中顯影劑是一種磁共振成像造影劑。
18.權(quán)利要求17的診斷用組合物，其中磁共振成像造影劑中含有錳。
19.權(quán)利要求17的診斷用組合物，其中磁共振成像造影劑是釓的螯合物。
20.權(quán)利要求17的診斷用組合物，其中磁共振成像的造影劑是共價(jià)聯(lián)接于脂質(zhì)體膜上的。
21.一種包括含有超聲波造影劑的脂質(zhì)體的診斷用組合物，且其中脂的總濃度至少是20mg/ml。
22.權(quán)利要求1或21的診斷用組合物，其中超聲波造影劑在體溫下是氣體。
23.權(quán)利要求22的診斷用組合物，其中超聲波造影劑是液體、固體或半固體化合物，這些化合物在體內(nèi)可形成氣體。
24.一種生產(chǎn)診斷用組合物的方法，其特征在于將中性磷脂和帶電磷脂溶于溶劑中，再除去溶劑得到剩余物，將該剩余物同含有顯影劑的水溶液混合，由此形成包裹有顯影劑的脂質(zhì)體。
25.權(quán)利要求24的制備脂質(zhì)體的方法，其中脂質(zhì)體形成后，可通過加壓使之通過濾膜來(lái)減小脂質(zhì)體的大小。
26.權(quán)利要求1的診斷用組合物在體內(nèi)診斷中的應(yīng)用。
27.對(duì)權(quán)利要求1到23的任一項(xiàng)的診斷用組合物高壓滅菌以產(chǎn)生一種無(wú)菌的診斷用組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可用于人體或動(dòng)物體的診斷的組合物，該組合物含有多層脂質(zhì)體，也可含有或不含有單層脂質(zhì)體，脂質(zhì)體中包被至少一種顯影劑并且脂質(zhì)體被懸浮于含有該種顯影劑的水介質(zhì)中，其中，脂質(zhì)體包括中性磷脂和荷電磷脂，脂質(zhì)體的平均顆粒直徑為50-3000nm并且脂質(zhì)體內(nèi)部水相中顯影劑的濃度基本與懸浮脂質(zhì)體的水介質(zhì)中顯影劑的濃度相同。這里所提及的造影劑就是典型的X-射線，磁共振顯像或超聲的造影劑。
文檔編號(hào)A61K49/06GK1148812SQ9519309
公開日1997年4月30日 申請(qǐng)日期1995年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月28日
發(fā)明者J·克拉夫內(nèi)斯, A·堡格, T·V·雅各森, P·朗維, T·艾格, H·菊地, K·屋地 申請(qǐng)人:尼科梅德成像有限公司, 第一制藥株式會(huì)社