專利名稱：聚乙二醇化和雙糖基化的紅細胞生成素的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及新的雙糖基化紅細胞生成素變體，其生產(chǎn)的方法和用途及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
紅細胞生成是紅細胞的產(chǎn)生，其用于補償細胞的破壞。紅細胞生成是受控的生理學機制，其使得足夠的紅細胞能夠用于適合的組織氧合作用。天然存在的人紅細胞生成素(hEPO)是在腎中產(chǎn)生的包含165個氨基酸殘基的糖蛋白，并且是刺激紅細胞產(chǎn)生的體液血漿因子。人EPO刺激骨髓中的定向紅系祖先細胞分裂和分化。人EPO通過與紅系前體細胞上的受體結(jié)合發(fā)揮它的生物活性。天然存在的人紅細胞生成素是酸性糖蛋白，其在血漿中以低濃度存在以刺激由于衰老而損失的紅細胞的更替。
已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)(Egrie，J.C.等，Immunobiol.72(1986)213-224)生物合成制造了紅細胞生成素，而且該紅細胞生成素是插入中國倉鼠卵巢組織細胞(CHO細胞)中表達的克隆人EPO基因的產(chǎn)物。天然存在的人EPO首先翻譯為具有166個氨基酸的帶有精氨酸166的多肽鏈。在翻譯后的修飾中，通過羧肽酶切下精氨酸166。在SEQ ID NO1和SEQID NO2中所示是人EPO的一級結(jié)構(gòu)(165個氨基酸和166個氨基酸)。在Cys7-Cys161和Cys29-Cys33間有兩個二硫鍵。沒有糖部分的人EPO多肽鏈的分子量是18,236 Da。在完整EPO分子中，碳水化合物基團占分子量的約40％(Sasaki，H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076)。
因為紅細胞生成素在紅細胞形成中是必要的，所以該激素在以低或缺陷的紅細胞產(chǎn)生為特征的血液疾病治療中是有用的。臨床上，EPO用于例如慢性腎衰竭患者(CRF)及AIDS和經(jīng)歷化療的癌癥患者中以治療貧血(Danna，R.P.等，InMB，Garnick編輯.Erythropoietin in ClinicalApplications-AN International Perspective.New York，NYMarcel Dekker；1990，301-324頁)。然而，目前可用的蛋白質(zhì)治療劑，如EPO的生物利用率受它們短的血漿半衰期和對蛋白酶降解的敏感性的限制。這些缺點阻止了它們發(fā)揮出最大的臨床潛力。
在美國專利號4,835,260；WO 94/25055；WO 94/24160；WO 94/02611；WO 95/05465；和現(xiàn)有技術(shù)的許多其它出版物中提出了EPO氨基酸序列的修飾。
人尿來源的紅細胞生成素和(哺乳動物細胞中表達的)重組紅細胞生成素包含三個N-連接和一個O-連接的寡糖鏈，它們一起占糖蛋白總分子量的約40％。在位于24、38和83位置的天冬酰胺殘基上存在N-連接的糖基化，而在位于126位置的絲氨酸殘基上存在O-連接的糖基化(Lai等，J.Biol.Chem.261(1986)3116；Broudy，V.C.等，Arch.Biochem.Biophys.265(1988)329)。已經(jīng)證明寡糖鏈被末端唾液酸殘基修飾。
酶促處理除去糖基化紅細胞生成素的所有唾液酸殘基后引起了體內(nèi)活性的喪失但是不影響體外的活性(Lowy等，Nature 185(1960)102；Goldwasser，E.等，J.Biol.Chem.249(1974)4202-4206)。當脫唾液酸紅細胞生成素與肝臟脫唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用時脫唾液酸紅細胞生成素會從循環(huán)中被快速清除掉，由此解釋了上述行為(Morrell等，J.Biol.Chem.243(1968)155；Briggs，D.W.等，Am.J.Physiol.227(1974)1385-1388；Ashwell，G.和Kawasaki，T.，Methods Enzymol.50(1978)287-288)。因此，僅僅當紅細胞生成素被唾液酸化以避免它與肝臟結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合時，紅細胞生成素才具有體內(nèi)生物活性。
紅細胞生成素寡糖鏈中其它成分的作用尚未十分明確。已經(jīng)證明，與糖基化形式比較，部分去糖基化的紅細胞生成素具有大大降低的體內(nèi)活性，但是保留了體外活性(Dordal，M.S.等，Endocrinology 116(1985)2293-2299)。然而，在另一個研究中，通過誘變糖基化位點天冬酰胺或絲氨酸殘基使N-連接或O-連接寡糖鏈單獨或一起去除則急劇地降低了哺乳動物細胞中產(chǎn)生的改變的紅細胞生成素的體外活性(Dube，S.等，J.Biol.Chem.263(1988)17516-17521)。
已經(jīng)利用寡核苷酸定向誘變制備了缺乏特定糖基化位點的EPO結(jié)構(gòu)突變體(Yamaguchi，K.等，J.Biol.Chem.266(1991)20434-20439；和Higuchi，M.等，J.Biol.Chem.267(1992)7703-7709)。Lee-Huang，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 61(1984)2708-2712；和美國專利號5,641,663描述了大腸桿菌(E.coli)中非糖基化EPO的克隆和表達。
EP 0 640 619涉及包含如下氨基酸序列的人紅細胞生成素類似物，該序列包含至少一個添加的糖基化位點。與人紅細胞生成素相比，該添加的糖基化位點可以導致更多數(shù)量的碳水化合物鏈和更高的唾液酸含量。此外，也提供了包含如下氨基酸序列的紅細胞生成素類似物，該氨基酸序列包含至少一個糖基化位點的重排。也包括含有一個或多個氨基酸添加的類似物，所述氨基酸添加到紅細胞生成素羧基末端，其中添加提供了至少一個糖基化位點。
WO 01/02017中描述了糖基化EPO的PEG化。這種分子顯示了改進的生物學活性。WO 00/32772和Francis，G.E.等，Int.J.Hem.68(1988)1-18描述了聚乙二醇修飾的非糖基化EPO。WO 00/32772的分子在位置166也被修飾。這種分子被描述為不引起血細胞比容的顯著增加。PEG-聚合物部分由1-5個聚合物鏈組成。WO 00/32772提出通過降低pH和減少PEG胺基團的比率控制PEG化的程度和位點。反應在pH7和PEG-醛∶氨基為1.5∶1摩爾比時進行，優(yōu)選地與N-末端α氨基反應。
盡管已知EPO的大量修飾，但是還需要具有改變的特性，特別是具有改變的清除率的EPO突變蛋白質(zhì)，和用于生產(chǎn)該突變蛋白質(zhì)的簡單且可重復的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一類新EPO突變蛋白質(zhì)。本發(fā)明的EPO突變蛋白質(zhì)具有引起骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學活性。
本發(fā)明提供了在Asn24，Asn38，Asn83保留潛在N-糖基化位點的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，該突變蛋白質(zhì)在Asn38和Asn83被N-糖基化而在Asn24未被N-糖基化，并且優(yōu)選地，在N-末端氨基和/或Lys20的ε氨基上連接聚(乙二醇)基團(PEG)，優(yōu)選地，連接烷氧基聚(乙二醇)基團，更優(yōu)選地，連接低級甲氧基聚(乙二醇)基團。
本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)有與EPO相同的用途。特別地，本發(fā)明突變蛋白質(zhì)可以通過刺激骨髓中定向紅系祖先細胞的分裂和分化用于治療患者。EPO以相同的方式用于治療患者。
本發(fā)明也包括人類貧血的治療方法和突變蛋白質(zhì)在藥劑，優(yōu)選用于這種治療的藥劑的制備中的用途。
本發(fā)明也包括制備本發(fā)明紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)的方法，該方法包括產(chǎn)生由氨基酸26-165(EPO 26-165)組成的糖基化EPO片段，和隨后融合所述片段與非糖基化但是優(yōu)選PEG化的由氨基酸1-28(EPO 1-28)組成的EPO片段。
發(fā)明的詳細描述術(shù)語“紅細胞生成素”(EPO)指有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2序列的蛋白質(zhì)，或者基本與其同源的蛋白質(zhì)或多肽，它們的生物學特性涉及刺激紅細胞產(chǎn)生和刺激骨髓中定向紅系祖先細胞分裂和分化。
術(shù)語“基本同源”意指特定的對象序列，例如突變序列由于一個到五個替換、缺失或添加而不同于參考序列，但所述差異的凈結(jié)果不會引起參考和對象序列間出現(xiàn)不利的功能不相似性。然而，如上所述，“基本同源”保留了潛在的糖基化位點Asn24，Asn38和Asn83。
人EPO有一個O-糖基化位點(在SEQ ID NO1的Ser126)和三個N-糖基化位點(在SEQ ID NO1的Asn24，Asn38和Asn83)。這些位點的糖基殘基被唾液?；?，并且它們對于體內(nèi)半衰期和隨后對于EPO的效力是重要的。除去Asn24糖基化位點導致具有改進的體內(nèi)效力的EPO突變蛋白。然而，根據(jù)本領域現(xiàn)有技術(shù)，只有通過將Asn24置換為不能被糖基化的另一氨基酸，才能產(chǎn)生這種EPO突變蛋白質(zhì)。因此，由于在序列敏感位置有修飾的氨基酸，這些突變蛋白質(zhì)不同于天然存在的EPO。例如，Nimtz，M.等，Eur.J.Biochem.213(1993)39-56；Sasaki，H.等，Biochemistry 27(1988)8618-8626；Delorme，C.等，Biochemistry 31(1992)9871-9876；Fibi，M.R.等，Blood 85(1995)1229-1236；和WO 99/11781(也參見EP 0 411 678；Takeuchi，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)7819-7822；EP 0 427189；EP 0 409 113；Dube，S.等，J.Biol.Chem.263(1988)17516-17521；Yamaguchi，K.等，J.Biol.Chem.266(1991)20434-20439；EP 0 640 619；和Fibi，M.R.等，Applied Microbiol.Biotechnol 35(1991)622-630)描述了這種具有修飾氨基酸序列和修飾糖基化的EPO突變蛋白質(zhì)。
因此，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，只要通過缺失、修飾或置換Asn24才可以阻止該氨基酸的糖基化?，F(xiàn)有技術(shù)中從沒有描述過保留了氨基酸Asn24，Asn38和Asn83但僅在Asn38和Asn83糖基化而在Asn24沒有糖基化的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，并且沒有教導如何去產(chǎn)生這種分子。
本發(fā)明提供了在從分子的Cys29開始的C-末端部分中保留了糖基化，優(yōu)選天然糖基化而在不超過Gly28的N-末端部分中未糖基化的EPO突變蛋白質(zhì)的簡單生產(chǎn)方法，由此，如果期望，還可以非常容易地以多種方式修飾所述N-末端部分。這種修飾可以是，例如可重復的且確定的側(cè)鏈如聚乙二醇連接。
術(shù)語“N-末端EPO片段”或“EPO 1-28”指基本由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2氨基酸第1-28位組成的EPO片段。如上所述，只要沒有不利地影響連接分子中EPO的藥學特性和只要保留了Asn24，并且在片段的序列C-末端保留Gly28，該術(shù)語也包括氨基酸序列中具有輕微修飾的片段(不超過約2個交換、添加、缺失)。
術(shù)語“C-末端EPO片段”或“EPO 29-165”指基本由SEQ ID NO1的氨基酸第29-165位或SEQ ID NO2的氨基酸第29-166位組成的EPO片段。如上所述，只要基本沒有影響連接分子中EPO的藥學特性和只要保留了Asn38和Asn83，并且Cys29被保留為所述片段的N-末端氨基酸，該術(shù)語也包括氨基酸序列中具有輕微修飾的片段(不超過約3個交換、添加、缺失)。
根據(jù)本發(fā)明，在真核細胞中重組產(chǎn)生從Cys29開始的紅細胞生成素C-末端部分，由此糖基化Asn38和Asn83，而通過化學反應體外合成從開始到Gly28的N-末端部分。
因此，本發(fā)明提供了EPO突變體產(chǎn)生的方法，所述方法的特征在于通過Gly28和Cys29間的化學連接來連接由保留了Asn24和Gly28的EPO氨基酸1-28組成的N-末端EPO片段和由在Asn38和Asn83糖基化的EPO氨基酸29-165或166組成的C-末端EPO片段，并分離EPO突變蛋白質(zhì)。
通過重組DNA技術(shù)在真核生物細胞中，例如在CHO，BHK或HeLa細胞系中表達，或者通過內(nèi)源基因激活，即通過內(nèi)源基因激活表達紅細胞生成素糖蛋白，可以制備重組C-末端EPO片段。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)基于人EPO序列。更優(yōu)選地，人EPO具有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列，最優(yōu)選為具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人EPO。
根據(jù)WO 99/05268和EP 1 037 821，優(yōu)選采用與產(chǎn)生全長EPO相同的方式在CHO細胞中產(chǎn)生C-末端EPO片段，或者也優(yōu)選通過人細胞的內(nèi)源基因激活來產(chǎn)生C-末端EPO片段。
N-末端EPO片段可以通過利用分步固相方法合成，并且從樹脂上切割下來并去保護。該片段可以通過色譜法，例如通過高效液相色譜法純化，并且通過例如在Schnoelzer，M.等，Int.J.Pept.Protein Res.40(1992)180-193；Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779；和Schnoelzer等，G.G.Fields(編輯)，固相肽合成，Methods Enzymology 289(1977)，(參見全卷)中所述的離子噴射質(zhì)譜法表征。該片段的C-末端優(yōu)選含有用于連接C-末端片段的Cys29的硫代羧基酯基團。
只要C-末端片段在氨基末端具有半胱氨酸殘基，優(yōu)選Cys29，則可以以簡單的方法，通過天然化學連接進行N-末端和C-末端EPO片段的連接(Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779)。根據(jù)該原則，N-末端片段在α-羧基基團處含有硫酯，并且受到C-末端片段的氨基末端Cys殘基側(cè)鏈的親核攻擊。開始的硫酯連接產(chǎn)物經(jīng)歷快速的分子內(nèi)反應，產(chǎn)生在連接位點具有天然肽鍵的產(chǎn)物。在Dawson，P.E.，和Kent，S.B.H.，AnnualReview of Biochemistry 69(2000)923-960中綜述了這種肽的化學連接方法。
根據(jù)Dawson，P.E.等，Science 266(1994)776-779，或者Dawson，P.E.等，J.Am.Chem.Soc.，119(1997)4325-4329，優(yōu)選在連接期間將N-末端EPO片段和C-末端EPO片段溶解在變性溶液，如鹽酸胍或脲中，并且進行連接。
通過常規(guī)方法如親和層析，大小排阻層析和離子交換層析進行連接的EPO突變蛋白質(zhì)的純化。
術(shù)語“PEG化”意指在多肽N-末端和/或賴氨酸20處聚乙二醇殘基的共價連接。蛋白質(zhì)的PEG化在現(xiàn)有技術(shù)中是廣泛公知的，并且，例如Veronese，F(xiàn).M.，Biomaterials 22(2001)405-417綜述了蛋白質(zhì)的PEG化?？梢岳貌煌倌芑鶊F和具有不同分子量的聚乙二醇、直鏈和支鏈的PEG及不同的連接基團連接PEG(也參見Francis，G.E.等，Int.J.Hematol.68(1998)1-18；Delgado，C.等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。
例如WO 00/44785中所述，可以在水溶液中利用PEG化試劑，優(yōu)選地，利用NHS-激活的5至40kDa分子量的直鏈或支鏈PEG分子進行N-末端片段的PEG化。根據(jù)Lu，Y.等，Reactive Polymers 22(1994)221-229，也可以在固相中進行PEG化。
這些方法產(chǎn)生了在Lys20的ε-氨基上和/或在N-末端氨基上PEG化的N-末端EPO片段。根據(jù)Felix，A.M.等，ACS Symp.Ser.680(Poly(ethyleneglycol))(1997)218-238，可以在N-末端氨基酸上進行選擇性PEG化。在固相合成期間，通過Nα-PEG化氨基酸衍生物和肽鏈N-1末端氨基酸的偶聯(lián)可以獲得選擇性N-末端PEG化。在固相合成期間，通過Nε-PEG化賴氨酸衍生物和生長鏈的偶聯(lián)可以進行側(cè)鏈PEG化。而按照以上固相合成中所述方法或通過在溶液相合成中將激活的PEG試劑應用到氨基去保護的肽上，可以獲得混合的N-末端和側(cè)鏈PEG化。適合的PEG衍生物是激活的PEG分子，其優(yōu)選具有從約5到約40kDa，更優(yōu)選從約20到約40kDa，最優(yōu)選約30kDa的平均分子量。PEG衍生物可以是直鏈或支鏈PEG。從Shearwater Polymers(Huntsville，AL，U.S.A.；www.swpolymers.com)可以獲得適于用在PEG-蛋白質(zhì)和PEG-肽綴合物制備中的各種PEG衍生物。
激活的PEG衍生物是現(xiàn)有技術(shù)已知的，并且，例如在Morpurgo，M.等，J.Bioconj.Chem.7(1996)363-368中對PEG-乙烯砜進行了描述。直鏈和支鏈PEG適于PEG化片段的制備。反應性PEG試劑的例子是碘代-乙?；?甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜(m優(yōu)選是從約450到約900的整數(shù)，R是直鏈或支鏈的、具有1到6個碳原子的低級烷基如甲基、乙基和異丙基等，其中優(yōu)選甲基) 或 這些碘激活的物質(zhì)的應用是本領域已知的并且Hermanson，G.T.在Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148中進行了描述。
最優(yōu)選地，利用(烷氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺，如甲氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺)(MW 30000；Shearwater Polymers，Inc.))，通過N-羥基琥珀酰亞胺酯活化PEG， 或
其中R和m如上所定義。
術(shù)語“烷氧基”指烷基醚基團，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基等，優(yōu)選甲氧基，其中術(shù)語“烷基”意指包含最多4個碳原子的直鏈或支鏈烷基基團。
通過本領域已知的方法，例如柱層析可以完成PEG化N末端片段的進一步純化，包括單或雙PEG化種類的分離。
此外，本發(fā)明涉及包含EPO突變蛋白質(zhì)或者如上所定義的組合物和藥物學上可接受的賦形劑，如緩沖液的含水組合物和藥物組合物，還涉及如上定義的EPO突變蛋白質(zhì)或組合物在藥物制備中的用途，所述藥物用于慢性腎衰竭患者(CRF)和AIDS中治療或預防貧血相關疾病，和用于化療癌癥患者的治療。此外，本發(fā)明涉及在慢性腎衰竭患者(CRF)、AIDS和進行化療的癌癥患者中對貧血相關疾病進行預防和/或治療的方法，該方法包括步驟以治療有效量給患者施用上述組合物。
術(shù)語“治療有效量”是對于引起骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學活性而言所必需的本發(fā)明紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)的量。紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)的確切量可以根據(jù)一些因素，如所治療疾病的確切類型、所治療患者的病情和組合物中的其它組分進行優(yōu)化。可以按照以各種方式向患血液疾病的人類患者給藥時的有效濃度，配制含有紅細胞生成素的藥物組合物，所述血液疾病以低或缺乏的紅細胞產(chǎn)生為特征。紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的平均治療有效量可以變化，并且特別應該以有資格醫(yī)師的建議和處方為基礎。
而且，本發(fā)明涉及任何時候通過上述方法制備的上述EPO突變蛋白質(zhì)和組合物，也涉及用于在慢性腎衰竭患者(CRF)、AIDS和進行化療的癌癥患者中治療貧血相關疾病的上述EPO突變蛋白質(zhì)和組合物。
可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)純化本發(fā)明的EPO片段和EPO突變蛋白質(zhì)。
在EP-A 0 267 678中描述了用于EPO純化的S-瓊脂糖凝膠上的離子交換層析，C8柱上的制備型反相HPLC和凝膠過濾層析。在這方面，通過S-瓊脂糖凝膠上的高速流動離子交換層析可以代替凝膠過濾層析。也建議在離子交換層析前在Blue Trisacryl柱上進行染色層析。Nobuo，I.等，J.Biochem.107(1990)352-359也描述了重組EPO純化的方法。然而，在該方法中，在純化前，用Tween20、苯甲磺酰氟、乙基馬來酰亞胺、胃蛋白酶抑制劑A、硫酸銅和草氨酸處理EPO。
可以通過本領域已知的各種測定法測定本發(fā)明EPO或EPO突變蛋白質(zhì)的比活性。本發(fā)明的純化EPO蛋白質(zhì)的生物學活性是指通過給人類患者注射給藥EPO蛋白質(zhì)，與未注射或?qū)φ战M對象相比引起骨髓細胞增加的網(wǎng)織紅細胞和紅細胞生產(chǎn)。通過Pharm.Europa Spec.Issue ErythropoietinBRP Bio 1997(2)的方法可以測定根據(jù)本發(fā)明獲得并純化的EPO突變蛋白質(zhì)或其片段的生物學活性。
在實施例5中描述了測定EPO活性的另一種生物學測定法，即，正常紅細胞性貧血小鼠測定法。
通過本領域已知的方法，本發(fā)明制備的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)可以與藥物學可接受載體或賦形劑一起制備成適于注射的藥物組合物。例如在WO 97/09996，WO 97/40850，WO 98/58660，和WO 99/07401中描述了適合的組合物。其中，用于配制本發(fā)明產(chǎn)品的優(yōu)選藥物學上可接受的載體是人血清白蛋白、人血漿蛋白質(zhì)等?？梢栽趐H 7，含有滲漲劑，例如132mM氯化鈉的10mM磷酸鈉/鉀緩沖液中配制本發(fā)明化合物?？蛇x地，藥物組合物可以含有防腐劑。藥物組合物可以含有不同量的紅細胞生成素，例如10-1000μg/ml，例如50μg或者400μg。
本發(fā)明紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的給藥將導致人體中紅細胞的形成。因此，紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的給藥補充了對紅細胞產(chǎn)生有重要作用的這種EPO蛋白質(zhì)?？梢园凑胀ㄟ^各種方式施用于血液疾病人類患者時的有效濃度，配制含有紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的藥物組合物，所述血液疾病完全或者作為疾病或病況的一部分以低或缺陷的紅細胞產(chǎn)生為特征?？梢酝ㄟ^注射，如通過皮下或靜脈內(nèi)注射給藥藥物組合物。紅細胞生成素糖蛋白產(chǎn)品的平均量可以變化，且特別應該以有資格醫(yī)師的建議和處方為基礎。綴合物的確切量可以根據(jù)一些因素，如所治療疾病的確切類型、所治療患者的病況和組合物中的其它組分來優(yōu)化。例如，可以每kg體重給藥0.01到10μg，優(yōu)選地，每kg體重0.1到1μg，例如每周一次。
在本申請中，參考了各種公開出版物。為了更充分描述現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，這里并入這些出版物中的記載為參考。
提供了下面的實施例，參考文獻和序列表以幫助理解本發(fā)明，在所附權(quán)利要求書中闡述了本發(fā)明真正的范圍。可以在不背離本發(fā)明精神的情況下對所述方法進行修改，這是可以理解的。
實施例1PEG化EPO(1-28)的產(chǎn)生Nα-PEG-CH2-CO-(Lys(PEG-CH2-CO)20)-EPO(1-28)αCOSBzl的合成和單PEG化組分的分離。
按文獻中所述(參見，Schnolzer，M.等，Int.J.Pept.Protein Res.40(1992)180；Schnlzer，P.M.等，G.G.Fields編輯，固相肽合成，Meth.Enzymol.289(1997)，全卷)，利用逐步固相方法合成肽，從樹脂上切下并去保護，通過高效液相色譜純化，并且通過離子噴射質(zhì)譜法進行表征，其中按照Lu，W.等，J.Am.Chem.Soc.，118(1996)8518-8523的途徑形成了C-末端芐基硫酯。
1.1 PEG-CH2-CO-NHS的合成如Lu，Y.A.，Int.J.Pept.Protein Res.43(1994)127-138所述，用N-羥基琥珀酰亞胺激活mPEG-CH2-COOH(CH3-(O-CH2-CH2)n-O-CH2COOH)。
環(huán)氧乙烷重復單位在n≈110的范圍內(nèi)以致產(chǎn)生5000的分子量(PEG5000)，或在n≈440(PEG20k)或n≈880(PEG40k)的范圍內(nèi)。
1.2 EPO(1-28)αCOSBzl的合成根據(jù)Lu，W.等，J.Am.Chem.Soc.，118(1996)8518-8523，用逐步固相合成法制備N-末端肽。BOC-Gly-(硫酯接頭)-氨基甲基-樹脂用于氨基酸的逐步連接。去保護和從樹脂上切下所得到的肽。
添加芐基溴以制備硫酯，然后通過HPLC純化。合并含有硫酯的組分，通過HPLC純化。
1.3 EPO(1-28)αCOSBzl的PEG化添加PEG-CH2-CO-NHS以在N-末端丙氨酸的α-NH2和第20位賴氨酸的ε-NH2上對肽進行N-?；７蛛x單和雙PEG化EPO(1-28)硫酯，通過HPLC純化，并凍干。
實施例2利用雙官能試劑對EPO(1-28)進行PEG化a)巰基的共價連接本實施例公開了巰基和片段共價連接的反應條件的確定。為了確定該條件，向片段EPO(1-28)αCOSBzl的溶液中，這里是向1ml于pH 7.3，10mM磷酸鉀，50mM NaCl中的5mg/ml片段中添加不同量含有被封閉的巰基的試劑，這里是SATA(乙酰硫代醋酸琥珀酰亞胺酯)或者SATP(乙酰硫代丙酸琥珀酰亞胺酯)(在DMSO中溶解，達到10mg/ml)。攪拌反應約30分鐘(25℃)，通過加入1M賴氨酸溶液至10mM終止反應。通過在pH 6.2，10mM磷酸鉀、50mM NaCl和2mM EDTA中透析除去多余量的SATA和SATP。用羥胺除去保護性乙酰基后，根據(jù)Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119(1967)41-49中所述方法用二硫代聯(lián)吡啶通過光度法測定共價連接片段的巰基數(shù)量。
b)活化的EPO(1-28)的PEG化在含有95mg活化的EPO的溶液(4.5mg/ml，于10mM磷酸鉀，50mM NaCl，2mM EDTA，pH 6.2中)中溶解380mg甲氧基-PEG-馬來酰亞胺(MW 30.000；Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville(Alabama，USA))。溶液中由此得到的活性片段和甲氧基-PEG-馬來酰亞胺間的摩爾比率是1∶4。通過添加1M羥胺水溶液到上述溶液中達到30mM，pH 6.2，使活性片段共價連接的封閉巰基解封閉。由此反應混合物溶液中得到的活性片段含有游離巰基(-SH)。進行巰基解封閉后，接著，立即進行現(xiàn)在含有游離巰基(-SH)的活性片段和甲氧基-PEG-馬來酰亞胺間的90分鐘偶聯(lián)反應(攪拌，25℃)。通過加入0.2M半胱氨酸水溶液到反應混合物中達到2mM，終止偶聯(lián)反應。30分鐘后，通過添加DMSO中的0.5M N-甲基馬來酰亞胺達到5mM濃度，封阻未與甲氧基-PEG-馬來酰亞胺反應的活性片段的過量游離巰基。30分鐘后，通過離子交換層析純化得到的現(xiàn)在含有PEG化片段的反應混合物，用10mM磷酸鉀，pH 7.5透析≥15小時。
實施例3EPO(29-165)的重組產(chǎn)生根據(jù)WO 99/05268的實施例1制備EPO(29-165)。
收獲和細胞分離利用批重新飼喂方法(batch refeed process)，即，當達到期望細胞密度時，收獲約80％的培養(yǎng)物。用新鮮培養(yǎng)基補充剩余的培養(yǎng)物，培養(yǎng)直到下一次收獲為止。一次生產(chǎn)過程由最多10次連續(xù)的收獲組成9次部分收獲和在發(fā)酵最后的1次全部收獲。每3-4天進行一次收獲。
轉(zhuǎn)移確定的收獲物體積進入冷卻的容器中。通過離心或過濾分離出細胞并棄去。在線過濾含有片段的離心步驟上清液，在第二個冷卻容器中收集。在純化期間單獨處理每次的收獲物。
實施例4連接和分離在pH 7.5，6M鹽酸胍，0.1M磷酸緩沖液中以約6mg/ml溶解等摩爾量的根據(jù)實施例1和2制備的PEG-EPO(1-28)COSBzl和EPO(29-165)。添加3％苯硫酚和1％卞硫醇(體積比)和過量DTT以使蛋白質(zhì)保持還原并連接約36小時直到反應完成。然后通過離子交換層析除去多余試劑。通過用6M鹽酸胍調(diào)整緩沖液和pH到約1mg/ml蛋白質(zhì)濃度，并且稀釋到大約0.2mg/ml實現(xiàn)蛋白質(zhì)的重新折疊。根據(jù)WO 01/02017的實施例1純化連接產(chǎn)物。
實施例5通過正常紅細胞性貧血小鼠測定法測定PEG化EPO的體內(nèi)活性給小鼠施用PEG-EPO、未修飾的EPO和緩沖溶液。結(jié)果表明PEG化EPO比未修飾EPO具有更高的活性和延長的半衰期，這是通過在每只小鼠利用相同劑量時網(wǎng)織紅細胞量的顯著增加和網(wǎng)織紅細胞計數(shù)最大值的遷移證明的。
正常紅細胞性貧血小鼠生物測定法是本領域已知的(Pharm.EuropaSpec.Issue Erythropoietin BRP BIO 1997(2))。用BSA-PBS稀釋樣品。皮下給藥7-15周齡的正常健康小鼠0.2ml如實施例4中所述的PEG化EPO。從給藥后72小時開始4天期間，通過穿刺尾部靜脈抽血，稀釋至在1ml的0.15μmol吖啶橙染色溶液中存在1μl血液。染色時間是3到10分鐘。通過紅色熒光直方圖(每30,000個分析的血細胞)分析，在流式細胞儀中通過顯微熒光測定法進行網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。每天每個研究組為5只小鼠，小鼠僅取血一次。
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序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.HOFFMANN-LA ROCHE AG)<120>聚乙二醇化和雙糖基化的紅細胞生成素<130>20971<140>
<141>
<150>EP01122555.4<151>2001-09-25<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>165<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165<210>2<211>166
<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16權(quán)利要求
1.具有使骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學活性的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其特征在于其在Asn38和Asn83位被N-糖基化而在Asn24位沒有N-糖基化。
2.如權(quán)利要求1所述的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其特征在于其在N-末端氨基基團和/或Lys20的ε-氨基基團上與低級烷氧基聚(乙二醇)基團連接。
3.如權(quán)利要求2所述的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其中每個聚(乙二醇)部分的平均分子量是約5千道爾頓到約40千道爾頓。
4.如權(quán)利要求2所述的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其中每個聚(乙二醇)部分的平均分子量是約30千道爾頓。
5.如權(quán)利要求2至4所述的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其中聚(乙二醇)部分通過甲氧基封端。
6.如前述任一權(quán)利要求所述的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
7.包含紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)和藥物學上可接受緩沖液的含水組合物，其中所述突變蛋白質(zhì)具有使骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學活性，并且其特征在于在Asn38和Asn74位具有N-糖基化而在Asn24位沒有N-糖基化。
8.如權(quán)利要求7所述的含水組合物，其特征在于所述紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)在N-末端氨基基團和/或Lys20的ε-氨基基團上與低級烷氧基聚(乙二醇)基團連接。
9.包含權(quán)利要求1至8任一項所述的突變蛋白質(zhì)或組合物及藥物學上可接受賦形劑的藥物組合物。
10.權(quán)利要求1至8任一項所述的突變蛋白質(zhì)或組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預防慢性腎衰竭患者(CRF)、AIDS中的貧血相關疾病和用于治療經(jīng)歷化療的癌癥患者。
11.紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，其特征在于通過Gly28和Cys29間形成化學鍵來連接由保留了Asn24和Gly28的紅細胞生成素氨基酸第1-28位組成的N-末端紅細胞生成素片段和由在Asn38和Asn83被糖基化且保留了Cys29的紅細胞生成素氨基酸第29-165位或166位組成的C-末端紅細胞生成素片段，分離紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述N-末端片段在紅細胞生成素序列的N-末端和/或Lys20位被PEG化。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于通過化學合成產(chǎn)生所述N-末端片段。
14.如權(quán)利要求11至13所述的方法，其特征在于通過重組基因表達產(chǎn)生所述C-末端片段。
15.這里所限定的本發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有使骨髓細胞增加網(wǎng)織紅細胞和紅細胞產(chǎn)生的體內(nèi)生物學活性的紅細胞生成素突變蛋白質(zhì)，其特征在于其在Asn38位被N－糖基化而在Asn24位沒有N－糖基化。這種突變蛋白質(zhì)具有改進的藥物特性。
文檔編號A61K47/48GK1558952SQ02818752
公開日2004年12月29日 申請日期2002年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月25日
發(fā)明者W·蒂舍爾, W 蒂舍爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 弗 哈夫曼-拉羅切有限公司