專利名稱：逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衰老生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及如何逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案。
背景技術(shù)：
隨著年齡的不斷增長(zhǎng)，我們的黑發(fā)會(huì)逐漸變白，皮膚皺紋逐漸增多，視力、記憶力以及對(duì)微生物的抵抗力會(huì)逐漸下降，同時(shí)，癌癥、糖尿病、心腦血管病的發(fā)病概率也會(huì)逐年上升，導(dǎo)致這種變化的罪魁禍?zhǔn)资莻€(gè)體中的成體干細(xì)胞衰老了。同時(shí)，衰老也是造成某些遺傳病在特定年齡發(fā)病的原因。干細(xì)胞的自我更新潛能和多向分化與增殖潛能的不足是造成自體成體干細(xì)胞移植療效不理想的原因，而衰老是導(dǎo)致自我更新潛能和多向分化與增殖潛能不足的原因。因此，如何在體外逆轉(zhuǎn)成體干細(xì)胞衰老是自體成體干細(xì)胞移植成敗的關(guān)鍵。衰老生物學(xué)的最終目的是征服衰老，但一般人都會(huì)認(rèn)為，衰老是自然規(guī)律，是不可抗拒的！我卻不以為然，因?yàn)樵谧匀磺闆r下，水只能往下流，人只能走向衰老，這就是所謂的自然規(guī)律！然而，人為用水泵能夠使水往高處流，因此，人為讓衰老逆轉(zhuǎn)有什么不可能的呢？生物衰老的機(jī)制較復(fù)雜，眾說紛紜，至今還沒定論，因此，要想逆轉(zhuǎn)衰老，首先必須要有一個(gè)比較完善的學(xué)說或理論作為設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)衰老的科學(xué)依據(jù)，為此，在提出設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)衰老的方案之前，本文必須要先用較大的篇幅來說明衰老的機(jī)制。即使在生理?xiàng)l件下很少分裂的肝細(xì)胞，估計(jì)平均200 300天更新一次(Bucher 和Malt，1971)，這是因?yàn)榧?xì)胞中的DNA突變頻率很高，再加上細(xì)胞垃圾和衰老等原因造成的死亡。因此，事實(shí)上，我們體內(nèi)每天都有大量的細(xì)胞被免疫系統(tǒng)清除掉，但同時(shí)也有等量的細(xì)胞通過增殖(即自我復(fù)制、自我更新)和分化來補(bǔ)充，因此，個(gè)體衰老不但不是由細(xì)胞死亡造成的，而且還向我們提示個(gè)體中的任何器官組織都有負(fù)責(zé)為它補(bǔ)充各種細(xì)胞的干細(xì)胞。每種生物的生長(zhǎng)發(fā)育成熟衰老都有一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定有序的時(shí)間表，因此，衰老不可能是細(xì)胞DNA突變累積中毒或磨損一類帶有時(shí)空偶然性的因素造成的，而應(yīng)該是一種有選擇性和計(jì)劃性的程序，基因是按照程序性地進(jìn)行表達(dá)的。隨著年齡的不斷增長(zhǎng)，不但個(gè)體中的細(xì)胞總的基因表達(dá)能力在下降，而且個(gè)體中的同一分化性狀的細(xì)胞在不同發(fā)育時(shí)期(或空間分布)會(huì)相續(xù)表達(dá)和關(guān)閉不同的基因， 如人的肝細(xì)胞在胎兒期主要表達(dá)甲胎蛋白，出生后到成年期就把甲胎蛋白基因關(guān)閉，轉(zhuǎn)而主要表達(dá)白蛋白，到了老年期，白蛋白基因也逐漸關(guān)閉，同時(shí)開始逐漸表達(dá)一些晚期基因，因此，細(xì)胞衰老主要表現(xiàn)是“基因的表達(dá)效率下降和表達(dá)的種類的改變”，這種程序性的基因表達(dá)現(xiàn)象稱基因的順序表達(dá)(sequential expression)差次表達(dá)(differential expression)，其本質(zhì)就是一種程序。據(jù)此，我把個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育成熟衰老的一個(gè)有序的周期稱為“生命周期程序”。我們知道，要使計(jì)算機(jī)中存儲(chǔ)在硬盤中的程序運(yùn)作起來，硬盤驅(qū)動(dòng)器中就設(shè)置有一臺(tái)電動(dòng)機(jī)，由電動(dòng)機(jī)產(chǎn)生的推力來驅(qū)動(dòng)硬盤旋轉(zhuǎn)。推動(dòng)計(jì)算機(jī)程序運(yùn)作的
3動(dòng)力來自電動(dòng)機(jī)，那么，推動(dòng)生命周期程序運(yùn)作的動(dòng)力來自那里呢？只有弄清這個(gè)問題才能找到徹底征服衰老的方法。為此，下面我提出了衰老的“生命周期程序驅(qū)動(dòng)學(xué)說”。個(gè)體的生命周期程序的組成包括細(xì)胞分化和細(xì)胞衰老。細(xì)胞一級(jí)一級(jí)地向前分化，并表達(dá)出不同的基因，這是一種程序；細(xì)胞衰老過程，不但基因的表達(dá)效率在下降，而且不同的基因的表達(dá)也是有先后順序的，這也是一種程序。細(xì)胞衰老與細(xì)胞分化關(guān)系密切細(xì)胞衰老能增加細(xì)胞分化率，直至某些組織中的某些成體干細(xì)胞完全消失；細(xì)胞分化時(shí)，細(xì)胞中的端粒酶(telomerase)活性會(huì)下降，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老。綜上所述我認(rèn)為，細(xì)胞衰老與細(xì)胞分化要結(jié)合起來研究才能解闡明個(gè)體衰老的原因。下面把個(gè)體發(fā)育中的細(xì)胞衰老和細(xì)胞分化與計(jì)算機(jī)程序的運(yùn)作原理做一比較，對(duì)衰老機(jī)制進(jìn)行大概描述一般來說，作為基因原件的啟動(dòng)子高甲基化能阻抑轉(zhuǎn)錄，內(nèi)含子高甲基化則能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，反之亦然。因此，DNA甲基化與否可以決定基因表達(dá)與否(打開/關(guān)閉)，這相當(dāng)于計(jì)算機(jī)程序指令的0或1 (開/關(guān))，因此，在受精卵重新編寫細(xì)胞分化程序時(shí)，必須全部刪除DNA上所有的甲基基團(tuán)(指令)，為此，有一種稱去甲基化酶的酶使卵裂期基因組全面去甲基。去甲基后的基因組就像一張白紙(空盤)，就可以重新刻錄程序指令了，于是，大約在胚胎植入子宮的時(shí)候，有一種稱構(gòu)建性甲基化酶(establishment methylase)的酶使細(xì)胞內(nèi)的DNA重新甲基化(R. jaenisch, 1997)，即重編程，至此，生命周期程序就編寫好了。但是，細(xì)胞中已編寫好的生命周期程序，如果沒有一個(gè)驅(qū)動(dòng)裝置，就像計(jì)算機(jī)的硬盤驅(qū)動(dòng)器中沒有電動(dòng)機(jī)一樣，會(huì)使程序指令無法順序讀取的，即細(xì)胞狀態(tài)只能停留在某一水平。已有很多證據(jù)表明，位于染色體兩端稱為“端?！?telomere)的重復(fù)DNA，它的長(zhǎng)度會(huì)隨著細(xì)胞分裂而縮短，而且它的長(zhǎng)度與細(xì)胞的活力(基因的表達(dá)活性)呈正相關(guān)，因此，當(dāng)端粒長(zhǎng)度發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞的活力也會(huì)隨著發(fā)生梯度變化，這相當(dāng)于產(chǎn)生了一股推動(dòng)推力， 也就是說，端粒長(zhǎng)度發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生一股推動(dòng)生命周期程序運(yùn)作的推力。因此，作為生殖細(xì)胞的精子，它的端粒長(zhǎng)度從精子干細(xì)胞的91Λ以下一次性地延伸到151Λ，以備維持將來發(fā)育成個(gè)體中的整個(gè)生命周期的消耗。為了使甲基化型式相同的受精卵在分化后產(chǎn)生差異，卵細(xì)胞質(zhì)中就準(zhǔn)備了幾種稱為“決定子”的調(diào)節(jié)分化的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞分裂過程中不均等地分配到子細(xì)胞，選擇性地將子細(xì)胞中的不同的組織特異性基因的調(diào)節(jié)區(qū)低甲基化的添加甲基，或高甲基化的去甲基 (我認(rèn)為這就是導(dǎo)致分化的細(xì)胞基因選擇性表達(dá)的根本原因)，于是，子細(xì)胞的DNA各自產(chǎn)生了不同的甲基化型式，以此選擇性地打開或關(guān)閉(遏制或活化)不同的組織特異性基因， 于是，不同的子細(xì)胞合成了不同的蛋白質(zhì)，由此產(chǎn)生出了中胚層、內(nèi)胚層和外胚層的不同類型的細(xì)胞。知識(shí)鏈接0ct3/4基因在胚胎干細(xì)胞有表達(dá)活性，而成體干細(xì)胞則不表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，與胚胎干細(xì)胞相反，成體干細(xì)胞0ct3/4基因的調(diào)節(jié)區(qū)出現(xiàn)了 DNA甲基化；已觀察到哺乳動(dòng)物DNA甲基化型式是組織專一性的。由于端粒的不斷縮短，就推動(dòng)了細(xì)胞不斷地向前分化，使這些早期的分化細(xì)胞又按照各自的分化路線(或分化程序)通過體細(xì)胞中的各種調(diào)節(jié)分化的蛋白質(zhì)一步一步地修改原有的甲基化型式，即關(guān)閉上級(jí)基因并啟動(dòng)下級(jí)基因，使一種細(xì)胞通過級(jí)聯(lián)方式不斷地向前分化成200多種細(xì)胞并構(gòu)成人體。
知識(shí)鏈接造血干細(xì)胞的⑶34+細(xì)胞和⑶34-細(xì)胞的甲基化型式是不一樣的，在 CD34+細(xì)胞基因組中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的DNA序列的甲基化水平很低，而兩側(cè)的序列則多被高度甲基化。也就是說，CD34+細(xì)胞在調(diào)節(jié)分化的蛋白的作用下已修改了甲基化型式，不可逆地分化成了⑶34-細(xì)胞。嚴(yán)格地說，⑶34+和⑶34-細(xì)胞已經(jīng)是不同的細(xì)胞了。在細(xì)胞增殖時(shí)，為了讓子細(xì)胞保持和親代相同的克隆，不同的甲基化型式必須要一成不變地一起復(fù)制才能保持特異的分化性狀的穩(wěn)定不變，為此，有一種稱維持性甲基化酶(maintenance methylase)的酶，通過以“甲基化維持”的方式將新的甲基化型式傳遞到每個(gè)子細(xì)胞的DNA上(復(fù)印)。端粒酶的活性與細(xì)胞的活力呈正相關(guān)，由于癌細(xì)胞的端粒酶活性很高，因此，許多癌細(xì)胞的端粒雖然比正常細(xì)胞還短，但細(xì)胞活力卻和胚胎細(xì)胞一樣高。也就是說，端粒酶能夠代償端粒的作用。但端粒酶的活性要受到端粒長(zhǎng)度或癌基因的調(diào)控，而不能自作主張，因此，決定衰老的初始因素還是端粒，而非端粒酶。端粒長(zhǎng)度(或端粒酶活性)變化會(huì)推動(dòng)生命周期程序運(yùn)作的證據(jù)β -半乳糖苷酶(晚期基因的產(chǎn)物)的含量在衰老的細(xì)胞內(nèi)是升高的。B0rdner(1998)把端粒酶的催化亞基hTRT基因?qū)肴艘暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和包皮成纖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中的β -半乳糖苷酶含量就會(huì)減少，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)年輕的表形，這相當(dāng)于生命周期程序開倒車了 ；終末分化細(xì)胞是不能發(fā)生進(jìn)一步分化的，但在個(gè)體生命中的不同時(shí)期，基因表達(dá)也不相同，已經(jīng)證明這種調(diào)節(jié)是受到端粒長(zhǎng)度所左右，因?yàn)椴环至训慕K末細(xì)胞端粒也會(huì)縮短(Von Zglinicki等人， 1995 ；Von Zglinicki,1998)。因此，端粒長(zhǎng)度的不同，基因的表達(dá)活性和表達(dá)種類也不同，隨著端粒的不斷縮短，基因的表達(dá)活性和表達(dá)種類也隨著不斷改變，即基因的程序性表達(dá)。也就是說，端?？s短產(chǎn)生了一種推動(dòng)力，推動(dòng)著生命周期程序中的基因群進(jìn)行程序性表達(dá)(順序表達(dá)、差次表達(dá))?；蛘哒f，不同的端粒長(zhǎng)度(或端粒酶活性)決定著不同的基因群的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制與細(xì)胞分化不同，是具有高度的可逆性，而細(xì)胞分化通常是不可逆的。以肝細(xì)胞為例，在端粒最長(zhǎng)的胚胎期，主要表達(dá)甲胎蛋白。在端粒中等長(zhǎng)度的成年期，甲胎蛋白停止表達(dá)，轉(zhuǎn)而表達(dá)白蛋白。在端粒最短的老年期，白蛋白基因逐漸停止表達(dá)， 轉(zhuǎn)而表達(dá)一些對(duì)細(xì)胞有害的基因。由于白蛋白是我們正常生理不可缺少的蛋白質(zhì)，因此，當(dāng)白蛋白基因停止表達(dá)到一定程度，機(jī)體就會(huì)停止運(yùn)作，也就是我們的死期，衰老死亡大體就是這么簡(jiǎn)單。通俗地說，當(dāng)細(xì)胞衰老到一定程度，細(xì)胞就不能應(yīng)付日常事務(wù)。由于個(gè)體是由細(xì)胞組成的，因此，當(dāng)大多數(shù)體細(xì)胞衰老到一定程度，個(gè)體就會(huì)變得老態(tài)龍鐘，直至死亡。端?？s短導(dǎo)致基因總體表達(dá)能力下降的機(jī)制是因端?？s短間接導(dǎo)致組蛋白乙酰化、磷酸化水平下降，從而使組蛋白與DNA結(jié)合的更緊密，以致基因轉(zhuǎn)錄效率下降。例如，叢羽生教授發(fā)現(xiàn)單單端粒酶催化亞基就可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)錄。而生長(zhǎng)因子類 (生長(zhǎng)因子又可激活端粒酶)可激活組蛋白脫乙?；富蛄姿峄浮６肆？s短導(dǎo)致基因表達(dá)種類改變的機(jī)制是某些能夠同時(shí)正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子的基因，它的表達(dá)活性的變化與端粒長(zhǎng)度(或端粒酶活性)呈正相關(guān)，這樣，隨著端粒的不斷縮短，基因自然就會(huì)出現(xiàn)順序表達(dá)。例如，myc基因的產(chǎn)物具有轉(zhuǎn)錄子作用，它的活性與端粒長(zhǎng)度或端粒酶活性呈正相關(guān)，而且myc能夠同時(shí)正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，如myc可同時(shí)正調(diào)節(jié)a-胸腺素的轉(zhuǎn)錄、hsp70啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄和負(fù)調(diào)節(jié)金屬硫蛋白轉(zhuǎn)錄、前a2膠原蛋白和neu基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。這樣，當(dāng)myc表達(dá)活性上升時(shí)，a_胸腺素等基因表達(dá)活性上升，同時(shí)金屬硫蛋白等表達(dá)活性下降，反之亦然。由細(xì)胞分化導(dǎo)致的基因的順序表達(dá)通常是不可逆的，而由端粒縮短或端粒酶活性下降導(dǎo)致的基因的順序表達(dá)是高度可逆的。例如，給成年期的肝細(xì)胞添加生長(zhǎng)因子(可激活端粒酶)或端粒酶激活劑就會(huì)恢復(fù)表達(dá)胚胎期特有的甲胎蛋白，撤去生長(zhǎng)因子或端粒酶激活劑，又會(huì)恢復(fù)表達(dá)白蛋白。端?？s短所致的基因的順序表達(dá)就是推動(dòng)細(xì)胞不斷向前一級(jí)一級(jí)地分化下去的推力；因此，癌細(xì)胞由于端粒不會(huì)進(jìn)一步地縮短，細(xì)胞分化只能停滯不前。胚胎發(fā)育過程細(xì)胞分化最頻繁，因此，胚胎期細(xì)胞端粒的縮短速度高于成人期和老年期。綜上所述我認(rèn)為，個(gè)體中的成體干細(xì)胞的端?？s短就是造成個(gè)體衰老的原因。鏈接原生殖細(xì)胞(PGCs)的DNA不含甲基，是真正的無分化的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)成胚胎干細(xì)胞(ES，ES是未分化的細(xì)胞)，據(jù)上述重編程機(jī)理，我和傅文慶等人曾經(jīng)設(shè)想用去甲基方法制造PGCs (黃必錄.個(gè)體發(fā)育和端粒.中國(guó)老年病雜志，2008，5(1) :57.)，也許DNA 不經(jīng)去甲基化而直接全甲基化也能制造ES，原理是合子去甲基后不含甲基的DNA又在構(gòu)建性甲基化酶的作用下重新甲基化會(huì)變成ES，據(jù)此可以用構(gòu)建性甲基化酶把成體干細(xì)胞因細(xì)胞分化而失去甲基化的一部分DNA補(bǔ)上甲基，使DNA有著和胚胎干細(xì)胞相同的甲基化模式， 然后再把它誘導(dǎo)成各種組織干細(xì)胞。Gadd45ac是一種功能為維持基因組穩(wěn)定性。DNA修復(fù)及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的細(xì)胞核內(nèi)蛋白，Gadd45ac過量表達(dá)會(huì)激活甲基化沉默報(bào)告質(zhì)粒，并且使全部的DNA去甲基化(我從網(wǎng)上收集的)。細(xì)胞衰老或抑制DNA甲基化的藥物也會(huì)使細(xì)胞DNA甲基化水平下降，但是，細(xì)胞必須設(shè)法保留DNA上與細(xì)胞分化類型有關(guān)的基因的那部分甲基，即不能完全清除DNA上的甲基，否則，細(xì)胞的特異分化性狀會(huì)失真。例如，反復(fù)用能抑制DNA甲基化的5-雜氮-脫氧胞嘧啶(5-aza-dC)來降低小鼠永生細(xì)胞系C3H10T1/2的DNA甲基化水平時(shí)不可能降到零(最低到 0. 45% ) (Flatau 等人，1984)。由于細(xì)胞衰老或抑制DNA甲基化的藥物也會(huì)使細(xì)胞DNA甲基化水平下降，因此有人就認(rèn)為DNA甲基化水平下降是造成細(xì)胞衰老的原因，細(xì)胞衰老的分子鐘有可能是DNA甲基化的丟失。我認(rèn)為DNA甲基化的丟失只是細(xì)胞衰老的一種伴生現(xiàn)象而已，而不是造成細(xì)胞衰老的原因。依據(jù)是，用SV40感染及大T抗原(兩者都會(huì)激活端粒酶)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老時(shí)， 甲基化水平會(huì)重新上升(Matsumura等人，1989)。下面介紹各種與衰老爭(zhēng)議有關(guān)的問題1、由于正常的體細(xì)胞每分裂一次，端粒就會(huì)縮短一小段，因此，很多研究者認(rèn)為端粒的作用是相當(dāng)于細(xì)胞分裂的計(jì)數(shù)器(時(shí)鐘)。然而，癌細(xì)胞分裂時(shí)，端粒已經(jīng)不會(huì)再進(jìn)一步地縮短，而細(xì)胞分裂卻從來沒有停下來，據(jù)此，把端粒看作細(xì)胞分裂的計(jì)數(shù)器是不正確的。2、細(xì)胞的分化與增殖兩者是處于對(duì)立統(tǒng)一的，增殖處于優(yōu)勢(shì)時(shí)，分化則受到抑制， 反之亦然。由于端粒和端粒酶是司增殖的，因此，端?？s短或端粒酶活性下降可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞衰老和細(xì)胞分化。而高度惡性的癌細(xì)胞由于端粒酶或端粒保持在較高的水平，細(xì)胞衰老和細(xì)胞分化只能停滯不前(當(dāng)然，癌細(xì)胞也能分化，如胚胎癌細(xì)胞(EC細(xì)胞)可分化成多種類型的細(xì)胞，但前提是端粒酶活性必須要下降，即犧牲了增殖力)。精母細(xì)胞和成體干細(xì)胞都含有端粒酶，但只有精母細(xì)胞的端粒才能凈延伸，而成體干細(xì)胞的端粒照樣會(huì)不斷縮短，原因是成體干細(xì)胞在每次細(xì)胞分裂時(shí)，端粒的縮短量大于延伸量，其意義是個(gè)體的正常生理需要細(xì)胞分化，如果成體干細(xì)胞端粒不會(huì)縮短，細(xì)胞分化就會(huì)停滯而會(huì)弓I起個(gè)體死亡。利用端粒酶的催化亞基hTRT基因?qū)爰?xì)胞已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的長(zhǎng)生不老，但是，這些長(zhǎng)生不老的細(xì)胞是不能用來使個(gè)體返老還童的，原因是(1)正常生理需要細(xì)胞分化，而這些細(xì)胞由于端粒酶活性不受控制地持續(xù)保持高活性，細(xì)胞就無法分化；( 這些細(xì)胞的端粒實(shí)際上并沒有因?yàn)槎肆Ｃ富钚陨叨玫窖由欤绻啡?dǎo)入的端粒酶催化亞基基因，細(xì)胞會(huì)馬上回復(fù)到之前的衰老程度。3、對(duì)于一些不分裂的終末細(xì)胞的衰老，是否與端粒有關(guān)？我認(rèn)為在探討個(gè)體衰老的原因時(shí)，并不需要完全了解終末細(xì)胞等非干細(xì)胞衰老死亡的確切機(jī)制，因?yàn)閺膫€(gè)體水平來說，無論這些細(xì)胞是怎樣衰老死亡的，也不是導(dǎo)致個(gè)體衰老的原因，因?yàn)橛伤ダ系仍蚨鴮?dǎo)致死亡掉的非干細(xì)胞可以由成體干通過細(xì)胞分化來補(bǔ)充；同樣，成體干細(xì)胞因各種原因死亡也不是造成個(gè)體衰老的原因，因?yàn)樗劳龅舻某审w干細(xì)胞也可以由成體干細(xì)胞通過自我復(fù)制來補(bǔ)充。事實(shí)上，人體每天都有大量的干細(xì)胞和非干細(xì)胞因各種原因而死亡，同時(shí)也有相應(yīng)數(shù)量的細(xì)胞補(bǔ)充。也就是說，個(gè)體的衰老與細(xì)胞死亡無關(guān)；或者說人體的衰老不是像機(jī)器那樣是由磨損造成的。造成終末細(xì)胞老化死亡的原因有(1)已發(fā)現(xiàn)端粒不經(jīng)細(xì)胞分裂也會(huì)縮短；(2) DNA突變；(3)代謝廢物積累，例如，某些神經(jīng)元的脂褐素(LF)可隨年齡增長(zhǎng)而恒定地增多， 而且它的增多到一定水平時(shí)可使RNA含量減少，這樣會(huì)使蛋白質(zhì)合成功能下降，結(jié)果和端?？s短造成的衰老是等效的。4、隨著個(gè)體越來越衰老，組織中的成體干細(xì)胞的數(shù)量就會(huì)越來越少，直到某些成體干細(xì)胞完全消失(據(jù)此，對(duì)于高齡的老人，在治療衰老時(shí)必須補(bǔ)充已經(jīng)消失的某種成體干細(xì)胞)。這是因?yàn)槎肆？s短會(huì)導(dǎo)致成體干細(xì)胞的自我更新率逐漸低于分化率。但成體干細(xì)胞數(shù)量下降不是造成個(gè)體衰老的原因，因?yàn)橥ㄟ^射線殺死動(dòng)物組織中的成體干細(xì)胞，并不會(huì)加速動(dòng)物衰老速度，而只能使動(dòng)物變得虛弱。如果射線劑量低于致死量，動(dòng)物的壽命反而會(huì)延長(zhǎng)。造成這種現(xiàn)象英文稱hormesis。5、隨著人的年齡的增加，組織中成體干細(xì)胞的各種潛能會(huì)逐漸縮小，這是造成老年人組織的修復(fù)能力不如年輕人的原因，同時(shí)也是造成用成體干細(xì)胞移植治療心臟病等疾病并不能分化成完備的心肌細(xì)胞等細(xì)胞的原因。導(dǎo)致成體干細(xì)胞各種潛能縮小的原因與基因的表達(dá)活性和表達(dá)譜系的改變有關(guān)， 而這又與端粒的縮短有關(guān)。例如，造血干細(xì)胞的端粒越短，端粒酶的活性就越低，重構(gòu)造血能力和增殖能也越低。當(dāng)然，只要端粒再度延伸，這種退化是可逆轉(zhuǎn)的。6、清除自由基的抗氧化劑不能改變動(dòng)物的最大壽限，原因是雖然抗氧化劑會(huì)增加細(xì)胞分裂次數(shù)，但同時(shí)會(huì)縮短分裂時(shí)間。因此，自由基不是導(dǎo)致衰老的真正原因，而僅僅是加速衰老的一個(gè)因素而已。細(xì)胞衰老時(shí)，清除自由基的酶的基因會(huì)逐漸關(guān)閉，從而導(dǎo)致自由基猖獗為害。如果衰老的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)年輕，自由清除酶的基因也會(huì)重新打開，例如，癌細(xì)胞中清除自由基的酶的活性和胎兒細(xì)胞一樣高。已證明自由基是通過加速端粒縮短速度來降低細(xì)胞分裂次數(shù)的。7、在年輕人的細(xì)胞中，突變的線粒體DNA是不會(huì)累積的。此外，在復(fù)制旺盛的干細(xì)胞中，突變的線粒體DNA會(huì)發(fā)生復(fù)制分離(implicative segregation)現(xiàn)象，使突變的DNA 逐漸減少。因此，線粒體DNA突變累積不是造成衰老的真正原因，而僅僅是加速衰老的一個(gè)繼發(fā)或伴生現(xiàn)象而已。8、在個(gè)體水平中，突變的細(xì)胞核的DNA :(1)可以修復(fù)；(2) —旦修復(fù)不好就會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；(3)如果既修復(fù)不好也不發(fā)生凋亡，最終會(huì)被免疫細(xì)胞清除，因此，年輕的個(gè)體是不存在突變的細(xì)胞累積的問題。也就是說，造成個(gè)體突變的細(xì)胞的累積的真正原因是免疫系統(tǒng)的衰老，從而導(dǎo)使突變的細(xì)胞不能有效地清除。而造成免疫系統(tǒng)的衰老的真正原因是成體干細(xì)胞的衰老；脂褐素被認(rèn)為是不能降解的細(xì)胞垃圾，已發(fā)現(xiàn)也能降解。對(duì)已堆積脂褐素的小鼠給藥50天，結(jié)果脂褐素含量顯著下降(曾南等，1997)；年輕的細(xì)胞會(huì)旺盛地分泌膠原酶等酶來更新細(xì)胞間質(zhì)，因此，細(xì)胞間質(zhì)成分的堆積也不是造成衰老的真正原因。此外，內(nèi)分泌功能退化或紊亂學(xué)說、神經(jīng)系統(tǒng)退化學(xué)說等等等等都不是導(dǎo)致衰老的真正原因， 而只能算是衰老的繼發(fā)因素或衰老的伴生現(xiàn)象而已，因?yàn)樯镌陂L(zhǎng)期進(jìn)化的過程中，已進(jìn)化出了一套完善的防御和凈化系統(tǒng)，只因細(xì)胞衰老才導(dǎo)致這套防御和凈化系統(tǒng)的功能發(fā)生退化，從而使一些能夠加速衰老的因素猖獗為害。當(dāng)然，如果能夠使人體內(nèi)的多能成體干細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度恢復(fù)到年輕人的水平，這些防御系統(tǒng)的功能也會(huì)恢復(fù)到年輕人的水平，各種衰老的伴生、繼發(fā)現(xiàn)象也會(huì)不攻自破。9、生物進(jìn)化需要基因突變，因此，精子不但能夠突變，而且還能夠把突變株保留下來，睪丸屏障就是為了使精子能夠與免疫系統(tǒng)保持隔絕，以防止突變的細(xì)胞株被免疫細(xì)胞清除(即純化)。然后精子通過賽跑競(jìng)爭(zhēng)，優(yōu)勝劣汰，只有強(qiáng)壯的精子才能與卵子結(jié)合。由于生殖細(xì)胞是徹底返老還童的細(xì)胞，據(jù)此可說明，突變不是導(dǎo)致衰老的原因之一，或者說生殖細(xì)胞是通過修復(fù)基因突變來實(shí)現(xiàn)返老還童的理論是錯(cuò)誤的。10、許多教科書把癌細(xì)胞看作未分化、無分化、去分化或異分化的細(xì)胞都是錯(cuò)誤的，因?yàn)榘┘?xì)胞還保留著起源組織的特有分化標(biāo)志，例如，成人的肝癌細(xì)胞仍然會(huì)表達(dá)胎肝細(xì)胞特有的代謝譜和酶的量分布譜，而且一旦除去致癌因素，就會(huì)恢復(fù)成正常的成人肝細(xì)胞。據(jù)此我認(rèn)為，把癌細(xì)胞看作是逆轉(zhuǎn)衰老的超年輕化或幼稚化的細(xì)胞才是正確的。11、許多教科書把免疫球蛋白基因和T細(xì)胞受體基因的重排現(xiàn)象視為是細(xì)胞分化中基因選擇性表達(dá)的原因是錯(cuò)誤的，因?yàn)槊庖咔虻鞍谆蚝蚑細(xì)胞受體基因的重排只涉及到翻譯成蛋白質(zhì)部分的DNA進(jìn)行與抗原對(duì)應(yīng)匹配的調(diào)整，而并沒有涉及到這些基因的轉(zhuǎn)錄與否(開/關(guān))的調(diào)控。12、有人把染色質(zhì)特異部位的組蛋白的甲基化、乙?；约稗D(zhuǎn)錄、翻譯和加工等過程的特異調(diào)控因子視為細(xì)胞分化中基因選擇性表達(dá)的第一因素是錯(cuò)誤的，因?yàn)閰⑴c這些環(huán)節(jié)的特異調(diào)控因子本身是不穩(wěn)定和易降解的，為此，這些特異調(diào)控因子還需要依賴基因的選擇性表達(dá)才能把分化性狀長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持下去，這樣問題又來了 是什么因素使這些特異調(diào)控因子的基因發(fā)生選擇性表達(dá)？問題又繞回到原地，無限循環(huán)。13、入選驅(qū)動(dòng)生命周期程序運(yùn)作的驅(qū)動(dòng)物質(zhì)必須要滿足6個(gè)要求(1)細(xì)胞分裂時(shí)它必須能復(fù)制一份，以便每個(gè)子細(xì)胞都有一份；(2)它必須在生殖細(xì)胞中預(yù)先儲(chǔ)備，而且儲(chǔ)量在個(gè)體的所有細(xì)胞中須最多，以便足夠?qū)韨€(gè)體的整個(gè)生命周期的消耗(如果是單純?yōu)榱私鉀Q染色體“末端隱縮問題”，在體細(xì)胞分裂的同時(shí)，端粒丟失多少可以補(bǔ)充多少，而無需在生殖細(xì)胞中作一次性的補(bǔ)充。例如，單細(xì)胞的生物在細(xì)胞分裂時(shí)，端粒丟失多少就可以同時(shí)補(bǔ)充多少。據(jù)此，在生殖細(xì)胞中大幅度延伸端粒的現(xiàn)象反而可以證明端粒與衰老有關(guān))； (3)體細(xì)胞每分裂一次，它必須消耗掉一部分，而且不能同時(shí)等量地一邊消耗和一邊補(bǔ)充， 而只能單向消耗或消耗量大于補(bǔ)充量。這是因?yàn)槿绻瑫r(shí)消耗量和補(bǔ)充量一樣多，就不能產(chǎn)生“濃度差信息”(計(jì)算機(jī)程序是靠電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)的，生命周期程序是靠化學(xué)濃度差來驅(qū)動(dòng)的)，基因也就無法進(jìn)行差次表達(dá)(順序表達(dá))，而基因無法順序表達(dá)，個(gè)體發(fā)育也就不能進(jìn)行，生物只能停滯在單細(xì)胞水平(這就是返老還童藥至今沒有出現(xiàn)的原因)。單細(xì)胞生物不會(huì)發(fā)生分化和衰老就是因?yàn)檫@個(gè)原因。據(jù)此，要使衰老個(gè)體逆轉(zhuǎn)年輕，端粒只能以單向一次性方式凈延伸。即衰老不能停滯在某一水平，要么進(jìn)行衰老，要么逆轉(zhuǎn)衰老(例如，水母類、 海鞘類等眾多的低等生物利用了長(zhǎng)時(shí)間饑餓的單向一次性的方式來實(shí)現(xiàn)返老還童；據(jù)報(bào)道，2011年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)“燈塔水母”(Turritopsis Nutricula)夠返老還童，在達(dá)到性成熟年齡完成交配之后會(huì)以單向一次性的方式實(shí)現(xiàn)返老還童。(4)各種導(dǎo)致細(xì)胞衰老的因素必須最終都是通過消耗它的儲(chǔ)量起作用的，例如，自由基會(huì)加速端?？s短速度；細(xì)胞中各種DNA 突變、細(xì)胞垃圾中毒等等導(dǎo)致細(xì)胞死亡，干細(xì)胞為了補(bǔ)充死亡的細(xì)胞就會(huì)提高分裂頻率，而細(xì)胞分裂會(huì)導(dǎo)致端?？s短；限食可減緩端?？s短速度；女性比男性長(zhǎng)壽是因?yàn)楹哪鼙饶行陨?，故女性端?？s短速度低于男性；目前已發(fā)現(xiàn)60多種基因與衰老有關(guān)，如抑癌基因P53、 P21、Rb等等，如P53、Rb等高表達(dá)時(shí)細(xì)胞端粒縮短加速；( 分子的穩(wěn)定性要極好，沒有半衰期，因?yàn)閭€(gè)體的壽命長(zhǎng)達(dá)百年，它必須要能陪襯終身；(6)它的儲(chǔ)量的多少能夠左右基因的轉(zhuǎn)錄速率，例如，Daniel Gottschling(1994)發(fā)現(xiàn)端粒會(huì)影響附近基因轉(zhuǎn)錄；叢羽生教授發(fā)現(xiàn)單單端粒酶催化亞基就可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)錄。已知端粒完全能夠滿足上述的6個(gè)要求。有一個(gè)稱重復(fù)基因利用枯竭的衰老假說認(rèn)為，編碼阻遏DNA抑制劑基因表達(dá)的基因有許多拷貝，細(xì)胞每分裂一次，它就會(huì)喪失一份或數(shù)份拷貝，隨著分裂次數(shù)的增多，拷貝越來越少，最后阻遏物濃度下降到不足以阻遏DNA抑制劑產(chǎn)生時(shí)，DNA抑制劑就大量表達(dá)， 最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。該假說與端粒學(xué)說的模式是相類似的，可以說端粒學(xué)說是該假說的修正版。14、果蠅和其它雙翅目昆蟲中的DNA不發(fā)生甲基化，它們細(xì)胞分化基因的選擇性表達(dá)的機(jī)制只能與DNA序列的改變有關(guān)，比如靠改變基因調(diào)節(jié)區(qū)中某些重復(fù)DNA序列的重復(fù)次數(shù)或插入轉(zhuǎn)座子等元件來決定基因的開或關(guān)的。但采用DNA甲基化與否的調(diào)節(jié)方式更具靈活性，故會(huì)被生物普遍采用。15、采用DNA甲基化或改變DNA序列都能符合細(xì)胞分化的4個(gè)要求(1)在細(xì)胞分裂時(shí)它能復(fù)制一份，以便每個(gè)子細(xì)胞都有一份；( 能受到調(diào)節(jié)分化的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)；(3) 具有基因開關(guān)的作用。(4)分子的穩(wěn)定性極好，這樣才能保持細(xì)胞分化后其性狀具有很好的穩(wěn)定性，例如，神經(jīng)細(xì)胞壽命幾乎與人相當(dāng)，其分化性狀也能保持終身不變(多數(shù)教科書認(rèn)為細(xì)胞分化后其性狀是通過正反饋機(jī)制來保持穩(wěn)定的，但實(shí)驗(yàn)卻否定了這一假說)。16、兄弟姐妹的排行，老大壽命往往相對(duì)比較長(zhǎng)，身材比較矮小，排行越小壽命就
9越短，這種現(xiàn)象規(guī)律性很明顯，因此不可能是基因突變?cè)斐傻摹Ｔ斐膳判性叫勖驮蕉痰脑蚩赡苁悄挲g較大的父母的生殖細(xì)胞因?yàn)樗ダ鲜箻?gòu)建性甲基化酶不足，致使某些基因的 DNA甲基化不足，以及生殖細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的不足所造成的。例如，克隆動(dòng)物出生前往往體型過大、易早衰、易患病和夭折，為此，英國(guó)羅斯林研究所的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，造成這種現(xiàn)象是一種稱為Igf2r蛋白質(zhì)的基因上缺乏甲基而導(dǎo)致過表達(dá)。Igf2r過表達(dá)會(huì)引起胎兒過度生長(zhǎng)和死胎。此外，克隆羊多莉的端粒也比同齡羊短20%。17、細(xì)胞衰老并非只發(fā)生在生命的末期，而是貫穿整個(gè)生命周期，因?yàn)榧?xì)胞衰老可以啟動(dòng)細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育，例如，松果體釋放的激素會(huì)抑制性腺活動(dòng)，人到了 10 14歲， 松果體因衰老而發(fā)生退化，于是性腺就開始發(fā)育了 ；胚胎中的胰島素樣生長(zhǎng)因子因細(xì)胞衰老導(dǎo)致合成下降，可使胚胎腎臟的一部分細(xì)胞凋亡，以此使腎臟管道化。18、關(guān)于癌癥發(fā)生的前因后果的解釋比較混亂，為此我必須要梳理一下2008年初，《細(xì)胞》(CELL)雜志有一專刊，認(rèn)為把端粒長(zhǎng)度控制在細(xì)胞分裂20次左右可保持不生癌。我認(rèn)為這一設(shè)想是錯(cuò)誤的。癌基因是正常細(xì)胞不可缺少的基因，在細(xì)胞的正常增殖過程起到關(guān)鍵作用，據(jù)此可以說沒有什么癌基因，而應(yīng)該把癌基因改稱為“細(xì)胞增殖基因”。大多數(shù)的癌基因被激活時(shí)，端粒酶的活性會(huì)升高。兒童患癌的幾率比老年人低很多，且兒童的癌基因和端粒酶的表達(dá)活性比老年人高得多；已知再生過程癌基因表達(dá)會(huì)升高。把蠑螈的眼睛的晶體剔除，把很強(qiáng)的致癌物質(zhì)注入眼球中，結(jié)果沒有生癌，而出現(xiàn)晶體再生(江口吾朗、渡邊憲二，1986)。 因此，癌基因表達(dá)活性的高低與癌癥的發(fā)病率無關(guān)，因?yàn)樵诎┗蚝投肆Ｃ富钚愿叩募?xì)胞中，細(xì)胞的抗氧化能力和DNA的修復(fù)能力顯著高于癌基因表達(dá)活性低的細(xì)胞。同樣，論端粒長(zhǎng)度，兒童比老年人長(zhǎng)，癌基因表達(dá)活性、端粒酶活性也高于老年人，細(xì)胞的抗氧化能力、 DNA修復(fù)能力及免疫力也比老年人高，故癌癥發(fā)生率」L童比老年人低。此外，有很多可以激活癌基因和端粒酶的物質(zhì)反而是很好的抗癌藥，如植物血凝素(PHA)。所謂的衰老基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十個(gè)，大多數(shù)是抑癌基因，這些基因是通過影響端粒長(zhǎng)度來影響細(xì)胞壽命的，據(jù)此可以說這些都不是決定衰老的基因或說沒有什么衰老基因。但是，各種能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的因素確實(shí)會(huì)提高癌癥的發(fā)生概率，如激素、生長(zhǎng)因子、蛋白激酶C激活劑等等，這些因素主要是通過激活端粒酶來促進(jìn)細(xì)胞增殖的，但端粒酶仍然不是導(dǎo)致癌癥的真兇，而是細(xì)胞在增殖過程中，染色體和DNA在復(fù)制時(shí)更容易發(fā)生損傷。而一些致癌的化學(xué)物質(zhì)或物理因素則是通過增加染色體和DNA的損傷率來增加癌癥發(fā)病概率的。抑癌基因P53較特殊，不能把它看成一般的抑癌基因，它是通過修復(fù)和清除突變的細(xì)胞來降低癌癥發(fā)病率，延長(zhǎng)個(gè)體壽命。而非通過抑制端粒酶來降低癌癥發(fā)病率的， 相反，P53在修復(fù)細(xì)胞因放射線輻射等因素而導(dǎo)致的DNA損傷時(shí)，端粒酶的活性反而顯著升尚ο知識(shí)鏈接細(xì)胞中產(chǎn)生微核是染色體出現(xiàn)損傷的標(biāo)志，目前國(guó)際專家還在爭(zhēng)議手機(jī)產(chǎn)生的電磁輻射能否致癌？我認(rèn)為這要看看手機(jī)用的電磁波的頻段能否誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生微核？以及微核數(shù)量。作為抗氧化劑的維生素E能降低微核率，這也許是抗氧化劑能抗癌的緣由。在細(xì)胞水平上，引起細(xì)胞癌變的基本原因是癌基因因各種原因而導(dǎo)致持續(xù)地過表達(dá)。而導(dǎo)致個(gè)體生癌的主要原因是免疫系統(tǒng)功能低下或有缺陷。在同一環(huán)境下，某些人容易患上癌癥，某些人卻不容易患上癌癥，這是遺傳易感性，即基因出了問題，使細(xì)胞容易突變， 或/和免疫系統(tǒng)功能低下。19、如果說端粒只起到保護(hù)染色體基因組穩(wěn)定性的作用，而與衰老無關(guān)，那么，當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，染色體基因組就會(huì)變得不穩(wěn)定而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或癌變。據(jù)此，即使端粒與衰老無關(guān)，要想逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老和防止細(xì)胞癌變，就必須要先延伸端粒，否則任何措施都無法挽救衰老與癌變。20、不但個(gè)體中的不同器官的衰老速度不一致，而且同一器官或同一組織的不同部位的細(xì)胞衰老速度也不一致，例如，人頭部的不同部位的頭發(fā)變白的時(shí)間是不一致的；眉毛、毫毛和頭發(fā)都是毛發(fā)，但長(zhǎng)度與直徑卻各不不相同，這說明同樣是生長(zhǎng)毛發(fā)的干細(xì)胞， 分化性狀只有相似而沒有完全相同。造成這一現(xiàn)象的原因可能與細(xì)胞分化性狀的細(xì)微差異有關(guān)，而這些差異又進(jìn)一步?jīng)Q定相應(yīng)細(xì)胞的端粒的縮短速度。這和再生區(qū)域編碼理論差不多，該理論認(rèn)為，個(gè)體由眾多區(qū)域鑲嵌而成，每一區(qū)域具有自己特定的遺傳編碼(Slack， 1980)。因此，來自個(gè)體同一部位的間充質(zhì)干細(xì)胞，能否完全分化和替代個(gè)體的所有的器官組織的功能還是未知數(shù)。21、一般認(rèn)為鼠類的衰老與端?；蚨肆Ｃ笩o關(guān)，我認(rèn)為鼠類的衰老也與端?？s短或端粒酶活性降低有關(guān)(黃必錄.端粒衰老學(xué)說具有普適性.中國(guó)老年病雜志，2006， 3(2) :101.)。2011年中央電視臺(tái)10套《科技之光》報(bào)道，美國(guó)斯坦福大學(xué)科學(xué)家成功用端粒酶激活劑使相當(dāng)人80歲的小鼠發(fā)生返老還童，這如果是真實(shí)的，就可以證明鼠類的衰老與端粒是有關(guān)的。我把這一消息告訴福建師大傅文慶教授，傅教授說“我購(gòu)買了這篇文章的原文并已閱讀。意思是在生命早期就阻止端粒酶基因表達(dá)，青年期小鼠就像老年期小鼠一樣衰老(早衰)；然后用4-羥基三苯氧胺重新激活端粒酶基因，早衰小鼠又重新回到青年期”。鼠類端粒較人類長(zhǎng)，而且在細(xì)胞衰老過程端?？s短幅度較小，但壽命反而比人類短，這可能是鼠類基因的表達(dá)活性與端粒長(zhǎng)度的劑量關(guān)系比人類高效，就像同一種藥物，同一劑量，有的人對(duì)它敏感，有的人對(duì)它不敏感。22、限制能量的攝入可以延長(zhǎng)小鼠最大壽命一倍，由于線粒體在進(jìn)行能量代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，已證明自由基可使端?？s短，作為自由基清除劑的維生素E也能使培養(yǎng)的細(xì)胞分裂次數(shù)增加一倍，于是科學(xué)家就認(rèn)為限制能量攝入導(dǎo)致動(dòng)物壽命延長(zhǎng)的機(jī)制是通過減少自由基對(duì)端粒的破壞。但自由基清除劑并不能延長(zhǎng)動(dòng)物的最大壽限(Harman， 1960)，因此，把限制能量的攝入的延壽機(jī)制歸結(jié)于是減少自由基對(duì)端粒的破壞是不完全正確的。由于各種DNA合成抑制因素都會(huì)加速端粒的縮短、衰老的細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生DNA合成的抑制劑、用促進(jìn)DNA合成的物質(zhì)也能顯著提高動(dòng)物的壽命。據(jù)此我認(rèn)為(黃必錄.衰老的機(jī)理意義及治療.燕京醫(yī)學(xué)通訊，1998 ；66 :1056，本文約3萬字，介紹了許多衰老領(lǐng)域的前沿理論，是內(nèi)部刊物，要索取本文請(qǐng)到燕京函授醫(yī)學(xué)院，地址北京市海淀區(qū)復(fù)興路21號(hào)(公主墳西北側(cè)衛(wèi)國(guó)中學(xué)內(nèi)))能量代謝主要是通過4個(gè)抑制DNA合成的途徑來縮短動(dòng)物壽命的，舉例(1)攝入能量越多，能量代謝也越快，產(chǎn)生的三磷酸腺苷(ATP)也越多，ATP能反饋性地抑制其它核苷酸的磷酸化，從而產(chǎn)生阻抑DNA的合成效應(yīng)。造成自由基清除劑如維生素E能使培養(yǎng)的細(xì)胞分裂次數(shù)增加一倍但卻不能使個(gè)體的壽命提高一倍的原因是(1)維生素E在提高細(xì)胞分裂次數(shù)的同時(shí)又提高了細(xì)胞分裂頻率，以致在一定時(shí)期內(nèi)提高了細(xì)胞的分裂次數(shù)；(2)個(gè)體內(nèi)的維生素E的濃度不能像培養(yǎng)液那樣高。23、在細(xì)胞水平，缺乏端粒酶活性的細(xì)胞，端?？s短速度比端粒酶活性高的細(xì)胞更快。但在個(gè)體水平，胚胎期端?？s短速度比成人期和老年期快一倍以上，而且胚胎期的(胚胎體細(xì)胞有端粒酶活性)端粒酶活性比成人期和老年期高，這與一般認(rèn)為端粒酶活性高， 端?？s短速度就慢相違背。由于端粒酶活性的高低與細(xì)胞分裂頻率呈正相關(guān)，而且細(xì)胞有絲分裂是造成端?？s短的原因，因此，胚胎細(xì)胞因端粒酶活性比較高，在一定時(shí)期內(nèi)細(xì)胞分裂次數(shù)就多，這樣就會(huì)造成胚胎端?？s短速度比成人期和老年期快。此外，端粒酶活性和端粒結(jié)合蛋白 (TRFl)的活性是呈正相關(guān)的。因此，端粒酶雖可延伸端粒，但TRFl卻會(huì)抑制端粒延伸，兩功互相抵消甚至端粒縮短的更快，這也是導(dǎo)致胚胎細(xì)胞端粒酶活性雖高，端粒卻縮短的更快。上述的美國(guó)斯坦福大學(xué)用端粒酶抑制劑使小鼠早衰，然后用端粒酶激活劑又使它恢復(fù)年輕，其原因也是抑制端粒酶活性時(shí)，個(gè)體在同一時(shí)間下端?？s短速度并沒有加快，因此，重新激活端粒酶時(shí)，小鼠就會(huì)恢復(fù)青春。這也是一些人根據(jù)實(shí)驗(yàn)誤認(rèn)為端?；蚨肆Ｃ概c鼠類衰老無關(guān)的原因。既然端粒酶活性升高對(duì)延緩端?？s短速度作用不大，那干細(xì)胞為什么還要保持端粒酶的活性？我認(rèn)為端粒酶的主要作用是因不同類型的細(xì)胞需要不同的分裂活性和不同的端粒長(zhǎng)度，而保持不同類型細(xì)胞端粒酶的不同活性就可以調(diào)制出不同的細(xì)胞分裂活性和不同的端粒長(zhǎng)度。下面介紹幾種延伸干細(xì)胞端粒的途徑1、用體細(xì)胞制造全能干細(xì)胞，再把全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成多能成體干細(xì)胞，如具有多向分化潛能的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，然后把多能成體干細(xì)胞移植入人體內(nèi)。2007年，日本和美國(guó)科學(xué)家把0Ct3/4、SOX2、C-myC等基因傳染小鼠成纖細(xì)胞后出現(xiàn)重編程，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有類似ES的功能特點(diǎn)，稱為誘導(dǎo)全能干細(xì)胞(iPS)，iPS可能是由 0ct3/4, Sox2等基因通過間接激活去甲基化酶、構(gòu)建性甲基化酶、端粒延伸有關(guān)的酶等基因，使基因組經(jīng)歷了全面去甲基化和重新甲基化，即重新編制細(xì)胞分化程序(重編程)，并延伸端粒(儲(chǔ)備足夠長(zhǎng)度的端粒)。c-myc已證明可以直接誘導(dǎo)端粒酶催化亞基基因表達(dá)?；騻魅痉ㄞD(zhuǎn)化的iPS效率很低，有致癌風(fēng)險(xiǎn)，2010年，美國(guó)哈佛大學(xué)科學(xué)家用人工合成的0ct3/4，SoX2等基因的mRNA誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，轉(zhuǎn)化iPS的效率比基因傳染方法提高了 40 100倍，速度提高2倍，也沒有至癌風(fēng)險(xiǎn)。原生殖細(xì)胞癌(畸胎癌)可多方向分化，例如在瘤內(nèi)可以見到許不產(chǎn)同的組織。原生殖細(xì)胞癌中能夠誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的0ct4基因有表達(dá)，而體細(xì)胞該基因是處于關(guān)閉狀態(tài)， 細(xì)胞中的DNA也是非甲基化的。因此，用原生殖細(xì)胞癌的胞質(zhì)體(Cytoplast)與體細(xì)胞的核體(Karyoplast)融合也有可能誘導(dǎo)細(xì)胞重編程。如果能從培養(yǎng)的畸胎癌中抽提出脫分化物質(zhì)和各種決定子，先把體細(xì)胞脫分化(去甲基化)，然后往脫分化后的細(xì)胞添加相應(yīng)的決定子來制造我們所需要的細(xì)胞，如添加造血干細(xì)胞決定子，就分化成造血干細(xì)胞……。我曾經(jīng)(黃必錄.燕京醫(yī)學(xué)通訊，1998 ；66 =1058,1060)提出，轉(zhuǎn)化(年輕化)的干細(xì)胞可能會(huì)表達(dá)胎兒免疫沒有識(shí)別的胚性抗原，會(huì)引發(fā)免疫排斥?！秴⒖枷ⅰ穲?bào)2011. 5. 16 日第七版題為“人工干細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)失敗”，的報(bào)道英國(guó)科學(xué)家把iPS移植到小鼠體內(nèi)遭到排斥，原因是0ct3/4基因的產(chǎn)物是胚胎干細(xì)胞獨(dú)有的，沒有經(jīng)過胎兒免疫識(shí)別，在成人沒有表達(dá)，并且用病毒載體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的iPS遭到排斥的強(qiáng)度比mRNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的iPS強(qiáng)。我認(rèn)為剛誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的iPS需要培養(yǎng)一段時(shí)間，使0ct3/4基因停止表達(dá)后再移植到個(gè)體內(nèi)就可避免免疫排斥。2、抽提老年人衰老的多能成體干細(xì)胞(如具有幾乎具有全能性的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞)，在體外培養(yǎng)的條件下設(shè)法讓它的端粒長(zhǎng)度延伸到141Λ左右，然后再把成體干細(xì)胞的懸浮液注回老年人體內(nèi)，成體干細(xì)胞會(huì)通過血液循環(huán)并自動(dòng)遷移和定居到相應(yīng)的器官組織中。在器官組織中的少量幼稚的多能成體干細(xì)胞，一方面通過細(xì)胞自我復(fù)制以增加組織中年輕的多能成體干細(xì)胞的基數(shù)，另一方面通過細(xì)胞分化以替代組織中衰老的非干細(xì)胞。細(xì)胞分化是個(gè)體正常生理所必須的，而端?？s短是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞不斷向前分化的推力。因此，體細(xì)胞必須要想出一套防止端粒凈延伸的辦法，以防止體胞端粒因各種問題而發(fā)生凈延伸所造成的細(xì)胞分化的停滯或倒開車(即癌變)。曲于成體干細(xì)胞含有能夠延伸端粒的端粒酶，因此，就必定有相應(yīng)的抑制端粒延伸的負(fù)調(diào)控因子。我認(rèn)為只要設(shè)法打破與端粒長(zhǎng)度有關(guān)的的正調(diào)節(jié)因子與負(fù)調(diào)節(jié)因子的平衡，使正調(diào)節(jié)水平大于負(fù)調(diào)節(jié)水平，人類也能像水母類、海鞘類等低等動(dòng)物在一定條件下實(shí)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的返老還童。瑞士科學(xué)家Q011)發(fā)現(xiàn)，端粒會(huì)以自身的DNA作為模板合成RNA，細(xì)胞處于這種狀態(tài)時(shí)會(huì)影響端粒的延伸，因此，這也算是端粒長(zhǎng)度的負(fù)調(diào)控因子。前蘇聯(lián)曾經(jīng)有人用能抑制 RNA合成而不抑制DNA合成的橄欖霉素喂養(yǎng)果蠅，使果蠅壽命延長(zhǎng)20 30%，這可能與抑制端粒合成RNA有關(guān)吧。很多低等動(dòng)物都有很強(qiáng)的再生能力，水螅身體的碎片能再生為完整的個(gè)體；渦蟲身體1/100的切片也能再生成完整的個(gè)體；蝸牛饑餓時(shí)，可自消化內(nèi)部器官及肌肉作為營(yíng)養(yǎng)，一旦獲得食物，各器官可再生復(fù)原。這是因?yàn)樵谶@些動(dòng)物的組織中含有“全能成體干細(xì)胞”。如果人體也含有能分化成所有器官組織中的干細(xì)胞的全能成體干細(xì)胞，那么只要讓這一種全能成體干細(xì)胞返老還童，個(gè)體就會(huì)跟著發(fā)生返老還童，這樣，逆轉(zhuǎn)個(gè)體衰老將變得非常容易。小鼠用致死量的放射線照射時(shí)，包括骨髓在內(nèi)的全身所有的器官組織中的成體干細(xì)胞都會(huì)被射線殺死，但只要移植骨髓就可以讓小鼠活下來，這提示骨髓中也許有一二種干細(xì)胞可以分化成個(gè)體所有器官組織中的成體干細(xì)胞。幸運(yùn)的是，在鼠類、人類骨髓和皮膚中，美國(guó)和日本科學(xué)家分別發(fā)現(xiàn)兩種相當(dāng)于全能成體干細(xì)胞，稱邁阿密細(xì)胞(Miami)和繆斯細(xì)胞(Muse)，它們也能分化為具有內(nèi)臟中胚層、神經(jīng)外胚層和內(nèi)胚層特征的細(xì)胞。缺點(diǎn)是這些全能成體干細(xì)胞的數(shù)量太少，增殖緩慢， 而且老年人更少。細(xì)胞中的端粒酶的活性越高，細(xì)胞增殖活性越大，而且端粒酶在細(xì)胞增殖過程起到?jīng)Q定性的因素，因此，可以向培養(yǎng)的Muse中添加端粒酶催化亞基試劑，促使Muse大量擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增到一定數(shù)量時(shí)停止供應(yīng)端粒酶催化亞基，細(xì)胞馬上會(huì)停止分裂。導(dǎo)致正常細(xì)胞癌
13變的機(jī)制是因?yàn)榛蛲蛔?、癌基因插入、以及病毒的寄生等造成端粒酶不可控地持續(xù)高表達(dá)，使細(xì)胞不停地分裂。因此，用端粒酶催化亞基試劑即能擴(kuò)增干細(xì)胞，又不會(huì)引起細(xì)胞癌變。由于細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長(zhǎng)度呈正相關(guān)，因此，端粒越長(zhǎng)，干細(xì)胞的用量可以越少。據(jù)此，我們可以把自體衰老的Muse分離出來，在離體培養(yǎng)的條件下設(shè)法把端粒延伸到 141Λ，然后只要把含有少量Muse的懸浮液從血管注入到自體，Muse隨著血液循環(huán)移居回骨髓等組織中并自我復(fù)制，以增加骨髓等組織中的Muse基數(shù)，同時(shí)年輕的Muse再分化成造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞，再由造血干細(xì)胞等干細(xì)胞通過遷移和分化來更新個(gè)體所有的器官組織的細(xì)胞，使整個(gè)個(gè)體逐漸返老還童。精子的端粒長(zhǎng)度是151Λ，受精卵分裂成多能成體干細(xì)胞端粒會(huì)縮短一些，因此， iPS的端粒必須要設(shè)法延伸到151Λ ；兒童成體多能干細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度為131Λ，經(jīng)過增殖后會(huì)縮短，因此，治療用的Muse的端粒長(zhǎng)度至少要達(dá)到141Λ。體細(xì)胞包含有很多DNA正常株和突變株，由于突變株是無法鑒定和分離出來的， 因此必須同時(shí)向患者體內(nèi)注射由許多個(gè)自體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的iPS所分化的多能成體干細(xì)胞或年輕化的自體多能成體干細(xì)胞，其中的突變株會(huì)被人體的免疫系統(tǒng)清除而得到純化。3、直接在人體內(nèi)把組織中的多能成體干細(xì)胞的端粒延伸到我們想要的長(zhǎng)度(即設(shè)定逆轉(zhuǎn)的目標(biāo)年齡)。4、我曾經(jīng)設(shè)想(黃必錄.燕京醫(yī)學(xué)通訊，1998 ；66 :1063)用老年人自身的體細(xì)胞克隆出的克隆人胚胎，在胚胎發(fā)育到幾百克并形成免疫耐受時(shí)，且又還未產(chǎn)生意識(shí)時(shí)分離出各種多能成體干細(xì)胞(包括免疫細(xì)胞)移植入人體內(nèi)。本方案優(yōu)點(diǎn)是不存在免疫排斥問題，又能恢復(fù)免疫力，也省去對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化成多能成體干細(xì)胞的工序。下面是比較容易延伸端粒的方案1、激活癌基因激活癌基因可以激活端粒酶，同時(shí)也會(huì)降低cAMP和升高cGMP，使各種成體干細(xì)胞自我復(fù)制率大于分化率，從而增加組織中的成體干細(xì)胞數(shù)量，使衰老的組織細(xì)胞逐漸逆轉(zhuǎn)年輕(黃必錄.燕京醫(yī)學(xué)通訊，1998 ；66 1058 1060)。2010年8月8日《參考消息》報(bào)第7版標(biāo)題為“新技術(shù)能使肢體再生夢(mèng)成真？，， 說美國(guó)斯坦福大學(xué)一研究小組用激活癌基因方法成功的使小鼠肌肉細(xì)胞逆轉(zhuǎn)年輕。我把這一消息告訴福建師大傅文床教授，傅教授告訴我，我的1998年的文章的觀點(diǎn)，是在我國(guó)童坦君院士的實(shí)驗(yàn)性文章0篇)寄到《生物化學(xué)雜志》之后(尚未發(fā)表)提出的。激活癌基因可以通過激活端粒酶來延伸端粒的，也可以通過同源重組來延伸端粒。例如，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)抑制抑癌基因P16表達(dá)可使端?？s短減緩，但并沒有出現(xiàn)端粒酶活性升高；已知無端粒酶的肺癌也有P16基因突變。抑制P16基因延伸端粒的機(jī)制與抑癌基因Rb有關(guān)。由于P16和Rb之間有代償作用，據(jù)此我認(rèn)為P16和Rb要同時(shí)抑制。黃芪堿 (HDTIC)可使P16基因表達(dá)下降。同樣是空心菜(蕹菜)，不同的品種在對(duì)能激活逆轉(zhuǎn)衰老的措施時(shí)的反應(yīng)靈敏度也不一樣，如大葉空心菜扦插株不會(huì)逆轉(zhuǎn)衰老，而小葉空心菜(又稱藤蕹)扦插株會(huì)完全逆轉(zhuǎn)衰老。大葉空心菜是小葉空心菜突變種，因?yàn)榛蛲蛔兌シ道线€童的能力；某些低等動(dòng)物靠分身繁殖或長(zhǎng)時(shí)間饑餓會(huì)逆轉(zhuǎn)衰老，而高等動(dòng)物卻不能。這可能是小葉空心菜或低等動(dòng)物響應(yīng)返老還童的信號(hào)通路比高等生物更靈敏。據(jù)此，可用藥物抑制抑癌基因的方法來激活人體細(xì)胞內(nèi)的癌基因，并使激活強(qiáng)度超過能夠使端粒發(fā)生凈延伸的閾值。但不要去抑制抑癌基因P53。2、抑制TRFl活性已發(fā)現(xiàn)人類端粒有2種結(jié)合蛋白質(zhì)，TRFl和TRF2，以及幾種具有調(diào)節(jié)端粒結(jié)合蛋白作用的端粒相關(guān)蛋白。TRFl會(huì)與端粒DNA結(jié)合在一起，使端粒酶或DNA重組酶無法接近端粒末端發(fā)揮作用，因此，TRFl是端粒延伸的負(fù)調(diào)控因子。早期卵裂胚胎中可見一種稱為Rad50的DNA結(jié)合蛋白與TRFl共區(qū)域化，此時(shí)端粒酶活性雖然喪失，但端粒卻通過了同源重組而得到快速延伸。在囊胚期，Rad50減少，而端粒酶活性增加，但端粒卻緩慢延長(zhǎng)。我國(guó)黃河教授等發(fā)現(xiàn)， TRFl表達(dá)量與腫瘤端粒酶活性呈正相關(guān)。因此，多數(shù)癌細(xì)胞的端粒比正常細(xì)胞還短的原因與TRFl高表達(dá)有關(guān)。而合成TRFl突變體的細(xì)胞株端粒則較長(zhǎng)。精母細(xì)胞的端粒DNA是裸露的DNA，沒有端粒結(jié)合蛋白，因此，端粒酶可以充分地接近端粒末端并高效地延伸端粒，因此，精子的端粒最長(zhǎng)。Susan Smith等人報(bào)道，在人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種稱之為tankyrase的酶，該酶可以修改TRFl，使TRFl不能與端粒DNA結(jié)合，從而使端粒延伸。tankyrse在胞漿和胞核都有分布。據(jù)此，可用TRFl的反義寡核苷酸、抗體、或tankyrase及tankyrase的基因質(zhì)粒來抑制或修改體內(nèi)或體外培養(yǎng)的多能成體干細(xì)胞的TRF1，并同時(shí)激活端粒酶(起增效作用)， 使端粒發(fā)生凈延伸。本方具有專一性，只針對(duì)具有端粒酶活性的各種干細(xì)胞起作用。TRFl的反義寡核苷酸和TRFl的抗體一起使用效果更好，反義寡核苷酸抑制表達(dá) TRFl基因表達(dá)，抗體與已有的TRFl結(jié)合，以達(dá)到徹底消除TRFl的效果。向培養(yǎng)的多能成體干細(xì)胞注入tankyrase的基因和端粒酶的催化亞基hTRT基因構(gòu)建的一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體、或人工合成的tankyrase與hTRT的mRNA、或tankyrase與hTRT 的蛋白也許是延伸端粒最好的辦法。注意，由于TRFl是端粒延伸的負(fù)調(diào)控因子，據(jù)此，很多人很容易想到用TRFl的抑制物質(zhì)來延伸成體干細(xì)胞端粒，但是，如果沒有同時(shí)激活端粒酶，端粒延伸的效果還是微乎其微的。3、向細(xì)胞轉(zhuǎn)染預(yù)合成的端粒DNA片斷大約有2%的癌細(xì)胞不含端粒酶(I hySu，1999)。因此，生殖細(xì)胞有可能是靠同源重組來快速延伸端粒的，否則，體細(xì)胞中不會(huì)存在這種延伸端粒機(jī)制的基因組合，以致不會(huì)突變出這種癌細(xì)胞。一篇發(fā)表在《Nature Cell Biology》雜志上的一篇報(bào)道“卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞的端粒比體細(xì)胞短，但通過減數(shù)分裂端粒長(zhǎng)度會(huì)大幅度增加，在端粒酶缺失的小鼠的早期分裂胚胎中發(fā)現(xiàn)端粒竟然也會(huì)延伸，在成熟卵母細(xì)胞和卵裂期胚胎中，端粒酶活性降低或消失，端粒長(zhǎng)度卻大幅度增加，之后胚泡中又重新恢復(fù)端粒酶活性，同時(shí)伴隨著端粒酶活性的增加，端粒延伸卻減慢。為此科學(xué)家們得出結(jié)論，認(rèn)為在早期卵裂時(shí)，端粒延長(zhǎng)可能是由于同源重組機(jī)制，而從囊胚期開始，端粒酶僅是維持已經(jīng)確定的端粒的長(zhǎng)度”。在受精卵中，端粒的延伸是靠端粒DNA的同源重組；在無端粒酶活性的永生化癌細(xì)胞中，其端粒長(zhǎng)度的維持也是靠一種特殊的染色體外端粒重復(fù)序列DNA。在這類癌細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)一種核小體的特殊形式(包括端粒DNA，端粒特異結(jié)合蛋白，參與重組的蛋白)通過同原源重組來延伸端粒。據(jù)此，可向干細(xì)胞內(nèi)輸入外來的端粒重復(fù)序列DNA，如人工合成的長(zhǎng)度達(dá)到IlAd的端粒DNA片段，在一些能連接端粒DNA片段的酶的作用下把端粒DNA片段連接到染色體端粒DNA的末端，使多能成體干細(xì)胞的端粒跳躍式地凈延伸。4、向干細(xì)胞內(nèi)輸入端粒酶RNA組分(TR)端粒酶是以TR為模板利用逆轉(zhuǎn)錄酶活性來延伸端粒的。人類細(xì)胞永生化后的端粒酶活性可上升100 2000倍，但hTR mRNA最多僅提高2倍。在HeLa細(xì)胞中表達(dá)hTR的反義分子，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老。屈藝等人設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)端粒酶RNA組分的錘頭狀核酶基因，導(dǎo)入HeLa細(xì)胞后使端粒酶活性降至原來的1/8 1/10，傳至19 20代時(shí)出現(xiàn)95%凋亡。這說明TR是端粒延伸的主要限制因子。據(jù)此，可向干細(xì)胞內(nèi)輸入外來的TR，并激活端粒酶(起增效作用)，使端粒凈延伸。5、激活端粒酶和同時(shí)阻滯細(xì)胞周期來延伸端粒激活端粒酶時(shí)，TRFl的活性也會(huì)上升，因此，雖然端粒酶會(huì)延伸端粒，但因TRFl會(huì)抑制端粒酶延伸端粒，因此，端粒延伸非常困難，再加上激活端粒酶會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞分裂，而細(xì)胞分裂可使端粒DNA丟失，因此，癌細(xì)胞雖含高活性的端粒酶，但多數(shù)的癌細(xì)胞的端粒短于正常細(xì)胞，以及含有端粒酶的成體干細(xì)胞，端粒照樣會(huì)地不斷縮短。精母細(xì)胞(含有高活性的端粒酶)到轉(zhuǎn)化成精子的過程是長(zhǎng)期停在Gl期的，這可能是使精子端粒長(zhǎng)達(dá)151Λ的原因；致死量以下的X射線等輻射可激活細(xì)胞內(nèi)端粒酶和同時(shí)抑制細(xì)胞分裂，使老鼠、果蠅壽命延長(zhǎng)。日本的廣島和長(zhǎng)崎兩市的居民平均壽命高于全國(guó)的原因也許與原子彈爆炸余留下來的核輻射有關(guān)。輻射延長(zhǎng)壽命的機(jī)制是射線使DNA損傷，損傷的DNA會(huì)激活“DNA損傷感應(yīng)蛋白”， 然后再由DNA損傷感應(yīng)蛋白使蛋白激酶ART和ATM磷酸化并激活下游的Chk2激酶，再由 Chk2激酶告訴抑癌基因P53，再由P53激活抑癌基因P21而抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞周期阻滯在^廣或&/M期。以便細(xì)胞贏得時(shí)間去修復(fù)受損的DNA。因此，被認(rèn)為是衰老基因的P53 和P21在有些條件下表面上看似乎會(huì)使細(xì)胞變老，實(shí)際是在逆轉(zhuǎn)衰老。據(jù)此我們可設(shè)法使成體干細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶ART和ATM磷酸化或直接導(dǎo)入磷酸化的蛋白激酶ART和ATM來蒙騙DNA修復(fù)系統(tǒng)，在不損傷DNA的情況下，使成體干細(xì)胞以為是 DNA發(fā)生了損傷，以此來激活多能成體干細(xì)胞的端粒酶和P53基因，使多能成體干細(xì)胞的周期停滯，端粒發(fā)生凈延伸。從上知道，在激活端粒酶的同時(shí)，讓細(xì)胞周期處于阻滯狀態(tài)，就可以使端粒發(fā)生凈延伸。據(jù)此，可向離體培養(yǎng)的多能成體干細(xì)胞里加入非細(xì)胞毒性的細(xì)胞周期阻滯劑(1992 年，Holt發(fā)現(xiàn)，有毒的細(xì)胞周期阻滯劑會(huì)使端粒酶活性喪失，而無毒的周期阻滯劑則不會(huì)) 和端粒酶激活劑，使端粒發(fā)生凈延伸。在細(xì)胞周期中,G1和(；2期端粒酶活性升高，S期最高，而在期，其活性受到抑制， G2/M期完全喪失，據(jù)此，可將細(xì)胞周期阻滯在G1期、S期或(；2期。以上的各種方案也可以組合使用，以增強(qiáng)效果，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)端粒延伸速度超過縮短速度，使端粒達(dá)到凈延伸水平
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，使個(gè)體中衰老的器官組織逆轉(zhuǎn)年輕，從而使各種與增齡有關(guān)的疾病不治而愈。按此目的提供的逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，包括1、用癌細(xì)胞的胞質(zhì)延伸干細(xì)胞的端粒，把端粒較長(zhǎng)的癌細(xì)胞的胞質(zhì)體和衰老的多能成體干細(xì)胞的核體融合，利用癌細(xì)胞中高效的端粒修復(fù)系統(tǒng)使干細(xì)胞的端粒凈延伸；2、同時(shí)激活端粒酶和抑制細(xì)胞分裂，其特征是，用端粒酶激活劑激活個(gè)體中的成體干細(xì)胞的端粒酶，同時(shí)絕食，使細(xì)胞中的端粒酶活性升高，細(xì)胞又不能分裂，使成體干細(xì)胞的端粒凈延伸。所述的癌細(xì)胞的胞質(zhì)體來自端粒比正常體細(xì)胞端粒還長(zhǎng)的有端粒酶活性的癌細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞，或一些無端粒酶的肺癌細(xì)胞。所述的端粒酶激活劑是蛋白激酶C的激活劑，如植物血凝素(PHA)。本發(fā)明延伸干細(xì)胞端粒的方法比較簡(jiǎn)單，技術(shù)是現(xiàn)成的。端粒長(zhǎng)度在4-39歲時(shí)每年平均減少84bp，40歲以后，每年只平均減少41bp (Iwana等1998)。因此，只要把老年人體內(nèi)的成體干細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度從8 91Λ延伸到101Λ，就可以使衰老的器官、組織甚至個(gè)體年輕大約20年，進(jìn)而使各種與增齡有關(guān)的疾病不治而愈。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，包括1、用癌細(xì)胞的胞質(zhì)體延伸干細(xì)胞的端粒以HeLa 細(xì)胞延伸造血干細(xì)胞端粒為例，(1)癌細(xì)胞胞質(zhì)體制備，用細(xì)胞松弛素WCytochalasin B， CB)處理HeLa細(xì)胞，然后再通過離心力使核體與胞質(zhì)體分離，從而得到HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體；( 造血干細(xì)胞核體制備，用細(xì)胞松弛素B處理造血干細(xì)胞，然后再通過離心力使核體與胞質(zhì)體分離，從而得到造血干細(xì)胞的核體；(3)融合，采用電融合技術(shù)，融合率高達(dá)80%。 把HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體與造血干細(xì)胞的核體以2比1混合進(jìn)行融合，得到“癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞”。(4)把癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞培養(yǎng)150小時(shí)；(5)制備癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞的核體，再與HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體再融合，培養(yǎng)和融合重復(fù)3次，然后把癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液注回造血干細(xì)胞供應(yīng)者體內(nèi)。細(xì)胞性狀是由細(xì)胞核上的染色體的基因決定的，因此，待癌細(xì)胞的胞質(zhì)成分被細(xì)胞核表達(dá)的成分更新后，癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞的性狀會(huì)回復(fù)為干細(xì)胞的。造血干細(xì)胞在體內(nèi)可以分化成多種組織的細(xì)胞，從而使衰老的器官組織發(fā)生返老還童。由于造血干細(xì)胞比較稀缺，為了提高融合率，所述的融合用的HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體與造血干細(xì)胞的核體的比例為2比1。將失去分裂能力的雞紅細(xì)胞核與HeLa細(xì)胞(宮頸癌細(xì)胞)融合，可以看到癌細(xì)胞中有的蛋白質(zhì)向紅細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，使紅細(xì)胞核重新開始DNA復(fù)制和RNA合成(Harris等 1965，1974)。因此，癌細(xì)胞有使衰老的細(xì)胞恢復(fù)青春的能力。多數(shù)癌細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度比正常細(xì)胞短，但有少數(shù)的癌細(xì)胞的端粒比正常細(xì)胞長(zhǎng)， 如有端粒酶活性的HeLa細(xì)胞和少數(shù)無端粒酶活性的肺癌細(xì)胞。據(jù)此，可以選用端粒較長(zhǎng) (如果有長(zhǎng)達(dá)151Λ以上的癌細(xì)胞則最好)的癌細(xì)胞的胞質(zhì)體和衰老的多能成體干細(xì)胞的核體融合，使多能成體干細(xì)胞的端粒發(fā)生凈延伸。由于胞質(zhì)因子存在半衰期，因此，融合后的多能成體干細(xì)胞的核體，即所述的癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞的核體要多次再與癌細(xì)胞的胞質(zhì)體再融合，重復(fù)數(shù)次，才能把干細(xì)胞的端粒延伸到目標(biāo)長(zhǎng)度。每次再融合的間隔大約是150小時(shí)，這是因?yàn)?50小時(shí)后癌細(xì)胞的胞質(zhì)成分的活性開始降低。Muse細(xì)胞、造血干細(xì)胞至今在體外培養(yǎng)的條件下還難于增殖，用癌細(xì)胞的胞質(zhì)體與Muse細(xì)胞、造血干細(xì)胞的核體融合就可以啟動(dòng)DNA合成，使Muse細(xì)胞、造血干細(xì)胞增殖。如果癌細(xì)胞的線粒體DNA與患者差異較大，為了使多能成體干細(xì)胞的線粒體DNA 不混有癌細(xì)胞的線粒體DNA，融合所用的癌細(xì)胞要換上融合所用的核體的線粒體。方法可用線粒體毒素若丹明(rhodamine 6G，R-6G)除去癌細(xì)胞的線粒體，然后再與融合所用的胞質(zhì)體融合，就可以使癌細(xì)胞的線粒體DNA換為融合所用的核體的線粒體DNA。干細(xì)胞分離、干細(xì)胞移植、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞排核、細(xì)胞融合、替換線粒這些方法都是現(xiàn)成的，不詳細(xì)贅述，請(qǐng)參看相關(guān)文獻(xiàn)。2、延伸成體干細(xì)胞端粒的配方植物血凝素40 60mg，溶于生理鹽水60ml中靜脈緩慢推入，每日一次；同時(shí)口服維生素C 40mg、維生素E 20mg、維生素B12 ang、葉酸 0. 5mg、肌醇40mg，氧化鋅0. 8mg、硫酸鎂40mg、硫酸亞鐵5mg，每日2次。使用延伸成體干細(xì)胞端粒的配方期間不要運(yùn)動(dòng)，并絕食(只喝點(diǎn)含有多種維生素和礦物質(zhì)，但不含能量的飲料，即饑餓療法)，每次治療時(shí)間根據(jù)各人的體質(zhì)不同而已，一般 30天左右，因?yàn)槿酥灰兴?，可以挨餓50 60天。植物血凝素是蛋白激酶C(H(C)的激活劑。激活蛋白激酶C能促生長(zhǎng)因子分泌，生長(zhǎng)因子能激活myc表達(dá)，而myc可激活端粒酶(Wang等，1998)。肌醇是肌醇磷脂第二信使系統(tǒng)中的一個(gè)成員，它可使該系統(tǒng)代謝增強(qiáng)，生成更多的二酰基甘油(DG)，而DG也是蛋白激酶C的激活劑。植物血凝素可增強(qiáng)免疫，用來治療急性白血病、多種癌癥、再生障礙性貧血，也能使老年神經(jīng)細(xì)胞逆轉(zhuǎn)年輕(Zs-Nagy，1979)。在體外，植物血凝素可使人T細(xì)胞端粒酶活性增高 500 1000 倍(Bodnar, 1998)。干細(xì)胞比非干細(xì)胞幼稚，更容被端粒酶激活劑如PHA激活。這是我們所期望的。培養(yǎng)的細(xì)胞在缺乏能量物質(zhì)葡萄糖時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)被阻滯。在一些抑制細(xì)胞周期的因素存在時(shí)，細(xì)胞周期完全受阻，此時(shí)myc會(huì)促使細(xì)胞凋亡。因此，在同時(shí)激活端粒酶和使細(xì)胞周期阻滯時(shí)，有些情況下必須要阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡。已發(fā)現(xiàn)自由基可加速端?？s短速度，而維生素E(Ve)和維生素C(Vc)作為抗氧化劑不但能夠顯著降低端粒的縮短速度， 而且能夠抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的第一步是各種病理或生理刺激對(duì)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換 (permeability tranaition PT)的作用，使PT孔開啟，這是凋亡發(fā)生的初始和限速事件，而抗氧化劑能抑制線粒體PT孔開啟，從而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生。Ve與Vc合用，抗氧化效果則更好，因?yàn)閂c對(duì)Ve受自由基破壞后有再生復(fù)活作用。 維生素B12、葉酸0. 5、氧化鋅、硫酸鎂有利于DNA合成、硫酸亞鐵可有利于提高紅細(xì)胞功能， 緩解因細(xì)胞分化受到抑制所引起的紅細(xì)胞生成的不足。體細(xì)胞有兩種狀態(tài)功能態(tài)和增殖態(tài)。為了維持個(gè)體的正常生理，絕大多數(shù)的體細(xì)胞都必須處于功能態(tài)。與端粒延伸有關(guān)的基因被激活時(shí)，體細(xì)胞會(huì)由功能態(tài)切換為增殖態(tài)。 如果大部分細(xì)胞處于增殖態(tài)，不但器官組織的功能會(huì)嚴(yán)重下降(這對(duì)個(gè)體是有害的，是長(zhǎng)生不老藥至今沒有出現(xiàn)的原因之一)，而且細(xì)胞在分裂時(shí)端粒DNA片段會(huì)發(fā)生丟失。此外，處于增殖態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞分化就會(huì)停滯，終未細(xì)胞如紅細(xì)胞等有一定壽限，細(xì)胞停滯分化時(shí)它照樣死去，而人體又不能沒有紅細(xì)胞。肝切除再生或肝中毒導(dǎo)致肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子升高(可升高到正常水平的13-17倍) 時(shí)，會(huì)使肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，白蛋白合成下降，原來很少或不合成的甲胎蛋白上升。同時(shí)膽汁分泌及清除能力也下降。因此可以說，大量的體細(xì)胞在大幅度地激活端粒酶時(shí)，雖然可以讓細(xì)胞長(zhǎng)生不老，卻會(huì)要個(gè)體的命，也可以說，雖然我們能夠使細(xì)胞長(zhǎng)生不老，但是卻不能使個(gè)體長(zhǎng)生不老。據(jù)此，在激活端粒酶的同時(shí)，必須要降低個(gè)體的代謝強(qiáng)度，如少運(yùn)動(dòng)，絕食。由于代謝率下降，產(chǎn)生廢物就會(huì)減少，就可以緩解肝臟的工作壓力。據(jù)說氣功大師在修煉某些氣功達(dá)到高級(jí)階段時(shí)，會(huì)自發(fā)產(chǎn)生絕食，稱“辟谷”，他們認(rèn)為辟谷可以延壽。據(jù)報(bào)道，臺(tái)灣有人讓不再產(chǎn)蛋的雞進(jìn)行辟谷，結(jié)果恢復(fù)了產(chǎn)蛋。我認(rèn)為饑餓不但可通過降低動(dòng)物的代謝強(qiáng)度，從而降低了個(gè)體對(duì)正常生理的要求，如產(chǎn)生代謝廢物減少，以緩和肝臟處理廢物能力下降的矛盾，而且會(huì)使細(xì)胞周期停滯，例如，在培養(yǎng)基在適當(dāng)缺乏能量物質(zhì)(葡萄糖)或某些必須的營(yíng)養(yǎng)成份時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停在G1期，而此時(shí)處于其它周期的或突變和過度衰老的細(xì)胞卻會(huì)死亡(已發(fā)現(xiàn)饑餓會(huì)清除體內(nèi)突變的細(xì)胞，由此會(huì)降低癌癥發(fā)生率)，因此，在給藥期間必須要絕食。絕食的主要目的是讓細(xì)胞周期停滯。衰老并不是不可逾越的自然規(guī)律，很多低等動(dòng)物如水母類、海鞘類、扁形動(dòng)物三腸類等在長(zhǎng)時(shí)間饑餓時(shí)會(huì)發(fā)生了反向發(fā)育，發(fā)生了實(shí)質(zhì)性的返老還童?？赡苁沁@些低等動(dòng)物在長(zhǎng)時(shí)間饑餓時(shí)，會(huì)使附著在組織細(xì)胞外的細(xì)胞間質(zhì)成分和細(xì)胞內(nèi)的垃圾成分降解，以及使衰老和病變的細(xì)胞發(fā)生凋亡和降解，這些降解物又作為干細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使細(xì)胞恢復(fù)分裂(蔣松柏，1994)。我認(rèn)為饑餓引起細(xì)胞周期停滯的同時(shí)，會(huì)啟動(dòng)與端粒延伸有關(guān)的基因大量表達(dá)(細(xì)胞間隙成分的降解會(huì)降低細(xì)胞的接觸抑制，而接觸抑制會(huì)使端粒酶活性下降)，從而使多能或全能的成體干細(xì)胞的端粒延伸量大于縮短量，隨著端粒不斷地凈延伸， 衰老的細(xì)胞和個(gè)體就自然會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，從而使個(gè)體發(fā)生了反向發(fā)育和返老還童。如果在治療時(shí)能夠抑制TRF1，端粒延伸效果則會(huì)更好。知識(shí)鏈接細(xì)胞融合證明細(xì)胞衰老過程會(huì)產(chǎn)生DNA合成抑制劑。DNA合成抑制劑會(huì)抑制端粒DNA的延伸。作為細(xì)胞的能量物質(zhì)ATP會(huì)間接抑制DNA的合成，而脫氧胞嘧啶核苷(dcd R)、限食可解除這種抑制。降低cAMP或和升高cGMP的物質(zhì)也能提高DNA的合成 (如N-甲基酪胺等)。如果能夠適當(dāng)服用與DNA合成有關(guān)的各種維生素、微量元素及氨基酸，DNA合成前物質(zhì)如核苷酸等則有輔助所述的饑餓療法。激活蛋白激酶C可使T細(xì)胞增殖，原因是PKC能促IL-2分泌作用。PDGF也有激活PKC作用。DG、佛波脂A(PMA)十二癸豆寇(TPA)屬單純促癌劑(Promotor)。即只有促癌而無誘癌作用。它也是PKC激活劑。RNA 酶抑制劑(如黃芪多糖等)能夠防止mRNA的降解，這也會(huì)提高端粒酶活性和細(xì)胞活力。由于意識(shí)不能自我本位地復(fù)制，因此，雖然衰老問題解決了，每個(gè)人還是只能活一次，這是由意識(shí)的本質(zhì)決定的。所謂的意識(shí)是什么？的機(jī)器人和人身上有都有各種傳感器， 機(jī)器人的電腦和人的大腦都會(huì)通過運(yùn)算再發(fā)出各種指令，但大腦能夠知道自己在干什么， 能夠知道自我和外界的存在，這種現(xiàn)象稱“意識(shí)”，而電腦卻不知道自己在干什么，不知道自我和外界的存在，因此，電腦不具備意識(shí)。也就是說，意識(shí)就是大腦中產(chǎn)生的一種能夠知道自我和外界存在的神經(jīng)機(jī)制，因此，意識(shí)現(xiàn)象的本質(zhì)就是“知道”。宇宙中真正沒有相同的東西可以說是意識(shí)，由相同的細(xì)胞和不同的意識(shí)構(gòu)成了你我他(她)。雖然衰老可以完全逆轉(zhuǎn)，但無論如何，總會(huì)發(fā)生意外死亡的，因此，永生是做不到的，于是有人就設(shè)想復(fù)制意識(shí)， 以讓生命得以永存，我認(rèn)為這是行不通的，我們可以設(shè)想復(fù)制出了一個(gè)意識(shí)、外貌和基因和我們一致的人，我們就會(huì)發(fā)現(xiàn)這個(gè)人不是我，而是他(她)，復(fù)制出無數(shù)個(gè)的我，也是無數(shù)個(gè)的他(她)，也就是說，意識(shí)是不能自我本位地復(fù)制的。
權(quán)利要求
1.逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，包括1、用癌細(xì)胞的胞質(zhì)體延伸干細(xì)胞的端粒其特征是， (1)癌細(xì)胞胞質(zhì)體制備，用細(xì)胞松弛素B處理HeLa細(xì)胞，然后再通過離心力使核體與胞質(zhì)體分離，從而得到HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體；( 造血干細(xì)胞核體制備，用細(xì)胞松弛素B處理造血干細(xì)胞，然后再通過離心力使核體與胞質(zhì)體分離，從而得到造血干細(xì)胞的核體；C3)融合， 采用電融合技術(shù)，把HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體與造血干細(xì)胞的核體混合進(jìn)行融合，得到“癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞”，(4)把癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞培養(yǎng)150小時(shí)；(5)制備癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞的核體，再與HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體再融合，培養(yǎng)和融合重復(fù)3次，然后把癌細(xì)胞質(zhì)-干細(xì)胞核的雜種細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液注回造血干細(xì)胞供應(yīng)者體內(nèi)；2、延伸成體干細(xì)胞端粒的配方其特征是，植物血凝素40 60mg，溶于生理鹽水60ml 中靜脈緩慢推入，每日一次；同時(shí)口服維生素C 40mg、維生素E 20mg、維生素B12 ang、葉酸 0. 5mg、肌醇40mg，氧化鋅0. 8mg、硫酸鎂40mg、硫酸亞鐵5mg，每日2次，口服。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，其特征是所述的融合用的HeLa細(xì)胞的胞質(zhì)體與造血干細(xì)胞的核體的比例為2比1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞衰老的方案，其特征是所述的使用延伸成體干細(xì)胞端粒的配方期間不要運(yùn)動(dòng)，并絕食，只喝點(diǎn)含有多種維生素和礦物質(zhì)，但不含能量的飲料，每次治療時(shí)間根據(jù)各人的體質(zhì)不同而已，一般30天左右。
全文摘要
隨著年齡的不斷增長(zhǎng)，我們的黑發(fā)會(huì)逐漸變白，皮膚皺紋逐漸增多，癌癥、糖尿病、心腦血管病的發(fā)病概率也會(huì)逐年上升，導(dǎo)致這種變化的罪魁禍?zhǔn)资莻€(gè)體中的成體干細(xì)胞衰老了。把端粒長(zhǎng)度達(dá)15kb以上的有端粒酶活性或無端粒酶活性的永生化的癌細(xì)胞的胞質(zhì)體與衰老的成體干細(xì)胞的核體融合，可以使干細(xì)胞返老還童，然后向老年人體內(nèi)注射自身的經(jīng)過返老還童的多能成體干細(xì)胞的懸浮液，年輕的多能成體干細(xì)胞就會(huì)定居在組織中，并通過細(xì)胞的增殖和分化來替換衰老的組織細(xì)胞，從而使組織器官甚至個(gè)體恢復(fù)活力，進(jìn)而使各種與增齡有關(guān)的疾病不攻自破。
文檔編號(hào)A61K31/355GK102266350SQ201110212970
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者黃必錄 申請(qǐng)人:黃必錄