專利名稱：對肺炎衣原體具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對肺炎衣原體具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體，制造此單克隆抗體的方法，產(chǎn)生這種抗體的細(xì)胞，制造該細(xì)胞的方法，檢查和/或測定肺炎衣原體的方法，該方法所用試劑，診斷肺炎衣原體感染的方法和試劑。本發(fā)明能夠被有效地用于制藥工業(yè)，特別是用于制造用以診斷肺炎衣原體感染的試劑。
已知有四種衣原體，它們是結(jié)膜炎衣原體，肺炎衣原體，鸚鵡衣原體，和眼結(jié)膜衣原體。據(jù)信肺炎衣原體會引起呼吸道感染，非典型肺炎等等。
由于肺炎衣原體引起的呼吸器官感染的癥狀與肺炎支原體或流感病毒引起的感染的癥狀相似，醫(yī)師經(jīng)常對此作出錯(cuò)誤的判斷。所以，就需要開發(fā)一種診斷肺炎衣原體引起的感染的簡單方法。
一般，通過檢測感染部位的病原細(xì)胞或者通過檢測體液，如血清等中的該病原細(xì)胞的抗體，就能可靠地診斷出感染。前一種方法被稱為抗原試驗(yàn)，而后者被稱為抗體試驗(yàn)。二者在臨床上都很重要。
抗原試驗(yàn)包括間接熒光抗體技術(shù)和直接熒光抗體技術(shù)，在間接熒光抗體技術(shù)中，被檢測的抗原的抗體被加入到試樣中，然后加入另一種被熒光劑和類似物作為標(biāo)記的抗體以測定試樣中有無該抗原，在直接熒光抗體技術(shù)中，不用另一種熒光抗體，而是將預(yù)先被熒光劑和類似物作了標(biāo)記的待檢的抗原的抗體加入到試樣中，從而測定試樣中有無抗原。
作為肺炎衣原體的抗原，已知有脂多糖(LPSs)和蛋白質(zhì)。LPSs對衣原體屬具有普遍的抗原性。作為蛋白質(zhì)抗原，39.5KDa，60KDa，75KDa，98KDa蛋白質(zhì)及其類似物是已知的。39.5KDa蛋白被稱為主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein)(下文略為″MOMP″)。
作為對衣原體屬有特異性的抗原，GLXA(一種特異性糖脂抗原屬)，脂多糖(LPSs)，MOMP及其類似物是已知的。Elizabeth S.Stuart等人報(bào)道了抗衣原體屬的GLXA的單克隆抗體(CurrentMicrobiology，28，85-90(1994))。Harland D.Caldwell等人報(bào)道了抗衣原體屬的LPs的單克隆抗體(Infection and Immunity，44(2)，306-314(1984))。他們通過直接熒光抗體技術(shù)，用單克隆抗體給肺衣原體的包含體染色。Ellena M.Peterson等人(Infectionand Immunity，59(11)，4147-4153(1991)和Byron E.Batteiger等人(Infection and Immunity，53(3)，530-533(1986))報(bào)道了抗衣原體屬的MOMP的單克隆抗體。
從Richard S.Stephens等人(J.Immunology，128(3)，1083-1089(1982))的報(bào)道開始，已發(fā)表了許多有關(guān)抗結(jié)膜炎衣原體的單克隆抗體。H.Puy等人報(bào)道了抗鸚鵡衣原體的單克隆抗體，其中包括在間接熒光抗體試驗(yàn)中對鸚鵡衣原體和肺炎衣原體具有同樣反應(yīng)性的單克隆抗體(Immunology Letters，23，217-222(1989/1990)。但是，尚無單克隆抗體識別出的抗原的描述。Kuroda等人報(bào)道了抗眼結(jié)膜衣原體的單克隆抗體(Am.J.Vet.Res，54(5)，709-712(1993))。
在一般的用初級體或肺炎衣原體的MOMP的免疫接種中，很難獲得能夠產(chǎn)生與MOMP中抗原性低的抗原位點(diǎn)有特異性反應(yīng)的單克隆抗體的細(xì)胞。無論是與MOMP的低抗原位點(diǎn)有特異反應(yīng)的單克隆抗體，還是產(chǎn)生這種抗體的細(xì)胞，目前都未得到。
Iijima等人報(bào)道了作為抗肺炎衣原體的單克隆抗體的53 KDa蛋白的單克隆抗體(Y.Iijima，J.clinical Microbiology，32(3)，583-588(1994)。
Cho-chou Kuo等人報(bào)道了在間接熒光抗體技術(shù)中，肺炎衣原體的包含體能被肺炎衣原體有特異性的單克隆抗體(RR402)染色(J.Clinical Microbiology，24(6)，1034-1037(1986)及日本未審查專利申請昭64-500083號)。但是，沒有被單克隆抗體識別的抗原的描述。
Izutsu等人報(bào)道了與肺炎衣原體反應(yīng)的單克隆抗體(日本未審查專利申請平7-16098號)。他們揭示出通過間接熒光抗體技術(shù)，用單克隆抗體能使包含體染色。
Harland，D，Caldwell等人報(bào)道的抗LPS單克隆抗體具有對除肺炎衣原體之外的衣原體屬種類的反應(yīng)性，故難以用這種單克隆抗體專門檢測肺炎衣原體。
Ellena M，Peterson等人和Byron E.Batteiger等人報(bào)道的抗MOMP的單克隆抗體具有對除肺炎衣原體之外的衣原體屬種類的反應(yīng)性，故難以用這些單克隆抗體專門檢測肺炎衣原體。另外，它們未被標(biāo)記。
尚不清楚Iijima等人報(bào)道的抗體是否能專門檢測肺炎衣原體。并且，尚無肺炎衣原體的包含體能被該單克隆抗體染色的報(bào)道。
Cho-chou等人和Izutsu所用的間接熒光抗體支術(shù)的方法需要長時(shí)間進(jìn)行抗原試驗(yàn)，因此，對臨床檢查中短時(shí)間處理大量試樣來說是不適宜的。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體。這些單克隆抗體能用來專門檢測肺炎衣原體，并能在臨床檢查中短時(shí)間處理大量試樣。
本發(fā)明的主題是以下物質(zhì)(1)一種對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體。
(2)如(1)所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應(yīng)性。
(3)如(1)所述的單克隆抗體，其對肺炎衣原體的初級體具有反應(yīng)性。
(4)如(3)所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應(yīng)性。
(5)如(1)所述的單克隆抗體，其中的抗體是被標(biāo)記的。
(6)如(1)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的。
(7)如(6)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(8)一種單克隆抗體，對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應(yīng)性且是被標(biāo)記的。
(9)如(8)所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具有反應(yīng)性。
(10)如(8)所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(11)一種產(chǎn)生對蛋白具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體的產(chǎn)生抗體細(xì)胞的制備方法，該方法包括給動(dòng)物免疫接種天然和變性蛋白的一種，并用其他蛋白加強(qiáng)劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用骨髓瘤細(xì)胞融合該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
(12)如(11)所述的方法，包括給動(dòng)物免疫接種一種天然蛋白并用一種變性蛋白加強(qiáng)劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用骨髓瘤細(xì)胞融合該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
(13)如(11)所述的方法，其中的變性蛋白是用去污劑或還原劑處理天然蛋白得到的。
(14)如(11)所述的方法，其中的蛋白是衣原體的主要外膜蛋白。
(15)如(11)所述的方法所制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
(16)一種產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，該細(xì)胞能產(chǎn)生如(1)所述的單克隆抗體。
(17)如(16)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
(18)一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如(15)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
(19)一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如(16)所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
(20)用如(1)所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
(21)如(20)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(22)用如(8)所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
(23)如(22)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(24)一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如(1)所述的單克隆抗體。
(25)如(24)所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(26)一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如(8)所述的單克隆抗體。
(27)如(26)所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(28)一種用如(1)所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
(29)如(28)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(30)一種用如(8)所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
(31)如(30)所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(32)一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如(1)所述的單克隆抗體作為活性成分。
(33)如(32)所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
(34)一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如(8)所述的單克隆抗體作為活性成分。
(35)如(34)所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
優(yōu)選的對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體包括，對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應(yīng)而對結(jié)膜炎衣原體的MOMP不具反應(yīng)性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應(yīng)并對肺炎衣原體的初級體具有反應(yīng)性的單克隆抗體。較優(yōu)選的是對肺炎衣原體的MOMP具有特異性反應(yīng)而對結(jié)膜炎衣原體的MOMP不具反應(yīng)性且對肺炎衣原體的初級體有反應(yīng)性的單克隆抗體。
對肺炎衣原體的MOMP具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體的具體例子包括，雜交瘤細(xì)胞系CP-6產(chǎn)生的單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞系CP-11中產(chǎn)生的單克隆抗體及類似物。雜交瘤細(xì)胞系CP-6和CP-11已按布佩斯條約的條款在the National Institute of Bioscience andHuman-Technology，the Agency of Industrial Science andTechology(1-3，Higashi lchome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，Japan)以FERM BP5-5155和FERM BP-5156保藏。
優(yōu)選的對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應(yīng)性的單克隆抗體是那些對結(jié)膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具反應(yīng)性的單克隆抗體。
對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應(yīng)性的單克隆抗體的具體例子包括，雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體及類似物。雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8已按布達(dá)佩斯條約的條款在the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，the Agencyof Industrial Science and Technology以FERM BP-5154保藏。
本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生對蛋白具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體的產(chǎn)生細(xì)胞的制備方法，其中包括給動(dòng)物免疫接種天然蛋白和變性蛋白的一種，用其他蛋白加強(qiáng)劑量，得到產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，用骨髓瘤細(xì)胞融合該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
本發(fā)明的制備產(chǎn)生抗體細(xì)胞的方法特征是，給動(dòng)物免疫接種，除此它還能夠按通常的步驟包括給動(dòng)物免疫接種，細(xì)胞融合，融合的細(xì)胞的篩選，產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞的篩選，克隆等等來完成。
本發(fā)明方法所用的蛋白包括衣原體，特別是肺炎衣原休屬，細(xì)菌，病毒的MOMP，動(dòng)物，包括人以及植物所衍生的各種蛋白及類似物。
天然蛋白被定義為保持原始空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，包括衣原體，細(xì)菌，病毒有機(jī)體本身，例如，衣原體的EB，以及蛋白質(zhì)的部分和完全提純物。天然蛋白被用作免疫接種的抗原。肺炎衣原體的各種菌株衍生的抗原能用作特蛋白抗原。例如，能夠使用YK-41菌標(biāo)的和EBS和TWAR。
變性的蛋白被定義為以下條件下的蛋白質(zhì)，其在生理溶液中的原始空間結(jié)構(gòu)已被某種處理所破壞，以及以下條件下的蛋白質(zhì)，其雙硫鍵(S-S鍵)也已斷開，且優(yōu)選其氨基酸序列被識別為抗原位點(diǎn)。變性蛋白也可用作免疫接種的抗原。由于免疫接種變性蛋白充分地加強(qiáng)了產(chǎn)生變性蛋白中抗低抗原性位點(diǎn)的抗體的細(xì)胞，故即使在只免疫接種天然蛋白難以得到產(chǎn)生抗天然蛋白的單克隆抗體的細(xì)胞的情況下，也能容易地得到產(chǎn)生抗體細(xì)胞。
在用天然蛋白或變性蛋白作免疫接種的抗原時(shí)，只誘發(fā)形成蛋白中抗高原性位點(diǎn)的抗體，而難以有效地誘發(fā)形成抗低抗原性位點(diǎn)的抗體。
用作免疫接種抗原的肺炎衣原體的MOMP和EB可以通過例如下文實(shí)施例描述的方法從YK-41菌株中制得。
使蛋白質(zhì)變性的方法包括但不限于以下方法，用還原劑或洗滌劑處理，熱處理，用有機(jī)溶劑處理等。優(yōu)選用還原劑或洗滌劑處理的方法。還原劑包括但不限于2-巰基乙醇。洗滌劑包括但不限于SDS(十二烷基苯磺酸鈉)。
被免疫接種的哺乳動(dòng)物包括小鼠，鼠，兔子，羊，雞等。小鼠是特別優(yōu)選的。
哺乳動(dòng)物用天然蛋白和變性蛋白的一種免疫接種并用其他蛋白作最后接種，優(yōu)選用天然蛋白免疫接種并用變性蛋白最后免疫接種。在肺炎衣原體的情況下，建議用肺炎衣原體的EB或天然MOMP給哺乳動(dòng)物免疫接種再用變性蛋白，例如已被洗滌劑或還原劑處理變性的MOMP進(jìn)行最后免疫接種。
另外，在免疫接種中優(yōu)選使用一種輔助劑。輔助劑的優(yōu)選例子包括弗氏完全佐劑(下文略為″FCA″)，弗氏不完全佐劑(下文略為″FIA″)及類似物。
免疫接種一般可通過1-5或更多次的注射完成?？乖淖⑸淞恳话憧蔀槊恐徊溉閯?dòng)物1ng-10mg，并能隨抗原的不同而改變。
最后免疫接種一般可通過1-5或更多次的注射完成?？乖淖⑸淞恳话憧蔀槊恐徊溉閯?dòng)物1ng-10mg，并能隨抗原的不同而改變。通常，用于最后免疫接種的抗原量為免疫接種中所用量的1/100至1/10。
經(jīng)上述方法足量的免疫接種后，從被免疫接種的哺乳動(dòng)物中分離出脾細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞或類似物作為能產(chǎn)生抗體的母體細(xì)胞。
一般可用骨髓瘤細(xì)胞作為制備雜交瘤細(xì)胞系的其他母體細(xì)胞。例如，可以使用小鼠的P3U1，NS-1，653，SP2，X63，MPC-11及類似物，鼠的AG1，AG2，AG3，RCY3，210及類似物，人的SKO-007及類似物。優(yōu)選的是小鼠的細(xì)胞，特別優(yōu)選P3U1，653及類似物。
細(xì)胞融合可用聚乙二醇法，Sendai病毒法，電融合法等等。優(yōu)選用聚乙二醇的方法。
雜交瘤細(xì)胞的篩選可通過在只能使感興趣的雜交瘤細(xì)胞生長的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)來進(jìn)行。例如，HAT(次黃嘌呤氨蝶呤胸苷)培養(yǎng)基，HAz(次黃嘌呤重氮絲氨酸)培養(yǎng)基等是優(yōu)選的培養(yǎng)基。
篩選產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞，是通過回收井中的上清液，該井中的培養(yǎng)基中生長了所需的雜交瘤細(xì)胞，再用所需蛋白(如肺炎衣原體的EB或MOMP)檢查是否存在有由酶抗體技術(shù)或免疫印跡技術(shù)形成的抗體來完成。
克隆被定義為以一個(gè)克隆衍生的一細(xì)胞群的形式獲得產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞的過程?？寺】赏ㄟ^有限稀釋培養(yǎng)法，把菌落置于軟瓊脂上的方法，單細(xì)胞處理法，F(xiàn)ACS法等方法進(jìn)行。有限稀釋培養(yǎng)方法較簡單，故是優(yōu)選的。
產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞可用上述方法獲得。
通過本發(fā)明方法獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞包括雜交瘤細(xì)胞系CP-6和CP-11。
用所述方法獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞可在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生單克隆抗體?；蛘?，通過給小鼠等注射得到的雜交瘤細(xì)胞系，再收集腹水得到單克隆抗體。
培養(yǎng)基包括，補(bǔ)以胎兒腓腸血清的改善Eagle培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)，Dulbecco的改善Eagle培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)，RPM11640培養(yǎng)基等等。
從培養(yǎng)液的上層清液中回收單克隆抗體可通過用蛋白A柱，蛋白G柱等的親和色譜法，離子交換色譜法，聚乙二醇分餾法，乙醇分餾法，硫酸銨分餾法及類似的方法進(jìn)行。優(yōu)選的是親和色譜法，更優(yōu)選的是使用蛋白A柱。
對所得的單克隆抗體可測定其對所需的蛋白的特異反應(yīng)性。例如，用Western印跡法篩選與所需蛋白有特異性反應(yīng)的單克隆抗體，該法中使用了經(jīng)適當(dāng)溶劑處理和電泳處理的有機(jī)物。更具體地，可測定單克隆抗體對肺炎衣原體的MOMP或EB的特異反應(yīng)性，和/或與53KDa抗原蛋白的反應(yīng)性。對肺炎衣原體的MOMP的特異反應(yīng)性可被定量測定，方法是用Western印跡法測定與分子量約39.5KDa的MOMP帶有特異反應(yīng)性的抗體的存在，該法中使用用適宜溶液處理和電泳處理的肺炎衣原本的EB?？梢韵嘈疟欢繙y定為對肺炎衣原體的MOMP有特異反應(yīng)性的單克隆抗體識別了作為抗原表位的肺炎衣原體的MOMP氨基酸序列。
研究與單克隆抗體反應(yīng)的抗原蛋白是這樣進(jìn)行的用λgtll及類似物制備肺炎衣原體的cDNA庫，表達(dá)cDNA來得到肽，令單克隆抗體與所得到的肽反應(yīng)，分析與單克隆抗體特異反應(yīng)的cDNA的密碼子，該密碼子插入λ噬菌體。
本發(fā)明制備單克隆抗體的方法能夠制備任何類型(球蛋白類型)的抗體。可以使用單克隆抗體的片段和有單克隆抗體片段的分子。
本發(fā)明方法制備的單克隆抗體能將蛋白中低抗原性位點(diǎn)識別為抗原表位，這在以前是難以做到的。更特別的是，它們能識別作為抗原表位的蛋白質(zhì)平面結(jié)構(gòu)或氨基酸序列。
對肺炎衣原體的MOMP有特異反應(yīng)性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應(yīng)性的單克隆抗體可以通過以下方法得到，例如，培養(yǎng)本發(fā)明方法制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞系)，收集培養(yǎng)物上層清液，然后用上述方法提純。在本方法中為了制備產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞所用的免疫接種可用已知技術(shù)完成。
優(yōu)選地，本發(fā)明所得的單克隆抗體基本不與衣原本屬的其他種類，如結(jié)膜炎衣原體，和鸚鵡衣原體反應(yīng)。特別是，更優(yōu)選基本不與衣原體屬其他所有種類的MOMP而僅與肺炎衣原體的MOMP反應(yīng)的單克隆抗體，和與肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有特異性反應(yīng)的單克隆抗體，因?yàn)樗鼈兡苡糜谠\斷肺炎衣原體特異性疾病種類。
如果單克隆抗體在直接或間接熒光技術(shù)中與肺炎衣原本之外的種類反應(yīng)，但嚴(yán)格地說只具低的反應(yīng)性，它們能從呈高反應(yīng)性的那些中被識別出來，故能實(shí)用于診斷中。這種單克隆抗體也是有用的。單克隆抗體不應(yīng)與經(jīng)常分離的結(jié)膜炎衣原體發(fā)生交叉反應(yīng)是很重要的，但它們是否與不經(jīng)常分離的鸚鵡衣原體和眼結(jié)膜衣原體發(fā)生交叉反應(yīng)并不是那么重要。如果單克隆抗體在直接或間接熒光技術(shù)中與肺炎衣原體高度反應(yīng)但只與其他種類(如鸚鵡衣原體)微弱反應(yīng)，而與其他種類(如結(jié)膜炎衣原體和眼結(jié)膜衣原體)根據(jù)不反應(yīng)，它們就能用于確定哪個(gè)種類的衣原體引起的疾病，故它們是優(yōu)選的。
本發(fā)明的單克隆抗體包括任何類型(球蛋白類型)的抗體。還包括單克隆抗體的片段(Fab，fab′，fab′2等)和有單克隆抗體的片段的分子。
對肺炎衣原體的MOMP有特異反應(yīng)性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應(yīng)性的單克隆抗體可以被標(biāo)記。
給單克隆抗體作標(biāo)記可以是在單克隆抗體上結(jié)合一種標(biāo)記試劑，如各種染料，膠體，酶等。
染料包括熒光染料，如FITC(熒光素5-異硫氫酸鹽)，若丹明，熒光素等。FITC以其適用性和易得性而成為優(yōu)選。FITC可由SigmaCo.，Ltd購得。
膠體包括金膠體等等。
酶包括過氧化物酶，堿性磷酸酶，熒光素酶，β-半乳糖苷酶等等。
給單克隆抗體結(jié)合上標(biāo)記可用任何已有技術(shù)，如″EXPERIMENTALIMMUNOLOGY″中所述的方法，Ivan Lefkovits等人編，NishimuraShoten，(1985)。
另外，在單克隆抗體和標(biāo)記試劑之間可以插入化學(xué)物質(zhì)，如生物素，抗生物蛋白，鏈抗生物素蛋白，digoxygenin等等。
由于FITC結(jié)合在抗體的賴氨酸殘基上，結(jié)果是用FITC標(biāo)記使某些抗體失去其抗原結(jié)合活性。
用例如直接或間接標(biāo)記之后的本發(fā)明單克隆抗體能檢測和/或測定肺炎衣原體。用上述方法可直接給本發(fā)明單克隆抗體作標(biāo)記。用已被標(biāo)記試劑(已標(biāo)記的另一種抗體)標(biāo)記的、能識別并與單克隆抗體結(jié)合的抗原能給本發(fā)明單克隆抗體間接標(biāo)記。該另一種抗體包括兔子抗一小鼠免疫球蛋白抗體等等。在標(biāo)記試劑是熒光感染的情況下，用紫外線照射它并檢測和/或測定所發(fā)生的熒光。當(dāng)標(biāo)記試劑是酶時(shí)，加入底物檢測和/或測定由酶的催化反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)色和顏色增強(qiáng)。如果需要，在兩種情況下均可使用敏化劑。
檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑包括未標(biāo)記的或標(biāo)記的本發(fā)明單克隆抗體本身及其混合物，至少包括以下成分的一種。
(1)、抑制非特異性免疫反應(yīng)的物質(zhì)(如，牛的血清清蛋白)(2)、用作標(biāo)記試劑的酶的底物(3)、敏化劑(4)、控制抗原(肺炎衣原本的MOMP，53KDa抗原蛋白)(5)、作了標(biāo)記的另一種抗體這些成分無論單獨(dú)使用或兩種或多種混合使用，優(yōu)選制成凍干制品以便于臨床應(yīng)用。
檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑能直接用作診斷肺炎衣原體感染的試劑。
本發(fā)明的單克隆抗體能用于診斷肺炎衣原體感染。肺炎衣原體感染能用檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑或診斷肺炎衣原體感染的試劑來診斷。在試用這些試劑和診斷試劑的試驗(yàn)中，當(dāng)試樣呈現(xiàn)陽性時(shí)就證實(shí)肺炎衣原體感染的發(fā)生。
優(yōu)選使用本發(fā)明單克隆抗體的混合物，由于抗原的量隨試樣不同，故它能識別不同的抗原。
可以混合單克隆抗體的例子包括對肺炎衣原體的MOMP有反應(yīng)性的單克隆抗體和對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白有反應(yīng)性的單克隆抗體。
另外，本發(fā)明單克隆抗體可以與其他單克隆抗體或多種隆抗體混合。
本發(fā)明單克隆抗體和本發(fā)明方法制得的那些抗體可以用在檢測所需蛋白的方法中，特別是使用免疫反應(yīng)，如放射免疫測定法，酶免疫測定法等的方法中。它們也能用作科學(xué)研究中診斷試劑的成分。如果需要，它們能直接或以嵌合劑或飲劑或抗體的形式用在藥物制劑中。
另外，本發(fā)明單克隆抗體和本發(fā)明方法制備的那些抗體能用在診斷工具箱中，它們在其中通過聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合起來。
本發(fā)明產(chǎn)生抗體的細(xì)胞還能用作抗體基團(tuán)的來源。抗體基團(tuán)能表現(xiàn)在各種細(xì)胞中。
以上描述是本發(fā)明的概括說明。參考以下具體實(shí)施例可對本發(fā)明有更完全的理解，這些例子在此只用于說明之目的，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1制備對肺炎衣原體(1)的MOMP有特異性的單克隆抗體1.1制備肺炎衣原體的EB為了制備肺炎衣原本的EB，使用YK-41菌株。根據(jù)Kishimoto等人的方法[KENSA TO GIFUTU(試驗(yàn)和技術(shù))18(7)，959-964(1990)]用YK-41菌株感染人的肺細(xì)胞(下文稱為″HL細(xì)胞″)。在24-或6-井佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的感染細(xì)胞被刮出并和培養(yǎng)基一起回收，然后以6000rpm離心分離30分鐘。去掉上層清液后，沉淀物被懸浮在蔗糖，磷酸鹽和谷氨酸的混合溶液中[含7.5(w/v)蔗糖，3.8mMKH2PO4，7mM K2HPO4和5mM谷氨酸，(PH7.4)，下文稱為″SPG″]。用均質(zhì)機(jī)破碎懸浮物然后以2500rpm離心分離10分鐘。去掉上層清液，沉淀物懸浮于SPG中。重復(fù)這些過程5次，然后回收上層清液?；厥盏纳蠈忧逡号c23％(v/v)的Urografin(Nihon Schering K.K.)和50％(w/v)的蔗糖按上層清液Urografin蔗糖＝2∶2∶1的體積比混合，然后以8000rpm離心分離1小時(shí)。去掉上層清液后，回收下層[50％(w/v)蔗糖層]并懸浮于SPG中，洗滌后以10000rpm離心分離30分鐘。吸走上層清液，沉淀物懸浮于SPG中，以1∶4的體積比與密度梯度為26.6-38％(v/v)的Urografin混合，以8,000rpm離心分離1小時(shí)，回收中間層并懸浮于SPG。以10000rpm離心分離30分鐘后，吸去上層清液，沉淀物懸浮于適宜量的SPG中，于是得到EB溶液。分配后，該溶液存儲于4℃或-70℃。
1.2制備肺炎衣原體的MOMP用盤式制備電泳分離和提純上文1.1所得的EB溶液，由此得到肺炎衣原體的MOMP。簡要地說，0.5ml所得的EB溶液[蛋白(EB)濃度727μg/ml]與0.5ml 2X試樣緩沖液
混合，在100℃煮沸3分鐘以使蛋白質(zhì)溶解。然后，將全部體積加入到盤式凝膠(基層凝膠4％；分離凝膠10％)中，進(jìn)行電泳[設(shè)備盤式預(yù)備電泳設(shè)備NA-1800 Nippon Eido K.K.制造；操作條件100V(直流電壓)]并于一定體積回收(0.26ml/部分)。對于每部分進(jìn)行SDS平板電泳(設(shè)備DNA-PAGE電泳設(shè)備NB-5000，Nippon Eido K.K.制造；操作條件100V(直流電壓)]。結(jié)果證明分子量為39.5K的MOMP在第33至45部分被回收(蛋白濃度0.21mg/ml)。
1.3制備雜交瘤細(xì)胞系和單克隆抗體上述過程得到的EB的生理鹽水(0.5ml)與0.6mlFCA(Difco)混合。用近距離聲波定位器(Branson)處理所得混合物得到油包水乳化物，用它作為免疫接種的抗原。用五只8周的BALB/c雌性小鼠，每只腹膜內(nèi)給藥200μl此抗原(一劑中EB的量為10μg/小鼠)。給藥6天和12天后，用FIA(Difco)進(jìn)行免疫接種。此免疫接種后6天后給動(dòng)物放血。用點(diǎn)免疫束測定法(dot immuno binding assay)(下文簡稱為″DIBA″)測定每份得到的血清漿液的抗體效價(jià)。自測定抗體效價(jià)那天開始對呈現(xiàn)最高抗體效價(jià)的動(dòng)物進(jìn)行三天最后免疫接種，自尾部靜脈給藥200μl由上述方法得到的提純MOMP(一劑中的MOMP的量1μg/小鼠)。三天最后免疫接種完成后次日將每只小鼠頸脫位處死并取出脾。然后將單細(xì)胞分散從而制得用于細(xì)胞融合的脾細(xì)胞。細(xì)胞融合的匹配細(xì)胞是P3U1小鼠骨髓瘤細(xì)胞，它是在CO2細(xì)胞培養(yǎng)器(Napco)中，37℃，5％CO2及飽和濕度下，在補(bǔ)以10％(v/v)牛胎兒血清的Dulbecco MEM培養(yǎng)基(下文述為″10F培養(yǎng)基″)里預(yù)告培養(yǎng)的。
上述脾細(xì)胞(4.8×107)和P3U1小鼠骨髓瘤細(xì)胞(1.2×107)混合，以1000rpm離心分離10分鐘。然后吸走上層清液。施以輕微的振動(dòng)，0.2ml細(xì)胞融合加速劑[50％(W/V)聚乙二醇；分子量4000；Merck制造)使細(xì)胞粒松散。1分鐘45秒后，用1分鐘加入10ml培養(yǎng)液。再加入20ml培養(yǎng)液以使細(xì)胞懸浮。然后，將分散液離心分離和逐級分離(300rpm3分鐘，500rpm3分鐘，700rpm3分鐘)。吸走上層清液后，向細(xì)胞粒中加入5％Briclone(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)(下文稱為″10F＋Bri培養(yǎng)基″)以制備細(xì)胞分散液。此細(xì)胞分散液分散在96-井平底多層盤中(Corning)得到細(xì)胞密度為4×104骨髓瘤細(xì)胞/井/0.1ml，然后在37℃，5％CO2和飽和濕度下恒溫培養(yǎng)。
次日，含HAT的10F培養(yǎng)基(補(bǔ)以1×10-4M次黃嘌呤，4×10-7M氨蝶呤，1.6×10-5胸苷和10％(v/v)牛胎兒血清的Dulbecco′s MEM培養(yǎng)基；下文稱為″HAT培養(yǎng)基″)按體積為0.1ml/井加入到井中。此外，每3至4天用HAT培養(yǎng)基替換一半的培養(yǎng)液上層清液；如此，稱為HAT篩選的過程進(jìn)行約2星期。能觀察到雜交瘤細(xì)胞系生長的井中上層清液被收集和用DIBA篩選，制備抗EB的抗體。
用96-井u形底多層盤進(jìn)行DIBA(Corning)。預(yù)先將作為抗原的EB以0.02μg/點(diǎn)的量固定于3mm方膜過濾器上(Advantec；47mm直徑格濾器；Cat.No.A045b047A)，向該過濾器加入10％(v/v)FCS(胎兒腓腸血清)，在室溫下反應(yīng)15分鐘。然后，去掉上層清液，加入100μl的雜交細(xì)胞系培養(yǎng)上層清液，在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。去掉上層清液，加入100μl稀釋500倍的過氧化物酶標(biāo)記的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗體(Cappel Inc.)，室溫下反應(yīng)1小時(shí)。最后，加入4-氯-1-萘酚作為底物使反應(yīng)溶液上色。在固定有抗原膜過濾器上能裸眼觀察到顏色出現(xiàn)的井被斷定為在抗體制備中呈陽性。
在上述篩選得到結(jié)論呈抗體制備陽性的那些井中的雜交瘤細(xì)胞系，通過有限稀釋培養(yǎng)法次克隆。簡單地說，抗體制備陽性雜交瘤細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，測定懸浮液的細(xì)胞密度。然后將懸浮液稀釋，分散在一個(gè)新小盤上，細(xì)胞密度為從2至100個(gè)細(xì)胞/100μl/井，恒溫培養(yǎng)。使用HT＋5％Briclone培養(yǎng)作稀釋劑。
當(dāng)觀察到高倍稀釋的井中有雜交瘤細(xì)胞的生長時(shí)，檢測雜瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，并顯微觀察來證實(shí)其是單克隆，然后重復(fù)同樣的操作過程以制備產(chǎn)生抗EB的單克隆抗體的克隆，其具有很高的能力來維持抗體的產(chǎn)生。對每個(gè)如此獲得的克隆，培養(yǎng)規(guī)模逐漸加大。最后，每個(gè)克隆培養(yǎng)在50ml 10F培養(yǎng)基中，并檢查培養(yǎng)物上層清液產(chǎn)生抗體的特性。
到此所述的試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行了兩遍，最后得到表1所示的10支產(chǎn)生單克隆抗體的克隆菌株。
由上述10支雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體的球蛋白類采用ISOTYPE-Ab-STAT-1成套用具(Kit)(Sang Stat Medical)進(jìn)行測定。
如表1所示，單克隆抗體CP-1，CP-2，CP-4，CP-5，CP-6，CP-7和CP-8對結(jié)膜炎衣原體不呈現(xiàn)反應(yīng)性，但對肺炎衣原體呈現(xiàn)反應(yīng)性。
下一步，將由10F培養(yǎng)基培養(yǎng)每個(gè)產(chǎn)生如表1所示單克隆抗體的雜交瘤克隆而獲得的繁殖細(xì)胞以1×107個(gè)細(xì)胞/小鼠的量給預(yù)先經(jīng)0.5ml Pristan(Wako Purechemical Co.，Ltd.)處理過的BALB/C小鼠由腹腔接種。接種后兩至三周，從每只小鼠體內(nèi)得到腹水，從其中提純得到本發(fā)明的單克隆抗體。
用下述方法提純接種雜交瘤克隆No.6所得到腹水，其中使用了固定化蛋白A的親合柱。簡單的說，向小鼠腹水中加入等量的1.5M甘氨酸和3M NaCl(PH8.9)的混合物。所得混合物通過0.45μm的尼龍過濾器(Corning)，送入蛋白A-Poros(NGK Insulators Ltd.)親合柱，并用1.5M甘油和3M HaCl(PH8.9)的混合物洗滌。然后，用含150mMNaCl的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0)將抗體洗脫。
用1M Tris-HCl緩沖液(PH9.0)中和之后，洗脫物被冷卻，用PBS滲析過夜。測定所回收的溶液在280nm的吸收率(用Model U-2000，Hitachi，Ltd)通過0.2μm乙酸纖維素過濾器(Corning)，于-80℃下貯存，從而制得提純抗體的溶液。
1.4單克隆抗體的特異性分析用免疫印跡法進(jìn)行單克隆抗體的特異性分析。用上文1.1所述的方法制得的EB溶液(EB濃度727μg/ml，測定對肺炎衣原體的反應(yīng)性，具體地說，將含50μg EB的EB溶液與試樣緩沖劑
以1∶1的體積比混合，煮沸10分鐘。然后，所得混合液進(jìn)行電泳[設(shè)備AE-6560，Atto有限公司制造；凝膠Pagel 1020 DL；電泳緩沖劑0.025M Tris，0.192M甘油，0.1％(w/v)SDS，(PH8.3)；操作條件直流電流20mA，80分鐘]。用NA-1510(Nippon Eido K.K.)作為轉(zhuǎn)移設(shè)備，電泳脈體，兩層3mm厚的濾紙(Whatman)和硝化纖維膜(Bio Rad)浸在預(yù)浸漬在冰中的轉(zhuǎn)移緩沖劑
中15分鐘。在一個(gè)墊片上，放有濾紙，凝膠，硝化纖維膜和依此順序的濾紙，然后，將另一個(gè)墊片放在頂端，并將它們放在轉(zhuǎn)換設(shè)備中。該設(shè)備被放在冰中，于50V直流電壓下開啟2小時(shí)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。用PBS(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)洗滌硝化纖維膜(每次2分鐘，共兩次，振搖)，然后用10％FCS/PBS終止(室溫下振搖30分鐘)，再用PBS(Nissui藥物有限公司)，洗滌硝化纖維膜(每次2分鐘，共三次，振搖)，并與每個(gè)表1所列的所有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上層清液反應(yīng)(室溫下振搖1小時(shí))。用PBS(每次兩分鐘，共三次，振搖)洗滌之后，硝化纖維膜與稀釋500倍的過氧化物酶標(biāo)記的兔子抗小鼠免疫球蛋白抗體(Cappel Inc.)在室溫、振搖下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS(每次兩分鐘，共三次，振搖)洗滌硝化纖維膜，然后加入成色溶液(1ml的3mg/ml 4-氯-1-萘酚，5ml PBS，2μl過氧化氫水溶液)進(jìn)行反應(yīng)，直到蛋白帶出現(xiàn)。然后用蒸餾水洗滌膜數(shù)次終止反應(yīng)。
在上述類似條件下進(jìn)行免疫印跡法，用提純的結(jié)膜炎衣原體(菌株L2)的EB分析對結(jié)膜炎衣原體的反應(yīng)性。
結(jié)果是，本發(fā)明的CP-6和CP-7兩個(gè)單元克隆抗體對結(jié)膜炎衣原體的MOMP不呈現(xiàn)反應(yīng)性，而對肺炎衣原體的MOMP呈現(xiàn)反應(yīng)性。
1.5 用熒光抗體技術(shù)分析抗體(對結(jié)膜炎衣原體，鸚鵡衣原體和眼結(jié)膜衣原體的反應(yīng)性)結(jié)膜衣原體，鸚鵡衣原體和眼結(jié)膜衣原體的離析物分別點(diǎn)樣(1μl)于載玻片上，將每一種表1所示的所有雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上層清液置于其上(8μl)。然后，將載玻片放在濕箱子中，反應(yīng)在其中于37℃進(jìn)行3小時(shí)。用PBS和蒸餾水洗滌載玻片，然后空氣干燥?？諝飧稍锖髮?μl稀釋10倍的FITC標(biāo)記的抗小鼠球蛋白/山羊血清(KPL Inc.)放在載玻片上蓋住所有斑點(diǎn)。將載玻片放在濕箱子中，反應(yīng)于37℃下進(jìn)行30分鐘。然后洗滌載玻片并空氣干燥。加入100μl包埋溶液(50％甘油-PBS)以形成包含體，用熒光顯微鏡檢測。結(jié)果，本發(fā)明的CP-6和CP-7兩種單克隆抗體只在它們與肺炎衣原體在一起時(shí)有亮點(diǎn)，說明這些抗體與EB反應(yīng)。
產(chǎn)生上述單克隆抗體CP一6的雜交瘤細(xì)胞以雜交瘤細(xì)胞和CP-6保藏在the National Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technology保藏號(Accession No.)FERM P-14436；BP-5155)。
表1雜交瘤克隆號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10本發(fā)明單克隆抗體CP-1CP-2CP-3CP-4CP-5CP-6CP-7CP-8CP-9CP-10球蛋白類型 IgG2b IgG2b IGM IgG2b IgMIgG1IgG3IgM IgM IgM對肺炎衣原體的反應(yīng)性*1 + + + + + + + + + +對結(jié)膜炎衣原體的反應(yīng)性*2 - - + - - - - - + +*1用DIBA法測定對肺炎衣原體的反應(yīng)性。
*2用DIBA法測定對結(jié)膜炎衣原體L2菌株的反應(yīng)性。只有單克隆抗體CP-3，CP-9和CP-10被發(fā)現(xiàn)呈陽性。
實(shí)施例2制備對肺炎衣原體的MOMP有特異性的單克隆抗體(2)用與實(shí)施例1中1.1—1.3基本相同的方法獲得產(chǎn)生單克隆抗體的克隆(CP-11)的一支菌株，制備抗體CP-11的溶液。
用ISOTYPE Ab-STAT-1 kit(Sang Stat Medical)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞克隆CP-11產(chǎn)生的單克隆抗體的球蛋白類型是IgG1。
用與實(shí)施例1中1.4基本相同的方法分析雜交瘤細(xì)胞克隆CP-11產(chǎn)生的單克隆抗體的特異性。此單克隆衣原體對結(jié)膜炎衣原體的MOMP不呈現(xiàn)反應(yīng)性，對肺炎衣原體的MOMP呈現(xiàn)很強(qiáng)的反應(yīng)性，對鸚鵡衣原體的MOMP只是呈現(xiàn)極弱的反應(yīng)性。
另外，用與實(shí)施例1中1.5基本相同的方法，用間接熒光抗體技術(shù)分析此單克隆抗體。結(jié)果如表2所示。
表2反應(yīng)性*肺炎衣原體+++鸚鵡衣原體±結(jié)膜炎衣原體 -眼結(jié)膜衣原體 -*極強(qiáng)反應(yīng)性 +++強(qiáng)反應(yīng)性 ++弱反應(yīng)性+極弱反應(yīng)性 ±未觀察到反應(yīng)性 -如數(shù)據(jù)所示，根據(jù)用此單克隆抗體的間接熒光技術(shù)，強(qiáng)反應(yīng)可斷定表示肺炎衣原體；極弱反應(yīng)可斷定表示鸚鵡衣原體；不反應(yīng)可斷定表示結(jié)膜炎衣原體或眼結(jié)膜衣原體。
產(chǎn)生此單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞以雜交瘤細(xì)胞系CP-11保藏在the Natioal Institute of Bioscience and Human-technology，Agency of Industrial Science and Technolgy(Accession No.FERM P-14592；Bp-5156)。
從以上結(jié)論可推斷此單克隆抗體能識別肺炎衣原體的MOMP暴露在EB膜外面的那部分氨基酸序列。
實(shí)施例3制備雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體。
用雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體作為單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞AY6E2E8保藏于the National Institute ofBioscience and Human-technology，Agency of IndnstrialScience and Technology(Accession No.FERM P-13688；BP-5154)。
給小鼠腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8得到含單克隆抗體的腹水，向1體積的該腹水中加入3體積PBS，混合，并于3000rpm離心分離10分鐘。用孔徑大小為0.22μm的過濾器濾出上層清液，通過高壓液相色譜法(HPLC法)用預(yù)先經(jīng)PBS平衡了的色譜超級蛋白A柱Chromatop Superprotein A Column)(4.6mm dia.×100mm，NGKInsulators，Ltd.)提純。
用0.22μm過濾器過濾后的試樣(1ml)被倒入該柱中，然后以1ml/min保持3分鐘和5ml/min保持4分鐘加入PBS進(jìn)行洗滌。向此柱中以2ml/min的速率加入1升純水保持5分鐘，其水中溶解有8.77gNaCl，16.7g檸檬酸(一水合物)和14.72g Na2HPO4·12H2O，洗脫單克隆抗體。收集含有單克隆抗體的部分。向這些部分加入2M三(羥甲基)氨基甲烷的水溶液，將pH值調(diào)整至7-9。所得溶液在4℃下貯存。
實(shí)施例4與雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體反應(yīng)的抗原蛋白分析4.1制備肺炎衣原體菌株YK-41的基因組的DNA由上述1.3所得提純的肺炎衣原體菌株YK-41的EB懸浮液(300μl)(蛋白濃度1.37mg/ml)在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。將沉淀物懸浮于500μl含有1mM EDTA的Tris-HCl緩沖液(PH8.0)中(下文稱為″TE緩沖液″)。再進(jìn)行一次類似的離心分離，然后將沉淀物懸浮于300μl TE緩沖液中。向懸浮液中加入30μl 1％的SDS水溶液和30μl 1mg/ml的蛋白酶K水溶液，于56℃恒溫培養(yǎng)30分鐘，溶解EB。向所得溶液中加入350μ1 0.1M的Tris-HCl緩沖液(PH8.0)飽合酚，用渦流混合機(jī)充分混合。然后，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘，回收水層(DNA提取液)。重復(fù)這一提取過程。然后向回收水層中加入2μl 10mg/ml RNase溶液，于37℃恒溫培養(yǎng)2小時(shí)，從而分解RNA。向所得溶液中加入300μl 0.1M Tris-HCl緩沖液(PH8.0)飽和酚，氯仿和異戊醇按25∶24∶1(體積比)的混合液(下文稱為″PCI″)，用渦流混合機(jī)充分混合，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。然后回收所得水層。這一操作總共重復(fù)5次。
向所得溶液中加入1/10體積的10M醋酸銨水溶液和2體積的乙醇，沉淀DNA5分鐘，然后在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。對于沉淀過程，加入600μl 70％的乙醇水溶液，混合后在4℃下以12000rp離心分離5分鐘，重復(fù)此過程兩次。將離心管放置15分鐘，并打開蓋子以干燥沉淀物。將沉淀物溶解在200μl TE中，于-20℃貯存。
4.2制備基因組DNA庫向100μl所得的基因組DNA溶液中加入10μl限制酶的M-緩沖液和10μl限制酶的混合物(通過混合AccI，Hae III各0.4μl和用20μl ITE稀釋AluI的1/50稀釋液)，在37℃恒溫培養(yǎng)20分鐘。反應(yīng)時(shí)間20分鐘是基因組DNA被分解成部分水解的、大小為1kbp-7kbp的DNA片段所需的時(shí)間。預(yù)先用少量的基因組DNA來測定反應(yīng)時(shí)間。向上述反應(yīng)溶液中加入100μl PCI，用渦流混合機(jī)充分混合，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘，然后回收水層。向此水層中加入3M醋酸鈉水溶液(10μl)和乙醇(220μl)，于-80℃下放置15分鐘，使部分水解的DNA沉淀。在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘之后，排掉上層清液。向沉淀物中加入500μl 70％的乙醇水溶液，混合后以12000rpm再次離心分離5分鐘。排掉上層清液，將沉淀物減壓干燥。
將上述得到的部分水解的DNA溶解在20μl純水中。向19μl此溶液中加入14μl下文描述的連接劑(20pmole/μl)，4.5μl 10mMATP，4.5μl含50mM MgCl2的0.2M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，50mM二硫蘇糖醇和500μg/ml牛血清清蛋白(下文稱為″10X絡(luò)合化緩沖液″)，2μl純水和1μl T4連接酶，在16℃下恒溫培養(yǎng)4小時(shí)，從而使連接劑連在DNA上。
5′-AATTCGAACCCCTTCG-3′3′-GCTTGGGGAAGCp-5′將連上連接劑的部分水解的DNA送入Chroma Spin 6000柱，其中的流動(dòng)相是含有0.1M NaCl和1mM EDTA的10mM Tris-HCl緩沖液。收集兩滴洗脫物。用0.8％瓊脂膠電泳分析每一個(gè)部分的位置，回收含1kbp-7kbp DNA片段部分。向如此得到的144μl部分中，加入13μl純水，20μl 10mM ATP，20μl含0.1M MgCl2的0.5M Tris-HCl緩沖液(pH7.6)，50mM二硫蘇糖醇，1mM亞精胺氫氯化物和1mM EDTA(下文稱為″10X磷酸化緩沖液″)和3μl多核苷酸激酶，于37℃下恒溫培養(yǎng)30分鐘，將DNA片段的5′末端磷酸化。向反應(yīng)溶液中加入PCI(200μl)，振搖使混合充分，在4℃下以12000rpm離心分離5分鐘。然后回收水層。向回收層中加入1μl 20mg/ml糖原水溶液，20μl 3M醋酸鈉水溶液和400μl乙醇，以沉淀核苷酸。所得溶液在4℃下以12000rpm離心分離10分鐘。向沉淀物中加入200μl乙醇，重新離心分離。排掉上層清液，將沉淀物空氣干燥，再溶解于1μl純水中。
向0.6μl如此得到的溶液中加入1μl預(yù)先用EcoRI水解了的入gtllDNA(1μg/μl，層基因)0.5μl 10X絡(luò)合化緩沖液，0.5μl10mM ATP，0.4μl T4連接酶和2μl純水，在4℃下恒溫培養(yǎng)過夜。用Gigapack II Gold Packaging Kit(層基因)，將所得λgtll DNA重組體包裹起來。
4.3克隆抗原多肽的DNA密碼大腸埃希桿菌(E.Coli)的Y 1090r菌株全環(huán)被培植在添加3ml10mM MgSO4，0.2％麥芽糖和50μg/ml α-氨基芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，(在1升水中含5g NaCl，10g多胨和5g酵母提取物)，于37℃，振搖下恒溫培養(yǎng)過夜，然后以2000rpm離心分離10分鐘。向沉淀物(E.coli)中加入9ml 10mM的MgSO4水溶液并混合。量出所得E.coli懸浮液的一部分(0.35ml)。向此懸浮液中加入0.1-10μl的λgtll(DNA庫)懸浮液，在37℃下恒溫培養(yǎng)20分鐘，用λgtll感染E.coli。向2.5ml預(yù)先在47℃放置的液體LB瓊脂培養(yǎng)基中加入上述λgtll感染的E.coli。立即從LB瓊脂培養(yǎng)基上將此培養(yǎng)基刮出。上層瓊脂培養(yǎng)基變硬后，細(xì)胞在42℃恒溫培養(yǎng)3-4小時(shí)。當(dāng)觀察到斑塊，將在10mM IPTG水溶液中浸漬的硝化纖維過濾器(φ82mm)置于上層瓊脂培養(yǎng)基的上面，細(xì)胞進(jìn)一步在37℃下恒溫培養(yǎng)12小時(shí)。用裝有黑墨水的注射器針頭貫穿，在硝化纖維過濾器上標(biāo)上三個(gè)不對稱的點(diǎn)。然后從瓊脂培養(yǎng)基上移走硝化纖維，用含有150mM NaCl和0.1％Tween 20的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5，下文稱為″TTBS″緩沖液″)洗滌3次。將瓊脂培養(yǎng)基置于冷藏箱中。
硝化纖維過濾器被浸漬在含150mM NaCl并添加0.1％牛血清清蛋白的20mM Tris-HCl緩沖液中(pH7.5，下文稱為″TBS緩沖液″，在37℃下?lián)u動(dòng)1小時(shí)完成中斷反應(yīng)。然后用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維兩次，浸于5-10μg/ml對肺炎衣原體有特異性的單克隆抗體(AY6E2E8)的TTB溶液，在37℃下振搖1小時(shí)。用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維3次，然后在TTBS緩沖液中的過氧化物酶標(biāo)記的(50ng/ml)抗一小鼠IgG抗體溶液中于37℃下振搖1小時(shí)。用TTBS緩沖液洗滌硝化纖維3次，再用TBS緩沖液洗滌3次。然后將過濾層浸上成色溶液中(其制備是向100ml TBS緩沖液中加入60μl 30％的過氧化氫水溶液和20ml 0.3％的4-氯-1-萘酚甲醇溶液)，在室溫下放置約30分鐘。當(dāng)?shù)玫阶銐虻念伾珪r(shí)，從溶液中將濾層回收出來，用純水洗滌并進(jìn)行空氣干燥。
找出并辯認(rèn)與硝化纖維上的色點(diǎn)對應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上的斑點(diǎn)。用Pasteur′s吸管貫穿在這些位置的瓊脂來回收斑塊。在含有0.1M NaCl，8mM硫酸鎂和0.01％明膠的50mM Tris-HCl緩沖劑(pH7.5，下文稱為″SM緩沖液″)中滴入一滴氯仿后，把回收的斑塊放入其中；將混合物放置過夜，提取斑塊中的λ噬菌體。重復(fù)上述過程直到所有的斑塊變成與上述單克隆抗體可反應(yīng)。于是，克隆了抗原多肽的DNA密碼。
結(jié)果是得到了能表達(dá)肺炎衣原體屬特異性的抗原多肽的λ噬菌體，該抗原多肽已與肺炎衣原體特異性單克隆抗體反應(yīng)。
4.4培養(yǎng)得到的λ噬菌體，提純DNA用與上述4.3基本相同的方法制備斑塊?；厥掌渲幸粋€(gè)斑塊，放入100μl SM緩沖劑中，在4℃下放置過夜，提取λ噬菌體。預(yù)先將250μl E.coli菌件Y1090 r-在LB培養(yǎng)液中恒溫培養(yǎng)過夜，加入λ噬菌體溶液(5-10μl)，在37℃下放置20分鐘，從而用λ噬菌體感染E.coli。預(yù)先將含有10mM硫酸鎂的LB培養(yǎng)基加熱至37℃，把感染了的細(xì)胞放在其中培養(yǎng)，細(xì)胞于搖動(dòng)下于37℃恒溫培養(yǎng)5-7小時(shí)，直到入噬菌體引起E.coli溶解。然后加入250μl氯仿，以3000rpm離心分離10分鐘以去掉E.coli細(xì)胞殘?jiān)?。于是得到λ噬菌體懸浮物。用WizardλPreps Kit(Promega)提純λ噬菌體DNA。
4.5放大肺炎衣原體抗原多肽的DNA密碼在600μl微管中，放入61.5μl純水，10μl 10X反應(yīng)緩沖液(Tris-HCl緩沖液，pH8.3，含有500mM KCl，15mM MgCl2和0.01％明膠)，1μl 20mM dNTP，0.1μl得到的λ噬菌體DNA溶液，1μl 20nMλgtll正向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，1μl 20nMλgtll反向底物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和0.5μl AmpliTaq DNA聚合酶，然后將2-3滴礦物油在其頂端鋪成層。在以下條件下恒溫培養(yǎng)，94℃，30秒，55℃，30秒，73℃ 2分鐘，重復(fù)30次，從而放大DNA。反應(yīng)完成后，對反應(yīng)混合物進(jìn)行低溫熔化瓊脂糖膠體電泳。將放大的DNA剪斷，用Wizard PCR Prep Kit(Promega)提純。
4.6分析DNA基礎(chǔ)序列通過熒光標(biāo)記的終止劑循環(huán)序列方法，用Taq DNA聚合酶分析DNA基礎(chǔ)序列，用PCR放大的DNA作樣板，將反應(yīng)產(chǎn)物供給Model373A DNA Sequencer(Applied Biosystems)。將所得的DNA基礎(chǔ)序列剪輯，結(jié)扎，用DNA序列軟件″DNASIS″(Hitachi SoftwareEngineering)測定它們的氨基酸翻譯區(qū)位。
結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)所得的λ噬菌體DNA，是肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白的氨基酸序列的密碼。
由此可知雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體將肺炎衣原體的53隨爾頓抗原蛋白識別為抗原。
實(shí)施例5制備熒光標(biāo)記的抗體按照前述Ivan Lefkovits等人的方法，用FITC分別給雜交瘤細(xì)胞系CP-11和AY6E2E8產(chǎn)生的單克隆抗體標(biāo)記。
將FITC-Celite(Sigma，Cat，No.F1628)溶解在DMSO中，制備10mg/ml溶液。
另一方面，使用NAP-10柱，用0.1M NaHCO3緩沖液(pH8.2-8.6)代替溶有單克隆抗體的緩沖液。
向1.5ml得到的單克隆抗體溶液(單克隆抗體含量2mg)，加入50μl FITC溶液，在4℃下靜置8小時(shí)。
所得反應(yīng)溶液通過PD-10柱，用PBS平衡。用PBS去掉未反應(yīng)的FITC。于是得到FITC標(biāo)記的單克隆抗體。
實(shí)施例6制備冷凍干燥制劑將1.9mg FITC標(biāo)記的單克隆抗體，7.6mg Evans blue(WakoPurechemical Co.，Ltd.)，1.9g牛血清清蛋白(GIBCO BRL)和1.9ml 10％NaN3(Wako Purechemical Co.，Ltd.)溶解在PBS(-)(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)中至總體積為100ml。
所得溶液被分配在1ml小瓶中，在-80℃下放置1小時(shí)，然后在冷凍干燥器中(Iwaki & Co.，Ltd.)冷凍干燥過夜。如此得到冷凍干燥制劑(即CP-11制劑和AY6E2E8制劑)。
另一方面，用與上述類似的方法，用雜交瘤細(xì)胞系CP-11和AY6E2E8的FITC標(biāo)記的單克隆抗體制備混合的冷凍干燥制劑。實(shí)施例7用直接熒光抗體技術(shù)給肺炎衣原體包含體染色將每一個(gè)由實(shí)施例6制備的冷凍干燥制劑溶解在2ml純水中。在點(diǎn)有肺炎衣原體菌株YK-41的載玻片上放上8μl所得溶液，使所有的點(diǎn)上部位全部被此溶液蓋住。然后，將載玻片放在濕箱子里，反應(yīng)在其中于37℃下進(jìn)行30分鐘。洗滌載玻片并空氣干燥。反應(yīng)產(chǎn)物用100μl包埋溶液[50％(v/v)甘油-PBS]包埋，用熒光顯微鏡檢測。結(jié)果列于表3中。
表3制劑 染色強(qiáng)度*CP-11制劑 +AY6E2E8制劑 +混合制劑 ++*極強(qiáng)的反應(yīng)性 ++強(qiáng)的反應(yīng)性+-如表3所示，無論CP-11制劑還是AY6E2E8制劑均呈現(xiàn)強(qiáng)的反應(yīng)性，使肺炎衣原體的檢測成為可能。與單一制劑相比，混合制劑呈現(xiàn)出極強(qiáng)的反應(yīng)性，用該試劑能夠很好地檢測肺炎衣原體。
本發(fā)明的對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異性反應(yīng)的單克隆抗體在特別檢測肺炎衣原體中非常有用，因?yàn)榇藛慰寺】贵w對微生物中大量含有的MOMP具有特異性反應(yīng)。另外，用少量的此抗體即能完成檢測。
本發(fā)明的單克隆抗體的特征還在于它對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不呈現(xiàn)任何反應(yīng)性，適于將肺炎衣原體感染與結(jié)膜炎衣原體感染區(qū)分開來，后者在臨床上經(jīng)常是單獨(dú)分開的。故，此抗體對準(zhǔn)確診斷出肺炎衣原體感染非常有用。
此外，本發(fā)明的標(biāo)記了的抗體使得能夠利用以此標(biāo)記的物質(zhì)檢測和測定肺炎衣原體。因此，這些抗體對臨床測試中快速處理大量試樣非常有用。
本發(fā)明的對肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白具有反應(yīng)性、并作了標(biāo)記的單克隆抗體對準(zhǔn)確診斷肺炎衣原體感染很有用，因?yàn)榇丝贵w能夠檢測出作為肺炎衣原體屬的特異性抗原的53K道爾頓抗原蛋白。
產(chǎn)生上述單克隆抗體的細(xì)胞系能用于連續(xù)、大量地制備這些抗體。這些細(xì)胞系也可用作抗體基因的來源。
本發(fā)明的用這些細(xì)胞系制備單克隆抗體的方法能夠用以連續(xù)和大量地制備上述的單克隆抗體。
本發(fā)明的檢測和測定肺炎衣原體的方法以及檢測和測定肺炎衣原體的試劑可用在非常精確地檢測和測定肺炎衣原體的方法中。
本發(fā)明的肺炎衣原體感染的診斷方法和肺炎衣原體感染的診斷試劑可用在非常精確地診斷肺炎衣原體的方法中。
根據(jù)本發(fā)明制備產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞系的方法，能夠制備有效產(chǎn)生抗那些蛋白的單克隆抗體的細(xì)胞系，而用常規(guī)的方法卻難以完成抗那些蛋白的單克隆抗體的制備。本發(fā)明產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體能用于特別檢測目標(biāo)蛋白的各種診斷方法和診斷試劑中，它們也可以用作藥物。
上述產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系能用以連續(xù)和大量地產(chǎn)生這些單克隆抗體，還能用作抗體基因的來源。
用上述細(xì)胞系制備單克隆抗體的方法能用以連續(xù)和大量地制備上述單克隆抗體。
權(quán)利要求
1.一種對肺炎衣原體的主要外膜蛋白具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應(yīng)性。
3.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其對肺炎衣原體的初級體具有反應(yīng)性。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具有反應(yīng)性。
5.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中的抗體是被標(biāo)記的。
6.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的。
7.如權(quán)利要求6所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
8.一種單克隆抗體，對肺炎衣原體的53KDa抗原蛋白具有反應(yīng)性且是被標(biāo)記的。
9.如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體，其對結(jié)膜炎衣原體和鸚鵡衣原體的包含體不具有反應(yīng)性。
10.如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體，其中的抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
11.一種產(chǎn)生對蛋白質(zhì)具有特異反應(yīng)性的單克隆抗體的產(chǎn)生抗體細(xì)胞的制備方法，該方法包括給動(dòng)物免疫接種天然和變性蛋白的一種，并用其他蛋白加強(qiáng)劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用骨髓瘤細(xì)胞融合該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，包括給動(dòng)物免疫接種一種天然蛋白并用一種變性蛋白加強(qiáng)劑量，得到一種產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用骨髓瘤細(xì)胞融合該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中的變性蛋白是用洗滌劑或還原劑處理天然蛋白得到的。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中的蛋白是衣原體的主要外膜蛋白。
15.如權(quán)利要求11所述的方法所制備的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
16.一種產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，該細(xì)胞能產(chǎn)生如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
17.如權(quán)利要求16所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，是雜交瘤細(xì)胞包系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)。
18.一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求15所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
19.一種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求16所述的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞。
20.用如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
22.如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體檢測和/或測定肺炎衣原體的方法。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
24.一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
25.如權(quán)利要求24所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
26.一種檢測和/或測定肺炎衣原體的試劑，其中包括如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體。
27.如權(quán)利要求26所述的試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
28.一種用如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
30.一種用如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體診斷肺炎衣原體感染的方法。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
32.一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體作為活性成分。
33.如權(quán)利要求32所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系CP-6(FERM BP-5155)或CP-11(FERM BP-5156)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
34.一種診斷肺炎衣原體感染的試劑，其中包括如權(quán)利要求8所述的單克隆抗體作為活性成分。
35.如權(quán)利要求34所述的診斷試劑，其中的單克隆抗體是雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)Y6E2E8(FERM BP-5154)產(chǎn)生的，且隨后被標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及對來自肺炎衣原體的主要外膜蛋白和初級體具有特異性反應(yīng)，但對結(jié)膜炎衣原體的主要外膜蛋白不具任何反應(yīng)性的單克隆抗體；對肺炎衣原體的53K道爾頓抗原蛋白具有反應(yīng)性，但對結(jié)膜炎衣原林、鸚鵡衣原體的包含體不具任何反應(yīng)性的單克隆抗體；制備這些單克隆抗體的方法；產(chǎn)生它們的細(xì)胞系；用它們檢測和測定肺炎衣原體的方法；含有它們的檢測和測定肺炎衣原體的試劑；用它們診斷肺炎衣原體感染的方法；以它們作為活性成分的診斷肺炎衣原體感染的試劑。
文檔編號A61K39/395GK1133192SQ9511582
公開日1996年10月16日 申請日期1995年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月3日
發(fā)明者黑巖保幸, 馬場憲三, 川越清隆, 井口晃史, 守川俊英, 井筒浩, 中尾義喜, 山木光男, 永山朱美, 中野博子, 齋藤茂 申請人:日立化成工業(yè)株式會社