專利名稱：一種微小rna及其反義核酸在診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域及心臟疾病的診斷、預(yù)防和治療領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs及其反義核酸的新用途，具體涉及一種微小RNA(micr0RNA，miRNA)及其反義核酸在診斷、預(yù)防和/或治療心肌缺血性損傷中的用途。
背景技術(shù)：
目前，心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的第一殺手，缺血性損傷是諸多心血管疾病的重要病理因素，心肌缺血性損傷的主要原因是因為缺氧導(dǎo)致的。如何有效預(yù)防和治療心肌缺血性損傷是目前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究亟待解決的問題。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于真核生物、長度為21_25nt的非蛋白質(zhì)編碼小RNA，它們能以序列特異性方式調(diào)節(jié)基因表達，在發(fā)育、凋亡、代謝以及人類疾病方面都起著不容忽視的作用。miRNA的生理病理調(diào)控機制是近幾年來受到高度重視的一門新型學(xué)科。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是，提供一種微小RNA及其反義核酸在制備用于診斷、預(yù)防、 治療和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷的藥物或試劑盒中的用途。本發(fā)明的另一個目的是，提供包含上述微小RNA及其反義核酸的試劑盒或藥物。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種微小RNA 及其反義核酸在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷的藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體 5’ -ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3，(SEQ ID NO. 1)。優(yōu)選地，所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5，-CUGCCU⑶CU⑶GCCUGCUGU-3，(SEQ IDN0. 2)。優(yōu)選地，所述心肌缺血性損傷包括心絞痛、急性心肌梗塞、室性心律失常、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。另一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷的試劑盒， 所述試劑盒包含用于特異性檢測微小RNA的探針或引物，其中所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5 ’ -ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3，(SEQ ID NO. 1)。優(yōu)選地，所述試劑盒中包含的探針或引物具有以下所示的序列5，-ATTGACAGCAGGCACAGAC-3，(SEQ ID NO. 3)；5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，(SEQ ID NO. 4)。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA反義核酸和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體 5’ -CUGCCU⑶CU⑶GCCUGCUGU-3’ (SEQ ID NO. 2)。優(yōu)選地，所述藥物組合物中包含的微小RNA反義核酸的含量為0. 5-2 μ g。優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒寸。優(yōu)選地，所述藥物組合物以口服或注射的方式給藥；優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內(nèi)注射和心肌注射。綜上所述，本發(fā)明人通過大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs成員之一的miR-214對缺氧心肌細胞的損傷作用，為心肌缺血的治療找到新靶點。具體地，本發(fā)明人對H9C2心肌細胞進行缺氧、缺氧再給氧及H2A處理，Real-time PCR方法確定miR-214在缺氧H9C2細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)miR-214在缺氧、缺氧再給氧及H2A處理的H9C2細胞中表達增加，并且 westenblotting技術(shù)測定細胞中抗凋亡蛋白Bcl-W表達減少。而采用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將 miR-214抑制劑(即miR-214反義核酸)轉(zhuǎn)入缺氧及H2A處理的H9C2細胞中，MTT法測定 H9C2細胞死亡率，發(fā)現(xiàn)miR-214抑制劑使細胞死亡率降低，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)細胞中抗凋亡蛋白 Bcl-W表達增加。此外，采用構(gòu)建的miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒增加缺氧、缺氧再給氧及H2A處理的H9C2細胞的死亡率，并且使H9C2細胞中Bcl-W蛋白的表達降低。在進一步的實驗中，發(fā)現(xiàn)miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒灌注增加大鼠離體缺血再灌注心臟心肌細胞的凋亡，并且降低其心臟心功能恢復(fù)，同時還增加其心臟心肌細胞壞死和肌纖維溶解。因此，miR-214可以作為一種新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于心肌缺血性損傷中的診斷和 /或預(yù)后評估。此外，miR-214的反義核酸可以作為一種新型的藥物用于心肌缺血性損傷的預(yù)防和/或治療。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為miR-214在缺氧處理的H9C2細胞中的表達；缺氧處理時間分別為lh，2h， 4h，8h，隨著缺氧時間延長，miR-214基因表達逐漸增加。圖2為miR-214在缺氧再給氧處理的H9C2細胞中的表達；缺氧處理時間分別為 lh、2h、4h、8h，再給氧時間為Ih ；缺氧池再給氧Ih處理組的miR-214基因表達達到最高值。圖3為miR-214在H2A處理的H9C2細胞中的表達；H202處理0. 5h、lh，隨著H2A 濃度增加，miR-214基因表達逐漸增加。圖4為miR-214抑制劑對缺氧處理的H9C2細胞死亡率的影響；miR-214抑制劑降低了缺氧處理的H9C2細胞死亡率。圖5為miR-214抑制劑對H2A處理的H9C2細胞死亡率的影響；miR-214抑制劑降低了 H2A處理Ih的H9C2細胞死亡率。圖6為BcL-W蛋白在H2A處理的H9C2細胞中的表達；H2A濃度分別為20 μ M、 40 μ Μ，處理時間為Ih ；H2O2處理降低了 H9C2細胞中BcL-W蛋白的表達。圖7為miR-214抑制劑對BcL-W蛋白表達的影響；miR-214抑制劑增加了 BcL-W的
蛋白表達。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實施例中使用的實驗材料和試劑如下H9C2細胞購自ATCC(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)TRIquick試劑購自北京索萊寶科技有限公司；DNTPs購自上海博亞生物技術(shù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Amersham公司；核糖核酸酶抑制因子(RibonucleaseInhibitor)和 Real-time RT PCR試劑盒均購自TaKafci公司；引物序列委托hvitrogen公司合成。實施例1 :miR-214在缺氧處理的H9C2細胞中表達增加本實施例選取對數(shù)生長期的H9C2細胞，將處于對數(shù)生長期的細胞放入低氧培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司生產(chǎn)。型號YCP-30SQ)中，進行缺氧(彡)lh、au4h、
處理。之后，TRIquick 試劑提取總 RNA，制備 c-DNA，Real-time RT PCR 法檢測 miR-214 的表達量，并且以未經(jīng)缺氧處理的細胞作為對照。1、總 RNA 提取采用TRIquick試劑分別提取細胞總RNA。(1)缺氧lh、2h、4h、8h處理后移去培養(yǎng)液，在培養(yǎng)皿中直接加入TRIquick裂解細胞，IOcm2面積加Iml TRIquick0用取樣器吹打混勻。(2)40C 12000rpm離心 lOmin，取上清。每使用 Iml TRIquick 向樣品中加 0. 2ml 氯
仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置5min。(3)4°C 12000rpm離心15min，樣品分為三層。RNA主要在無色的水相。把水相轉(zhuǎn)
移到新管中。(4)在轉(zhuǎn)移到新管中的水相中加入等體積的冰冷異丙醇，混勻，室溫放置20min。(5) 4°C I2OOOrpm 離心 lOmin，去上清。加入 Iml 75% 乙醇(用 RNase-free 水配制)洗滌沉淀。40C 7000rpm離心5min,棄上清。(6)室溫放置涼干，加入適量RNase-free水，充分溶解RNA。(7) -80 V 保存 RNA 樣品。2、miR-214 的 c-DNA 制備1)設(shè)計引物序列miR-214 逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物序列如下(SEQ ID NO. 5)5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGCCT-3’ ；U6逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物序列如下(SEQ ID N0. 6)
5，-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3，。2) miR-214 的 c-DNA 制備5*RT 緩沖液4μ1DNTPs :8μ 1miR-214RT 引物1 μ 1
核糖核酸酶抑制因子(RibonucleaseInhibitor) 1 μ 1RNA 1 μ 1DEPC 7jC :4μ 1M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1加M-MLV 前后充分混勻，42°C lh，95°C 5min, -20°C保存樣品。所制備的miR-214 的 cDNA 序列如下(SEQ ID NO. 7)CACGTGTATGAGTGTACTTCCTGAATAAAGTCAAACGTCTAACTTCTTTTTAGTTCCATAATGTTTAAT GTTTAATTCTATTGTGTGTTTTTCTCCTTTCCCTTTATCCCCTCTCCTTCAATCACCAAATCTGGAAAACAGGCTGA TTGTATCTGTCCAAGAAAAAAGGAACCGCGAAGGAGCCATGGTCCTGGATGGACAGAGTTGTCATGTGTCTGCCTGT CTACACTTGCTGTGCAGAACATCCGCTCACCTGTACAGCAGGCACAGACAGGCAGTCACATGACAACCCAGCCTGAA TGACAACCAGCCATTGAAAGAAAGCTGCCCTCACACCATAGCATCTACACCAAGAGCTACAACCACAGTGAGGGGTT TGGGGGCCTGGGGCTTTTCTGTCGGCTTATTAAAATAAACTCGTATGTAATCCTTCTATTTTGATTCGTATATTAAA ACCTACCCCCCAAGTAAAGGGAGTGGTGCC3) U6 的 c-DNA 制備5*RT 緩沖液4μ1DNTPs :8μ 1U6RT 引物1μ1核糖核酸酶抑制因子(RibonucleaseInhibitor) 1 μ 1RNA 1 μ 1DEPC 7jC :4μ 1M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1加M-MLV 前后充分混勻，42°C lh，95°C 5min, -20°C保存樣品。3、Real-time PCR 法檢測 miR-214 的表達量采用Real-time RT PCR試劑盒(購自TaKafci公司)檢測miR-214的表達量。1)設(shè)計引物序列如下miR-214 上游引物(SEQ ID NO. 3)5， -ATTGACAGCAGGCACAGAC-3，miR-214 下游引物(SEQ ID N0. 4)5， -GTGCAGGGTCCGAGGT-3，U6 上游引物(SEQ ID N0. 8)5， -CTCGCTTCGGCAGCACA-3，U6 下游引物(SEQ ID N0. 9)5， -AACGCT TCA CGA ATT TGCGT-3，2)miR-214Real-time RT PCR 反應(yīng)體系如下Mix :12. 5μ 1miR-214 上游引物:0. 5 μ 1miR-214 下游引物:0. 5 μ 1ROX 染料0·5μ1c-DNA 2 μ 1
雙蒸水9μ 1U6Real-time RT PCR 反應(yīng)體系如下Mix :12. 5μ 1U6 上游引物0. 5μ1U6 下游引物0. 5μ1ROX 染料0·5μ1c-DNA 2 μ 1雙蒸水9μ 1Real-time RT PCR 反應(yīng)條件如下①95°C :30s②95°C :5s(3) 58°C :30s(4) 72°C :30s循環(huán)步驟②至④45次。3)數(shù)據(jù)處理miR-214表達量用下式計算Δ Ct 樣品=Ct 樣品-Ctti^ll6Δ Ct對照=Ct對照_Ct對照^Δ Δ Ct = Δ Ct 樣品-Δ Ct 對照miR-214相對表達量變化=2_Δ ΔΕ 具體結(jié)果如圖1所示?？梢姡S著缺氧處理時間的延長，miR-214基因表達逐漸增加。實施例2 :miR-214在缺氧再給氧處理的H9C2細胞中表達增加本實施例選取對數(shù)生長期的H9C2細胞，放入低氧培養(yǎng)箱中進行缺氧l%)lh、 ^!、處、》!處理，之后，再將細胞移到CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司。型號MC015AC)中繼續(xù)培養(yǎng)Ih0TRIquick 試劑提取總 RNA，制備 c_DNA，Real-time RT PCR 法檢測 miR-214 的表達量，具體的方法參見實施例1。實驗結(jié)果如圖2所示?？梢?，缺氧池再給氧Ih處理組的miR-214基因表達達到
最高值。實施例3 :miR-214在H2R處理的H9C2細胞中表達增加本實施例選取對數(shù)生長期的H9C2細胞，采用不同濃度的H2O2(20 μ Μ、40 μ M、 80 μ Μ)處理不同時間(0· 5h、lh、2h)。TRIquick 試劑提取總 RNA，制備 c_DNA，Real-time RT PCR 法檢測 miR-214 的表達量，具體的方法參見實施例1。實驗結(jié)果如圖3所示?？梢?，H2O2處理0jh、lh，隨著H2O2濃度增加，miR-214基因表達逐漸增加。此外，還采用westen blotting技術(shù)(具體操作見Methods in molecularbiology (Clifion,N. J.) 1995 ；49 :423-437)檢測 H2R 處理的 H9C2 細胞中 BcL-W蛋白的表達，并以actin蛋白為對照。電泳檢測結(jié)果見圖4，可見，當(dāng)H2A濃度分別為20 μ Μ、40 μ Μ,處理時間為Ih時， H2O2處理降低了 H9C2細胞中BcL-W蛋白的表達。實施例4 :miR-214抑制劑降低缺氧處理的H9C2細胞的死亡率本實施例選取對數(shù)生長期的H9C2細胞，用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將分別將不同量Qy g、 4ug>8yg)的miR-214抑制劑(即為合成的miR-214反義核酸序列)轉(zhuǎn)入H9C2細胞中，進行缺氧2h處理，采用MTT法(具體操作見J Immunol Methods, 1983,65(1 2) :55)測定 H9C2細胞的死亡率。實驗結(jié)果如圖5所示?？梢姡琺iR-214抑制劑降低了缺氧處理池的H9C2細胞的
死亡率。實施例5 :miR-214抑制劑降低H2A處理的H9C2細胞的死亡率本實施例選取對數(shù)生長期的H9C2細胞，用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將分別將4 μ gmiR-214抑制劑(即為合成的miR-214反義核酸序列)轉(zhuǎn)入H9C2細胞中，用20μΜ H2O2處理lh，以未加入miR-214抑制劑的細胞為陰性對照，采用MTT法測定H9C2細胞的死亡率。實驗結(jié)果如圖6所示?？梢?，miR-214抑制劑降低了 H2A處理Ih的H9C2細胞的死亡率。此外，還采用westen blotting技術(shù)檢測miR-214抑制劑對H2A處理的H9C2細胞中BcL-W蛋白表達的影響。電泳結(jié)果見圖7，表明miR-214抑制劑增加了 H2A處理的H9C2細胞中BcL-W蛋白的表達。實施例6 :cDNA質(zhì)粒的構(gòu)建本實施例采用RT-PCR、DNA純化和連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞構(gòu)建質(zhì)粒，其中構(gòu)建質(zhì)粒所采用的cDNA序列為實施例1所制備的miR-214的cDNA序列。1)RT-PCR 反應(yīng)RT-PCR所用引物序列(包括miR-214序列在內(nèi)的一段DNA序列(500bp)的引物)Ad-rno-214-F(上游引物，SEQ ID NO. 10)5’ -AGACTCGAGCACGTGTATGAGTGTACTTCC-3’Ad-rno-214-R(下游引物，SEQ ID NO. 11)5’ -AATACTAGTGGCACCACTCCCTTTACTTGG-3’RT-PCR 反應(yīng)體系2*PCR TaqMix :20μ 1Ad-rno-214-F :2μ 1Ad-rno-214-R :2μ 1DNA 2 μ 1雙蒸水14μ 1混勻，12000rpm 離心 5min。其中2*PCR TaqMix (購自北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司)。RT-PCR 反應(yīng)條件
①95°C:5min②95°C :30s(3) 56°C :30s④72 °C: Imin(5) 72°C IOmin循環(huán)步驟②至④35次。
2) RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化采用DNA純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)，具體操作如下(I)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳電泳條件8%的瓊脂糖凝膠。恒壓 (100 伏特)45min。( 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN。50°C水浴放置lOmin，至膠完全溶解。(4)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中，室溫放置aiiin，12000rpm離心 60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(5)向吸附柱CA2中加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。(6)向吸附柱CA2中加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液。(7)將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm離心aiiin，將吸附柱CA2置于室溫放置 IOmin0(8)將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心^iiin收集DNA溶液。3)連接將純化的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物與Siuttle Vector 1. O-CMV載體連接Shuttle Vector 1. 0-CMV 載體雙酶切(1)酶切體系及條件spel :2μ 1xhol 2 μ 1NEB buffer2 :4μ 1DNA 溶液32 μ 1混勻，離心，37°C水浴4h，65°C水浴20min終止反應(yīng)。(2)酶切產(chǎn)物純化酶切產(chǎn)物純化同RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化。純化的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物與酶切、純化的Siuttle Vector 1. O-CMV載體連接采用TaKaRa公司生產(chǎn)的DNA連接試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)。連接體系及條件Solution I :5μ 1DNA溶液2. 5μ1Shuttle Vector 1. O-CMV 載體溶液2. 5 μ 1
輕輕混勻，離心，16°C過夜。4)轉(zhuǎn)化采用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，具體操作如下取感受態(tài)細胞懸液50 μ 1，加入上述連接產(chǎn)物，混勻，在冰浴中靜置30min。將離心管置于42oC水浴中放置60s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，細胞冷卻aiiin。向離心管中加入300 μ 1無菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng)Ih。取200 μ 1上述培養(yǎng)基液，涂于LB培養(yǎng)基板上(含氨卞青霉素)，37 °C培養(yǎng)過夜。5)提取質(zhì)粒挑取上述培養(yǎng)板上的菌落，加入到:3ml LB培養(yǎng)基中(含氨卞青霉素)，混勻后置于 37°C搖床振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)過夜的菌液加入到250ml LB培養(yǎng)基中(含氨卞青霉素)，混勻后置于 37°C搖床振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒采用高純度質(zhì)粒大提試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)，實驗步驟如下取IOOml上述過夜培養(yǎng)的菌液，室溫IOOOOrpm離心;3min收集細菌。盡量去除上清。向留有菌體沉淀的離心管中加入IOml溶液P1，徹底懸浮細菌細胞沉淀。向離心管中加入IOml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，室溫放置 5min。向離心管中加入IOml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，室溫放置 IOmin0 IOOOOrpm離心5-lOmin，將溶液全部倒入過濾器CS中，慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50ml管中。向濾液中加入0. 35倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻。40C IOOOOrpm離心30min，輕輕倒掉上清液，將其倒置在吸水紙上。向管中加入6ml 70%乙醇充分漂洗沉淀，4°C IOOOOrpm離心lOmin，輕輕倒掉上清
液。重復(fù)此步驟一次。將離心管敞口室溫放置20min。使乙醇充分揮發(fā)后加入1_1. 5ml洗脫緩沖液TB， 充分溶解沉淀。實施例7 :miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒增加缺氧、缺氧再給氧及H2A處理的 H9C2細胞的死亡率和降低Bcl-W蛋白的表達l)miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和腺病毒擴增采用Roche 公司生產(chǎn)的 FuGENE HD transfection Reagent 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 HEI^93 細胞，轉(zhuǎn)染步驟如下(1) HEK293細胞在轉(zhuǎn)染前24h接種于2個IOcm的細胞培養(yǎng)盤中，使之在轉(zhuǎn)染時細胞匯聚率為50% -70%。(2)細胞在轉(zhuǎn)染之前12h用無雙抗的DMEM(10% FBS)換液。(3)吸15 μ 1轉(zhuǎn)染試劑與135 μ 1 DMEM(無血清、無雙抗)混勻，室溫靜置5min。然后與事先混勻好的20 μ 1 DNA和130 μ 1 DMEM(無血清、無雙抗)混勻，室溫靜置25min 30mino(4)吸走IOcm皿中的培養(yǎng)基，將(3)中的混合液加入至IOcm皿中，同時再補加8ml DMEM(10% FBS，無雙抗),37°C,5% CO2 培養(yǎng) 10 12h。(5)將培養(yǎng)基吸走，換上 anl DMEM(10% FBS，有雙抗)37°C，5% CO2 培養(yǎng) 7_12d.2)原代病毒的收集(1)當(dāng)細胞出現(xiàn)致細胞病變效應(yīng)(CPE)現(xiàn)象后，7-12d，細胞會變圓脫落，此時即可收細胞。(2)將培養(yǎng)液連同細胞一起吸進15ml離心管，2000rpm/min,離心5min。(3)去上清，向沉淀中加入400 μ 1無血清DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞，于_70°C保存。(4)收集的細胞于-70°C和37°C反復(fù)凍融3次。(5)4°C,5000rpm/min，離心 lOmin。(6)吸取上清(原代病毒)于另一無菌印pendorf管_70°C凍存。3)病毒富集(1)將HEK293細胞以50% -70%匯聚率平鋪于IOcm皿中，以30_50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天出現(xiàn)明顯的細胞裂解和CPE現(xiàn)象。感染后3-5天按原代病毒收集方法收集病毒。(2)為了進一步擴增，將上述收集的病毒上清進一步感染HEK293細胞，以獲得足
夠量的病毒。4)腺病毒感染H9C2細胞及處理將生長狀態(tài)良好的H9C2細胞以2 X IO5個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁生長至60 80 %融合時，予重組腺病毒以2 X 105PFU/ml感染細胞后繼續(xù)培養(yǎng)細胞Mh 后，分別進行以下處理(1)缺氧處理將腺病毒感染的H9C2細胞和沒有感染的H9C2細胞放入低氧培養(yǎng)箱中，進行缺氧1%) 處理。(2)缺氧再給氧處理將腺病毒感染的H9C2細胞和沒有感染的H9C2細胞放入低氧培養(yǎng)箱中，進行缺氧(< ) 處理后，再將細胞移到(X)2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh。(3)H2O2處理在腺病毒感染的H9C2細胞和沒有感染的H9C2細胞中分別加入 H2O2 (濃度為20 μ M)，繼續(xù)培養(yǎng)Ih。5)測定H9C2細胞的死亡率采用MTT法測定H9C2細胞的死亡率，具體操作如下(1)細胞懸液以IOOOrpm離心10分鐘，棄上清液；(2)沉淀加入0. 5-lml MTT,吹打成懸液；(3)37°C下保溫2小時；(4)加入4_5ml酸化異丙醇(定容)，打勻；(5) IOOOrpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點。結(jié)果顯示，miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒增加缺氧、缺氧再給氧及H2A處理的 H9C2細胞的死亡率。6)測定H9C2細胞中Bcl-W蛋白的表達(1)收集細胞及蛋白的提取，具體操作如下
a)將長滿細胞的培養(yǎng)皿放置在冰上，用吸液管吸出培養(yǎng)液。加入足夠的冷的PBS 在培養(yǎng)皿中充分洗滌細胞表面，以洗去殘留的培養(yǎng)基，倒掉PBS，重復(fù)以上操作2-3遍。在最后一次洗滌中盡可能吸干殘留的PBS，盡量在冰上操作。b)向培養(yǎng)瓶中加入冷的RIPA裂解緩沖液lml。然后用細胞刮子沿著瓶壁開始刮細胞。c)吸出刮好的細胞裂解液置于1. 5ml離心管中(置于冰上)。d)樣品插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2-3秒，重復(fù) 3-4次。離心IOOOOrpm, 10分鐘，留取上清。e)取出小量細胞裂解液測其蛋白濃度，分裝保存在-70°C。(2)westen blotting確定H9C2細胞中Bcl-W蛋白的表達，實驗步驟如下a)取相同質(zhì)量的細胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度)，并加等體積的2X電泳加樣緩沖液，沸水浴中8分鐘，12000rpm離心5分鐘。b)上樣c)電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)d)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(IOOmA 40分鐘)e)封閉1小時，一抗(1 1000)孵育過夜0度)。二抗(1 2000)孵育(室溫)2小時。f)發(fā)光。結(jié)果顯示，miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒降低缺氧、缺氧再給氧及H2A處理的 H9C2細胞中Bcl-W蛋白的表達。實施例8 :miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒灌注增加大鼠離體缺血再灌注心臟心肌細胞的凋亡、降低心功能恢復(fù)，增加心肌細胞壞死和肌纖維溶解1)大鼠離體心臟缺血再灌注方法大鼠腹腔注射20 %烏拉坦(5mL/kg)，麻醉后，股靜脈注射0. 1 %肝素(0. 6mL/ kg)，2 ;3min后，迅速取出心臟，置于Langendorff灌流裝置上，主動脈逆行灌注 Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L) =NaCl, 118. 0 ；KCl，4. 7 ；KH2PO4,0. 93 ；MgSO4 ·7Η20，1. 2 ； CaCl2,1. 5 ；NaHCO3, 25 ；C6H12O6,11. 0 ;pH 7. 4。37°C恒溫、恒流灌注，并以 95% 02_5% 0)2混合氣飽和。采用停灌120min，復(fù)灌60min復(fù)制I/R損傷模型。在停灌前5分鐘，用加入IO7PFU/ L的腺病毒灌流液灌注心臟。2)測定心肌細胞的凋亡采用羅氏TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒測定心肌組織的細胞凋亡，實驗步驟如下心肌組織常規(guī)固定，石蠟包埋切片。PBS洗細胞一次，加入0. 1% TritonX-1000. 檸檬酸鈉，在冰上孵育anin。PBS 洗2次，干燥樣品5min。在每個切片上加入50 μ 1 Tunel混合試劑。2個陰性對照加50 μ 1 Labelsolution (vial 2)。[Tunel 混合試劑的配制Label solution (vial 2)酶液 (viall) = 9 1]。 搖動載玻片，保證混合試劑覆蓋整個組織。 蓋上蓋玻片，用錫薄紙包裝，在培養(yǎng)箱內(nèi)放置1小時。
PBS洗3次。封片。樣品在熒光顯微鏡下直接檢測，激發(fā)波長為450-500nm。發(fā)射波長為 515-565nm。結(jié)果顯示，miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒灌注增加大鼠離體缺血再灌注心臟心肌細胞的凋亡。3)檢測離體心臟的心功能，具體操作如下在大鼠離體缺血再灌注心臟模型的制備過程中，經(jīng)房室瓣插入帶球囊的心導(dǎo)管抵左心室，充盈球囊使左心室舒張末壓小于10mmHg(lmmHg = 0. 133kPa)。接壓力換能器并輸入計算機，監(jiān)測心功能。心功能指標(biāo)包括左心室最大收縮壓(LVESP)，左心室最大舒張壓 (LVEDP)，左心室收縮壓最大變化率(+dp/dtmax)、左心室舒張壓最大變化率(-dp/dtmax)、 心率(服)。結(jié)果顯示，miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒灌注降低大鼠離體缺血再灌注心臟心功能恢復(fù)。4)檢測心肌細胞壞死和肌纖維溶解情況心臟再灌注結(jié)束后，留取心尖部心肌組織，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色， 顯微鏡下觀察心肌細胞壞死和肌纖維溶解情況。結(jié)果顯示，miR-214質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擴增的腺病毒灌注增加大鼠離體缺血再灌注心臟心肌細胞壞死和肌纖維溶解。
權(quán)利要求
1.一種微小RNA及其反義核酸在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷的藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’ -ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3，(SEQ ID NO. 1)。
2.根據(jù)要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5-CUGCCUGUCUGUGCCUGCU⑶-3’ (SEQ ID NO. 2)。
3.根據(jù)要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心肌缺血性損傷包括心絞痛、心肌梗塞、室性心律失常。
4.一種用于診斷和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷的試劑盒，所述試劑盒包含用于特異性檢測微小RNA的探針或引物，其中所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’ -ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3，(SEQ ID NO. 1)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含的探針或引物具有以下所示的序列5，-ATTGACAGCAGGCACAGAC-3，(SEQ ID NO. 3)；5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，(SEQ ID NO. 4)。
6.一種用于預(yù)防和/或治療心臟疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的微小RNA反義核酸和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’-CUGCCU⑶CU⑶GCCUGCUGU-3’ (SEQ ID NO. 2)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中包含的微小RNA 反義核酸的含量為0. 5-2 μ g。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物以口服或注射的方式給藥；優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、冠狀動脈內(nèi)注射和心肌注射。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA及其反義核酸在診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估心肌缺血性損傷中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含以下序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3’。該微小RNA可以作為一種新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于心肌缺血性損傷中的診斷和/或預(yù)后評估。此外，該微小RNA的反義核酸可以作為一種新型的藥物用于心肌缺血性損傷的預(yù)防和/或治療。
文檔編號A61K48/00GK102453757SQ20101052240
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者張素清, 李倩, 李培峰, 龍波 申請人:中國科學(xué)院動物研究所