專利名稱：含st-246的藥物組合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ST-246是美國(guó)Siga公司研發(fā)的一種抗痘病毒藥物，ST-246的化學(xué)名為4_三 氟甲基-N-(3，3a，4，4a，5，5a，6，6a-八氫-1，3_ 二氧_4，6-亞乙烯基環(huán)丙基[f]異氮 雜-2 (IH)茚基)-苯甲酰胺{4-trifluoromethyl-N- (3，3a, 4，4a, 5，5a, 6,6a-octahydro-l， 3-dioxo_4，6-ethenoeyeloprop[f]isoindol-2(IH)-yl)-benzamide monohydrate}， ST-246存在立體異構(gòu)體，Robert等人的國(guó)際專利申請(qǐng)W02004112718A2、W02008130348A1 已公開(kāi)了該化合物、化合物的合成及其治療痘病毒及其相關(guān)感染疾病的應(yīng)用，并對(duì)ST-246 的結(jié)構(gòu)用1H-NMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，并對(duì)性質(zhì)進(jìn)行了研究，如，所述的合成方法為，將環(huán)庚三 烯、馬來(lái)酸酐與二甲苯的混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)得到固狀物后，用叔丁基甲醚 結(jié)晶，所得結(jié)晶產(chǎn)物和4-三氟甲基苯甲酰胼于乙醇中加熱回流反應(yīng)后用乙酸乙酯正己 烷(1 1)重結(jié)晶得目的產(chǎn)物。但是對(duì)存在的立體化學(xué)未提及，包括立體異構(gòu)體的表征及 其歸屬，按W02004112718A2所述方法制備的ST-246是否為純式I化合物還是式I化合物 和式II化合物的混合物及其相應(yīng)的含量無(wú)法確定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物和式II所示的化合 物，所述藥物組合物中式I所示化合物的質(zhì)量含量大于等于98. 5%，式II所示化合物的質(zhì) 量含量小于等于0.5% ； 所述藥物組合物中式I所示化合物的質(zhì)量含量可進(jìn)一步為大于等于99. 0%，式II 所示化合物的質(zhì)量含量可進(jìn)一步為小于0. 2%。本發(fā)明所述藥物組合物的制備方法(即高純度ST-246的制備方法)，包括下述步 驟氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將式III所示化合物與4-三氟甲基苯甲酰胼在有機(jī)溶劑中進(jìn)行加熱反應(yīng)， 得到所述藥物組合物的粗品； 所述方法還包括對(duì)藥物組合物粗品進(jìn)行純化的步驟將所述藥物組合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L鹽酸和水萃取，收集有機(jī)層，過(guò)濾，得到初步純化的藥 物組合物；再用體積比為1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，得 到純化的藥物組合物。其中，所述有機(jī)溶劑選自下述溶劑中的至少一種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋 喃、乙二醇獨(dú)甲醚和二氧六環(huán)；所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為65-85°C，反應(yīng)時(shí)間為12-15小時(shí)。為了得到高純度的ST-246，上述方法中所用的式III所示化合物的原料中，式III 所示化合物的質(zhì)量含量大于等于98. 5%，雜質(zhì)式IV所示化合物的質(zhì)量含量應(yīng)小于1. 5%。式III、式IV所示化合物的含量測(cè)定方法可采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-質(zhì)量濃度0.4% 磷酸二氫銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30°C。在該色譜條件 下，式III、式IV所示化合物可實(shí)現(xiàn)完全分離。上述高純的式III所示化合物可按照下述方法制備得到將環(huán)庚三烯、馬來(lái)酸酐 與二甲苯的混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)12 18小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物冷卻至室 溫，過(guò)濾，收集固體，將固體干燥，得到類白色結(jié)晶性產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物用叔丁基甲醚重結(jié)晶 得到式III所示化合物；所述反應(yīng)的反應(yīng)體系中環(huán)庚三烯與馬來(lái)酸酐的摩爾比為1 1 1 1.5。本發(fā)明所制備的藥物組合物中式I、式II所示化合物的含量可采用HPLC法進(jìn)行
(式 III)。檢測(cè)，色譜條件如下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙 腈_質(zhì)量濃度0. 4%磷酸二氫銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫 30°C，定量限為0. 02%。在該色譜條件下，式I、式II所示化合物可實(shí)現(xiàn)完全分離。為了更準(zhǔn)確的測(cè)定藥物組合物中立體異構(gòu)體ST-246’ (式II化合物)的含量，以 確保組合物中ST-246的高含量，本發(fā)明還制備了高純度的立體異構(gòu)體ST-246’作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì) 照。式II所示化合物的制備方法，包括下述步驟氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將式IV所示化合物與 4_三氟甲基苯甲酰胼在有機(jī)溶劑中進(jìn)行加熱反應(yīng)，得到式II所示化合物；
(式 II)(式 IV)。所述有機(jī)溶劑選自下述溶劑中的至少一種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、乙 二醇獨(dú)甲醚和二氧六環(huán)；所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為65-85°C，反應(yīng)時(shí)間為12-15小時(shí)。其中，式IV所示化合物可按照下述方法制備得到將環(huán)庚三烯、馬來(lái)酸酐與二甲 苯的混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)12 18小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過(guò) 濾，收集濾液，將濾液減壓濃縮，濃縮物加入叔丁基甲醚中加熱溶解，放至室溫，待析出固 體后，過(guò)濾，得固體產(chǎn)物；將所得固體產(chǎn)物溶于乙酸乙酯進(jìn)行硅膠柱層析，采用體積比為 1/13-1/9的乙醚/正己烷混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，收集目標(biāo)洗脫液，濃 縮，用二甲苯重結(jié)晶，得到式IV所示化合物；所述反應(yīng)的反應(yīng)體系中環(huán)庚三烯與馬來(lái)酸酐 的摩爾比為1 1 1 1. 5。式II所示化合物的制備方法還包括下述純化步驟將式II所示化合物溶于乙酸 乙酯中，然后依次用0. 2 0. 5mol/L鹽酸和水萃取，收集有機(jī)層，過(guò)濾，得到初步純化的式 II所示化合物；再用體積比為1 1 1 1.5的乙酸乙酯-正己烷的混合溶劑進(jìn)行重結(jié) 晶，得到純化的式II所示化合物。式II所示化合物的純度檢測(cè)方法采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-質(zhì)量濃度0. 4%磷酸二氫 銨的混合溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30°C。按照上述方法制備的式II所示化合物的純度最高可達(dá)98. 0%以上，該產(chǎn)品可作 為ST-246，標(biāo)準(zhǔn)品使用。此外，在該色譜條件下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為乙 腈-質(zhì)量濃度0.4%磷酸二氫銨(50 50, ν/ν)；流速為0. 5-lml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱 溫30°C ；對(duì)所制備的藥物組合物中含有的主要成分(式I、式II所示化合物)以及可能含 有的雜質(zhì)如式III、式IV、式V、式VI和式VII化合物可以實(shí)現(xiàn)完全分離。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述藥物組合物的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的藥物組合物的應(yīng)用是其在制備抗痘病毒藥物中的應(yīng)用。以所述藥物組合物為活性成分制備的抗痘病毒藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述藥物組合物的治療有效劑量為250_800mg，優(yōu)選為400mg。所述抗痘病毒藥物可由活性組分和藥用載體制成口服制劑。所述口服制劑的劑型 優(yōu)選為片劑、膠囊劑、粉劑或顆粒劑。本發(fā)明的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的片劑，其中所述藥學(xué)上可 接受載體包括藥用片劑的稀釋劑、粘合劑、崩解劑和潤(rùn)滑劑；其中稀釋劑可選擇微晶纖維 素、淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、糊精、甘露醇、聚乙烯醇中的一種或多種。粘合劑可選擇淀粉 漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和明膠漿中的一種。崩解劑可選擇 淀粉、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮中的一種。潤(rùn)滑劑可選擇滑石粉、硬脂酸鎂、微粉 硅膠中的一種或兩種。本發(fā)明片劑的制備方法是式I、式II組合物和稀釋劑、崩解劑分別 研細(xì)過(guò)篩，混合均勻，用黏合劑制成軟材，篩濾制粒，置50-60°C條件下干燥，再篩濾整粒后 加入潤(rùn)滑劑，混合均勻，壓片。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的膠囊劑，其中所述藥學(xué) 上可接受載體包括微晶纖維素、淀粉、乳糖、糊精、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基淀粉 鈉、微粉硅膠或40CP-100CP乙基纖維素、硬醋酸鈉中的一種或幾種，本發(fā)明膠囊劑的制備 方法是式I組合物和所述藥學(xué)上可接受載體分別研細(xì)過(guò)篩，混合均勻，裝膠囊，或用黏合劑 制成軟材，篩濾制粒，置50-60°C條件下干燥，再篩濾整拉后加入潤(rùn)滑劑，混合均勻，裝膠囊。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成的顆粒劑，其中所述藥學(xué) 上可接受載體包括成型劑，可選用如β-環(huán)糊精、乳糖和糊精中的至少一種，矯味劑可選 用，如蔗糖、碳酸鈉、椰子香精中的至少一種，崩解劑可選用，如可溶性淀粉、羧甲基淀粉鈉 中的一種；粘合劑可選用，如羥丙基甲基纖維素或其它臨床上可接受的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明 顆粒劑的制備方法為按處方量取式I組合物與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒 即得產(chǎn)品；或?qū)⒃o料混合按處方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再 于30-75°C干燥，12目篩整粒，將整粒好的顆粒加入已過(guò)80目篩的椰子香精混合均勻，分裝 即得顆粒劑。本發(fā)明的的抗痘病毒藥物可以是按常規(guī)制劑方法制備成粉劑，其中所述藥學(xué)上可 接受載體包括藥用的稀釋劑，其中稀釋劑可選擇微晶纖維素、淀粉、乳糖、預(yù)膠化淀粉、糊 精中的一種或多種。本發(fā)明制備粉劑方法是含式I化合物的組合物和稀釋劑分別研細(xì)過(guò) 篩，混合均勻，分裝。本發(fā)明意義在于本發(fā)明提供了式I化合物含量高的藥物組合物及其制備方法， 通式還提供了該藥物組合物的質(zhì)量控制方法。體外抗痘病毒活性試驗(yàn)表明，S-246含量高 的藥物組合物對(duì)痘苗病毒天壇株感染的Vero E6細(xì)胞具有保護(hù)作用。


圖1為式III化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖2為式III化合物的N. 0. E(DMSO)圖譜。圖3為式I化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。
圖4為式I化合物的N. 0. E (DMSO)圖譜。圖5為式I化合物的13C-WR(DMSO)圖譜。圖6為式I化合物的紅外光譜。圖7為式I化合物的1H-1H COSY(DMSO)圖譜。圖 8 式 I 化合物的 13C-1H COSY(DMSO)圖譜。圖9式I化合物的13O1H HMBC (DMSO)圖譜。圖10為式I化合物的DEPT (DMSO)圖譜。圖11為式I化合物的X-射線晶體衍射圖譜。圖12為式IV化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖13為式IV化合物的N. 0. E (DMSO)圖譜。圖14為式II化合物的1H-NMR(CDCl3)圖譜。圖15為式II化合物的N. 0. E(DMSO)圖譜。圖16為式II化合物的X-射線晶體衍射圖譜。圖17為含式I化合物的組合物的HPLC圖譜。圖18為式II化合物的HPLC圖譜。圖19為式III化合物的HPLC圖譜。圖20為式IV化合物的HPLC圖譜。圖21為式V化合物的HPLC圖譜。圖22為式VI化合物的HPLC圖譜。圖23為式VII化合物的HPLC圖譜。圖24式I、式II、式III、式IV、式V、式VI和VII化合物的混合物的HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所用的4-三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)可按照下述方法制備
得到 1、中間體4-三氟甲基苯甲酸乙酯(式VI化合物)的合成在攪拌和冷卻下，30min內(nèi)將178. 5g(l. 5mol)氯化亞砜滴加到190g(Imol) 4_三氟 甲基苯甲酸(式VII化合物)和1.5L無(wú)水乙醇的混合物中。滴加完后，緩緩升溫至78°C， 并在此溫度下回流6h，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束，蒸出過(guò)量的乙醇和氯化亞砜后，加入2L水，靜 置分層，分出有機(jī)相，水層用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相并用IL飽和碳酸鈉溶液洗滌， 無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸出乙酸乙酯，得無(wú)透明液體產(chǎn)物202. 7g(93. 0% )0 b. p. 81°C /5mmHg。
2、4_三氟甲基苯甲酰胼(式V化合物)的合成將4-三氟甲基苯甲酸乙酯218g (l.Omol)，85 %水合胼114g(1.5mol)于 500mL乙醇溶液中攪拌回流240min，TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束。冷卻結(jié)晶，過(guò)濾，干燥得到 182. 5g(88.8%)無(wú)色晶體。m ρ 116 118°C。薄層檢測(cè)展開(kāi)劑甲醇-石油醚_乙酸乙 酯(10 10 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 7. 883(d，2H) ； δ 7. 729(d，2H) ； δ 7. 722(s， 1H, ΗΝ) ； δ 4. 182 (s，2Η，NH2)。實(shí)施例1、制備反式-四環(huán)[3. 2. 2. O24]壬烷_(kāi)6_烯-面內(nèi)_8_面內(nèi)_9_ 二羧酸酐 (式III化合物)將環(huán)庚三烯(50g，0.543mol)、馬來(lái)酸酐(61. 3g，0. 624mol)與二甲苯(300ml)的混 合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至120°C反應(yīng)15小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，形成固狀物 后，過(guò)濾，粗品干燥，得到80g(83.7%)的類白色結(jié)晶性產(chǎn)物。將粗品80g加入叔丁基甲醚 400ml中，加熱回流，趁熱過(guò)濾，濾液置5°C條件下過(guò)夜，濾出固體，加入到叔丁基甲醚400ml 中，加熱回流，趁熱過(guò)濾，濾液置5°C條件下過(guò)夜，濾出固體，再加入到叔丁基甲醚350ml中， 加熱回流，趁熱過(guò)濾，濾液置5°C條件下過(guò)夜，濾出固體干燥，得白色結(jié)晶目的物68g(叔丁 基甲醚重結(jié)晶三次)。m.p. 100 101 °C。1H-WR(CDCl3) [ δ 5. 888(q，2H，J = 3· 6)，δ 3. 254(t，2H，J = 1. 8), δ 3. 464 (2Η, J =1. 8)，δ . 114(m，2H，J = 1. 8)，δ 0· 259 (m，1Η, J = 3. 6)，δ 0· 374 (m，1Η, J = 7. 2)。Ms 191. 1。1H-NMR 圖譜(圖 1)及 Ν· 0· E 圖譜(圖 2)顯示，當(dāng)照射 2、4 氫[δ 1. 114(m,2H)] 時(shí)，其8、9氫和3’氫信號(hào)增強(qiáng)，而3氫信號(hào)不變，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)符合面內(nèi)式構(gòu)型。采用HPLC法對(duì)制備的式III所示化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，色譜條件如下色譜柱 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合 溶液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30°C。式III所示化合物的HPLC圖譜如 圖19所示。采用面積歸一化法計(jì)算得到式III化合物的純度> 98. 5%實(shí)施例2、制備含式I化合物的藥物組合物(即高純度的ST-246)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將實(shí)施例式III化合物(30g，0. 16mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼 (37g，0. 18mol)于1000ml乙醇的溶液中加熱回流(79°C )反應(yīng)13小時(shí)，減壓蒸去乙醇，析 出白色結(jié)晶固體，將固體溶于乙酸乙酯1500ml中，溶液依次用0. 5mol/L的鹽酸(2X500ml) 和水(500ml)萃取，收集有機(jī)層，過(guò)濾，得目的產(chǎn)物固體36g，濾液用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮， 過(guò)濾得目的產(chǎn)物6g，共得產(chǎn)物43. 8g(收率70. 0&)，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重結(jié)晶，得白 色結(jié)晶性粉末40. 8g(總收率64. 7% ) ；m. p. 194 196°C。薄層檢測(cè)展開(kāi)劑正己烷_(kāi)乙 醚-醋酸(3 4 1)，Rf = 0.8。1H-WR(CDCl3) δ 8. 428 (s, 1H) ； δ 7. 888 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 7. 659 (d, 2H, J = 7. 8) ； δ 5. 836 (s,2H) ； δ 3. 145 (2Η) ； δ 3. 456 (2Η) ； δ 1. 153 (m, 2H) ； δ 0. 259 (m, 1H, J = 3. 0) ；0. 323 (m，1H，J = 7. 8) ；1H-NMR 圖譜(圖 3)及 N. 0. E 圖譜顯示(圖 4)，當(dāng)照射 10、11 氫[δ 1. 153(m，2H)]時(shí)，其3、4氫和12’氫信號(hào)增強(qiáng)，而12氫信號(hào)不變，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)符合反 式構(gòu)型。Ms 376. 1元素分析儀器型號(hào)EA1108型元素分析儀測(cè)定。
測(cè)定結(jié)果59.96，4. 08，7. 34，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O采用HPLC法對(duì)所制備的高純度ST-246的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合溶 液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm,柱溫30°C。高純度ST-246的HPLC圖譜如圖17 所示。以實(shí)施例4制備的式II化合物作為檢測(cè)高純度ST-246中ST-246’的標(biāo)準(zhǔn)品。測(cè)得 式I化合物的含量為99. 85%，式II質(zhì)量含量為0. 08%。實(shí)施例3、制備反式-四環(huán)[3. 2. 2. O24]壬烷_(kāi)6_烯-面外_8_面外_9_ 二羧酸酐 (式IV化合物)將環(huán)庚三烯(50g，0.543mol)、馬來(lái)酸酐(61. 3g，0. 624mol)與二甲苯(300mL)的混 合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)20小時(shí)，然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過(guò)濾，將濾出的 母液真空濃縮成固體后，取固體加入叔丁基甲醚IOOml中，加熱溶解，放至室溫，待析出固 體后，過(guò)濾，固體溶于乙酸乙酯IOOml中，拌入IOg硅膠，蒸去溶劑，晾干，上80g硅膠柱，用 體積比為1/13-1/9的乙醚/正己烷的混合溶液(即1/13、1/12、1/11、1/10、1/9)作洗脫劑 進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫3 5個(gè)柱體積，根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果收集目標(biāo)洗脫液，濃縮， 用二甲苯重結(jié)晶得目標(biāo)化合物。1H-NMR (CDCl3) δ 5. 950 (q, 2H) , δ 3· 080 (s，2Η)，δ 3. 415 (2Η), δ 1· 136 (m，2Η)， δ 0. 147 (m, 1Η)，δ 0. 233 (m, 1Η) ；1H-NMR 及 N. 0. E 圖譜顯示(圖 19，20)，當(dāng)照射 2、4 氫 [δ 1. 136(m，2H)]時(shí)，其8、9氫和3’信號(hào)不變，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)符合面外式構(gòu)型。Ms 191. 1 ;m. ρ· 112 113°C。采用HPLC法對(duì)制備的式IV所示化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，色譜條件如下色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-0.4%磷酸二氫銨的混合溶 液；流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30°C。式IV所示化合物的HPLC圖譜如圖 20所示。采用面積歸一化法計(jì)算得到式IV化合物的純度> 98. 5%。實(shí)施例4、制備式II化合物(即ST-246’標(biāo)準(zhǔn)品)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將式IV化合物(3g，0.016mol)和4_三氟甲基苯甲酰胼(3. 7g， 0. OlSmol)于IOOml乙醇的溶液加熱回流(79°C )反應(yīng)13小時(shí)，減壓蒸去乙醇，析出白色 結(jié)晶固體，將固體溶于乙酸乙酯150ml中，溶液用0. 5mol/L的鹽酸(2X50ml)和水(50ml) 萃取，有機(jī)層，過(guò)濾，得目的產(chǎn)物固體3. 4g，濾液用無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，過(guò)濾得目的產(chǎn) 物0.6g，共得產(chǎn)物4.0g(收率67.8% )，乙酸乙酯-正己烷(1 1)重結(jié)晶，得白色結(jié)晶 性粉末3. 2g(總收率54. 2% ) ；m.p. 174-176°C。薄層檢測(cè)展開(kāi)劑正己烷-乙醚-醋酸 (3 4 1)，Rf = 0. 8。1H-NMR(CDCl3) δ 9. 101 (s, 1H) ； δ 7. 846(d，2H，J = 7. 8) ； δ 7. 582 (d，2H， J = 7. 8) ； δ 5. 939 (q, 2H, J = 3. 6) ； δ 3. 392 (s,2H) ； δ 2. 836 (s,2H) ； δ 3. 456 (2Η)； δ 1. 117(m，2H) ； δ 0. 218 (d，1H, J = 5. 4) ； δ 0. 114(m, 1Η) (m, 1Η, J = 3. 0) ；1H-NMR 圖譜及 N. 0. E圖譜顯示(圖14，15)，當(dāng)照射10、11氫[δ 1. 117(m,2H)]時(shí)，其3、4氫和12’氫信號(hào) 不變，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)符合順式構(gòu)型。Ms 376.1元素分析儀器型號(hào)EA1108型元素分析儀測(cè)定。測(cè)定結(jié)果:C%為60. 64，3. 98，7. 45，符合分子式 C19H15F3N2O3. H2O
采用HPLC法對(duì)制備的式II化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，色譜條件如下色譜柱填充劑 為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈-0. 4%磷酸二氫銨的混合溶液； 流速為0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫30°C。式II化合物的HPLC圖譜如圖18所示。 采用面積歸一化法計(jì)算計(jì)算得到式II化合物的純度> 98. 0%，該化合物可作為檢測(cè)實(shí)施 例2制備的高純度ST-246中ST-246，含量的標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)施例5、含有式I組合物制成的片劑處方實(shí)施例2制備的式I組合物 200g乳糖IOOg微晶纖維素60g預(yù)膠化淀粉40g羧甲基淀粉鈉40g微粉硅膠4g硬脂酸鎂4g0. 3% HPMC適量_1000 片制備方法取式I組合物與乳糖、微晶纖維素200 100 40配比微粉化，得微粉 混合物，將處方量微粉化物與微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉、微粉硅膠及羧甲基淀粉鈉充分研磨 混勻后，加入適量0.3% HPMC水溶液制軟材，20目篩制粒，40°C恒溫干燥后，加入硬脂酸鎂 混合均勻后，20目篩整粒，壓片即得。實(shí)施例6、含式I組合物制成的顆粒劑處方實(shí)施例2制備的式I組合物 200g乳糖400g蔗糖IOOg椰子香精30g交聯(lián)聚維酮30g_1000 袋制備方法取式I組合物、乳糖、蔗糖、椰子香精、交聯(lián)聚維酮，分別研細(xì)過(guò)60目篩， 按處方量取主藥與上述輔料混合后，噴霧干燥，干式制粒，整粒即得產(chǎn)品；或?qū)⒃o料混合 按處方量加入粘合劑，制成軟材，將上述軟材經(jīng)12目篩制粒，再于60°C干燥，12目篩整粒， 將整粒好的顆粒加入已過(guò)80目篩的椰子香精混合均勻，分裝即得顆粒劑。實(shí)施例7、含有式I組合物制成的膠囊劑處方實(shí)施例2制備的式I組合物 200g微晶纖維素150g乳糖150g羧甲基淀粉鈉30g硬脂酸鎂6g2%羥丙基纖維素適量
_1000 粒制備方法取式I組合物、微晶纖維素、乳糖、羧甲基淀粉鈉，別研細(xì)過(guò)60目篩，按 處方量取主藥與上述輔料，混合均勻，用黏合劑2%羥丙基纖維素制成軟材，18目篩篩濾制 粒，置60°C條件下干燥，整粒后加入硬脂酸鎂，混合均勻，裝膠囊。實(shí)施例8、式I組合物體外抗痘病毒活性1、實(shí)驗(yàn)材料病毒痘苗病毒天壇株，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保 證可在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)后向公眾提供；參考文獻(xiàn)金奇，陳南 海，姚二梅等.痘苗病毒天壇株基因組旁側(cè)區(qū)結(jié)構(gòu)及開(kāi)放讀碼框架的分析.病毒學(xué)報(bào).1997 年3月，第13卷，第1期。細(xì)胞=Vero E6，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所保證可 在符合國(guó)家和軍隊(duì)有關(guān)規(guī)定且經(jīng)相關(guān)部門(mén)批準(zhǔn)后向公眾提供；參考文獻(xiàn)WANG Lin, LI Rong-song. GUO Hai-yan, and etal.Developmen t of a screen ing method for poten tial an ti-SARS compounds based on Vero-E6 cells.中草藥.第 35 卷第 9 期· 2004 年 9 月· 1019-1023。供試品式I組合物，其中式I質(zhì)量含量為99. 85%，式II質(zhì)量含量為0. 08%。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)細(xì)胞病變法(CPE)法將病毒從-70°C冰箱中取出，放冰浴中融化。用細(xì)胞維 持液將病毒稀釋成IO-IOOTCID5(i，放冰浴中。棄去已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中的培養(yǎng)液。 向正常細(xì)胞對(duì)照孔中加入細(xì)胞維持液，每孔100 μ 1，共3個(gè)復(fù)孔。用稀釋的病毒懸液感染病 毒對(duì)照孔、西多福韋陽(yáng)性藥物對(duì)照孔和試驗(yàn)孔中的細(xì)胞，每孔 οομ 1，37°C吸附1. 5h。棄病 毒液，向病毒對(duì)照孔中加入細(xì)胞維持液，每孔100 μ 1，共3個(gè)復(fù)孔；向西多福韋陽(yáng)性藥物對(duì) 照孔中加入西多福韋溶液(濃度為100 μ g/ml)，每孔100 μ 1，共3個(gè)復(fù)孔；向試驗(yàn)孔中加入 含有不同濃度待測(cè)化合物的維持液，每孔100 μ 1，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37°C、 5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞病變情況。直到病毒對(duì)照孔出 現(xiàn)4個(gè)“ + ”細(xì)胞病變時(shí)為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。用軟件計(jì)算抑制50%細(xì)胞病變的組合物濃度(IC5tl)。(2)中性紅染色法同細(xì)胞病變法。每日在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞病變情 況。直到病毒對(duì)照孔出現(xiàn)4個(gè)“ + ”的細(xì)胞病變時(shí)為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。每孔加入0. 中性紅25μ 1， 于37°C放置1.5h，然后將每孔中的液體吸出。用PBS洗2次。加醋酸乙醇，每孔100 μ 1。 設(shè)空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞存活率和死亡率，然后用軟件計(jì)算 組合物的IC5Q。(3)空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備長(zhǎng)成單層細(xì)胞的24孔板，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 200PFU的病毒懸液 150 μ 1，再加入350 μ 1細(xì)胞維持液，37°C吸附1. 5h。棄病毒液，加入不同濃度的藥物溶液， 每孔1ml，每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照、利巴韋林陽(yáng)性藥物對(duì)照，每 個(gè)對(duì)照設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37°C,5% CO2培養(yǎng)72h。棄孔中液體，用0. 1 %結(jié)晶紫溶液染色，350 μ 1/ 孔。室溫放置lh。棄染色液，蝕斑可見(jiàn)易數(shù)。計(jì)數(shù)蝕斑，用軟件計(jì)算組合物的IC5Q。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)室采用CPE法、中性紅染色法和蝕斑降低實(shí)驗(yàn)測(cè)定含ST-246的組合物對(duì)痘 苗病毒天壇株感染的Vero E6細(xì)胞的保護(hù)作用(見(jiàn)表1、2、3)。表1. ST-246對(duì)痘苗病毒的IC5tl (CPE法) 表2. ST-246對(duì)痘苗病毒的IC5tl (中性紅染色法)
供試品IC50 (|imol/L)
實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)三^S
含 ST-246 的組合物 0.0170j041 0.0180.025±0.014表3. ST-246對(duì)痘苗病毒的IC5tl (蝕斑降低實(shí)驗(yàn))
供試品[C5O (μηιοΙ/L)實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)二 實(shí)驗(yàn)三x±S含ST-246的組合物0.0011460.001 0.0011770.0011 ±0.00009
權(quán)利要求
一種抗痘病毒的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物和式II所示的化合物，所述藥物組合物中式I所示化合物的質(zhì)量含量大于等于98.5％，式II所示化合物的質(zhì)量含量小于等于0.5％；FSA00000222128000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物按照權(quán)利要求3-7 中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行制備。
3.權(quán)利要求1所述藥物組合物的制備方法，包括下述步驟氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將式III所示 化合物與4-三氟甲基苯甲酰胼在有機(jī)溶劑中進(jìn)行加熱反應(yīng)，得到所述藥物組合物； (式 III)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑選自下述溶劑中的至少一 種乙醇、乙酸乙酯、正己烷、四氫呋喃、乙二醇獨(dú)甲醚和二氧六環(huán)，優(yōu)選溶劑為乙醇；所述 反應(yīng)的反應(yīng)溫度為65-85°C，反應(yīng)時(shí)間為12-15小時(shí)；式III所示化合物的原料中，式III所 示化合物的質(zhì)量含量大于等于98. 5%，雜質(zhì)式IV所示化合物的質(zhì)量含量小于1. 5% ； (式 IV)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于式III所示化合物按照下述方法制 備得到將環(huán)庚三烯、馬來(lái)酸酐與二甲苯的混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)12-18小時(shí)， 然后將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過(guò)濾，收集固體，將固體干燥，得到結(jié)晶性產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物 用叔丁基甲醚重結(jié)晶得到式III所示化合物；所述反應(yīng)的反應(yīng)體系中環(huán)庚三烯與馬來(lái)酸酐 的摩爾比為1 1-1 1.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述藥物組合物的制備方法還 包括下述純化步驟將所述藥物組合物溶于乙酸乙酯中，然后依次用0. 2-0. 5mol/L鹽酸和 水萃取，收集有機(jī)層，過(guò)濾，得到初步純化的藥物組合物；再用體積比為1 1-1 1.5的乙 酸乙酯_正己烷的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，得到純化的藥物組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中所述的方法，其特征在于式I、式II、式III、式IV所示化合 物的含量測(cè)定方法均采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件如下色譜柱填充劑為十八烷基硅烷 鍵合硅膠；流動(dòng)相為體積比1 1的乙腈和質(zhì)量濃度0.4%磷酸二氫銨的混合溶液；流速為 0. 5-lml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng) 230nm，柱溫 30°C。
8.權(quán)利要求1或2所述藥物組合物在制備抗痘病毒藥物中的應(yīng)用。
9.一種抗痘病毒藥物，其活性成分為權(quán)利要求1或2所述藥物組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗痘病毒藥物，其特征在于所述抗痘病毒藥物為口服制 劑；所述抗痘病毒藥物的劑型為片劑、膠囊劑、粉劑或顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種含ST-246的藥物組合物及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的藥物組合物，其組成包括式I所示的化合物(ST-246)和式II所示的化合物(ST-246的立體異構(gòu)體)，所述藥物組合物中式I所示化合物的質(zhì)量含量大于等于98.5％，式II所示化合物的質(zhì)量含量小于等于0.5％。該藥物組合物的制備方法包括下述步驟氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將式III所示化合物與4-三氟甲基苯甲酰肼在有機(jī)溶劑中進(jìn)行加熱反應(yīng)，得到所述藥物組合物。以所述藥物組合物為活性成分，加入藥用載體，可制備成抗痘病毒藥物。
文檔編號(hào)A61P31/12GK101912389SQ20101024853
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者丁建新, 姜洋, 孫雅潔, 宋亞彬, 張東娜, 李海晶, 王洪權(quán), 竇茜茜, 貝祝春 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所