專利名稱：一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應用。
背景技術：
肝炎，即肝臟炎癥，有多種致病因素-如病毒、細菌、寄生蟲、化學毒物、藥物和毒 物、酒精等，侵害肝臟，使得肝臟的細胞受到破壞，肝臟的功能受到損害，它可以引起身體的 一系列不適癥狀，以及肝功能指標的異常。肝炎多數情況下指是由甲型、乙型、丙型、丁型、 戊型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型肝炎病毒Ofepatitis B virus, HBV)感染導致的乙型肝炎，是一種嚴重威脅 全球人類健康的的傳染性疾病，也是最嚴重類型的病毒性肝炎，它可造成慢性肝病，患者死 于肝硬化和肝癌的風險極高。HBV屬嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，全基因組長約3. 2kb，為部分雙鏈環(huán)狀 DNA。其基因組共有四個開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼蛋白包括表面抗原 (S基因)，核心抗原(C基因)，聚合酶蛋白(P基因)和X蛋白(C基因)。據世界衛(wèi)生組織報道，全世界估計有20億人感染HBV，其中有3. 5億以上的人為慢 性乙肝感染者，估計每年有60萬人死于急性或慢性乙型肝炎。HBV可造成急性病患，癥狀可 持續(xù)數周，包括皮膚和眼睛發(fā)黃(黃疸)，尿色深，極度疲勞，惡心，嘔吐和腹痛?；颊呖赡苄?要數月乃至一年才能痊愈。乙型肝炎病毒也會造成慢性肝臟感染，以后可能發(fā)展成肝硬化 或肝癌。乙型肝炎病毒通過與受感染者的血液或其他體液(比如，精液和陰道分泌物)接 觸而在人與人之間傳播，傳播途徑與人類免疫缺陷病毒(艾滋病毒)相同。乙型肝炎病毒 的傳染性比艾滋病毒強50-100倍，乙型肝炎病毒在體外可存活至少7天以上。在此期間， 如果病毒進入未感染者的身體，它依然可造成感染。病毒潛伏期平均達90天，但也可能為 大約30至180天不等。乙型肝炎病毒在感染后30至60天即可發(fā)現，持續(xù)時間差別很大。目前主要是通過嬰兒接種乙型肝炎疫苗來預防乙型肝炎的發(fā)生，但盡管如此，人 群HBV流行率仍然很高。目前主要治療慢性乙型肝炎的方法僅局限于抑制患者體內病毒基 因的表達和復制。如口服核苷類抗病毒藥-拉米夫定，主要功能是抑制HBV的復制，但是停 藥后復發(fā)率高，長期應用則可導致病毒變異，在用藥6個月后發(fā)生由病毒聚合酶基因發(fā)生 變異引起的耐藥性，使得臨床抗病毒治療面臨極大的挑戰(zhàn)。近幾年來，隨著RNA干擾(RNAi)技術的迅猛發(fā)展，為疾病尤其是癌癥開辟了 全新的治療途徑，為科研工作者提供了一個全新的基因治療方法。該技術通過用小 干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾特定靶基因的表達，來達到治療疾病 的目的，是基因治療的重要組成部分。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的轉錄后基因沉默機制。其作用機制是核糖核 酸酶III家族的Dicer酶，與dsRNA結合，將其剪切成21_23nt及3’端突出的siRNA，隨后 siRNA與RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合到靶信使RNA(mRNA)上并將其切 斷，引發(fā)靶mRNA的特異性分解，從而阻斷相應基因表達。RNAi已作為一種簡單有效的基因 敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。本發(fā)明提供了一種用RNAi技術來抗HBV的方法。應用RNA干擾技術，用靶向至 HBV基因的siRNA作為靶向藥物，在基因的轉錄后進行干擾，從而有效抑制HBV的蛋白表達 和病毒復制，具有特異性強、高效、副作用小、可持續(xù)用藥的優(yōu)勢，且能彌補目前治療乙型肝 炎藥物的不足，在不久的將來可能成為一種新的治療乙型肝炎的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過siRNA全位點分子庫技術篩選出的高效靶向HBV 基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成正義鏈5，-⑶UGGAGGACAGGAGGUUGGNN-3，(SEQID NO 3)反義鏈5，-CCAACCUCCU⑶CCUCCAACNN-3，(SEQID NO 4)其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。換言之，該雙鏈siRNA分子的主干序列為正義鏈5，-⑶UGGAGGACAGGAGGUUGG-3，(SEQID NO 5)反義鏈5，-CCAACCUCCU⑶CCUCCAAC-3，(SEQID NO 6)在一個優(yōu)選的實施方式中，上述序列中3，端的“NN”是兩個脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備抗HBV藥物中的應用。體外實驗證明，本發(fā)明的siRNA分子的反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的 mRNA結合，降解mRNA，從而干擾轉錄后翻譯過程，抑制HBV蛋白質翻譯和病毒復制，達到抗 HBV的治療目的。


圖1是抽提的HBV基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。M為lkb plus DNA Ladder (標 準參照)。圖2A HBV聚合酶片段1瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 1625bp。圖2B是HBV聚合酶片段2瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為 874bp。M 為 lkb plus DNA Ladder (標準參照)。圖3是siRNA分子庫構建流程示意圖。圖4是TO-siRNA轉錄模板_H1表達框結構示意圖。圖5是PCR制備的TO-siRNA轉錄模板-HI表達框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。 圖中，M 為 lkb plus DNA Ladder (標準參照)；1 為 HBV-22 ；2 為 HBV-676 ；3 為 HBV-877 ；4 為 HBV-638 ；5 為 HBV-1003 ；6 為 HBV-748 ；7 為 HBV-182 ；8 為 HBV-261 ；9 為陰性對照。圖6是表達框轉染細胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA表達量柱形圖， 縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，"Negative Control” 為陰性對照組。圖7是化學合成的siRNA轉染細胞后實時定量PCR檢測HBV聚合酶基因mRNA 表達量柱形圖，縱坐標表示HBV聚合酶基因mRNA表達水平；橫坐標表示處理實驗組，
4“NegativeContro 1 ”為陰性對照組。
具體實施例方式本發(fā)明中諸如“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”等術語可以互換，其表示的 意思和范圍相同。其中，siRNA序列可以是單鏈結構，也可以是雙鏈結構。本發(fā)明的siRNA分子來源于針對HBV聚合酶基因的功能保守區(qū)而制備的siRNA分 子庫，本發(fā)明所用siRNA全位點分子庫技術是百奧邁科生物技術有限公司的專利技術(中 國發(fā)明專利號為ZL 200710024217. 6，專利名稱PCR高通量構建siRNA全位點分子庫制備 方法)，其優(yōu)點在于所制備得到的siRNA隨機分布于HBV聚合酶基因區(qū)段，長度可控性分布 于18-25bp，可以提高有效靶位點的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如化學合成法、體外轉錄、酶切長鏈dsRNA、載 體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件等，這些方法的出現為研究者提供了可選擇的空間， 可以更好地獲得基因沉默效率。本發(fā)明的siRNA分子可以作為抗HBV藥物的有效成分。作為該siRNA分子的另一種表達形式，可將其制備成DNA表達框形式，比如:U6啟 動子-siRNA轉錄模板-HI啟動子。簡言之，在下文中將“TO啟動子-siRNA轉錄模板-HI啟動子”簡寫為“U6_siRNA 轉錄模板-HI ”或“U6-siRNA-Hl ”，它們表示的意思和范圍相同。出于應用目的，可將siRNA分子、表達siRNA分子的DNA表達框、或者包含siRNA 分子表達框的質粒作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如病灶組織。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應疾病的給藥、并且恰當地 保持siRNA分子的活性。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學可接受的輔助劑，只要其適合于相應 的給藥體系、并且恰當地保持siRNA分子的活性。為了實現本發(fā)明的設計思想并驗證篩選得到的siRNA的抗HBV效果，設計了如下
實驗方案(1)構建HBV聚合酶基因的siRNA分子庫，該分子庫中包含靶向至HBV聚合酶基因 的siRNA效應分子，長度分布于18-25bp。(2)制備具有相應效應的siRNA表達框，其結構為U6啟動子-siRNA轉錄模板_H1 啟動子，使其更易于體外篩選。(3)運用實時定量PCR技術，檢測上述siRNA表達框在細胞中轉錄出的效應siRNA 分子對HBV聚合酶基因的抑制作用。(4)化學合成上述方法篩選得到的最優(yōu)靶點siRNA，在體外細胞實驗中進一步運 用實時定量PCR技術檢測HBV聚合酶基因的mRNA表達水平。下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進行限制。實施例1siRNA全位點分子庫的制備1.主要儀器、試劑和材料
1. 1儀器PCR儀(ABI公司)；電轉儀(Bio-Rad公司)；離心機(Eppendorf公司)， 長波長紫外燈等。1. 2材料和試劑IfepG22. 2. 15細胞(百奧邁科公司保存)；lkb plus DNA Ladder (invitrogen 公司)；DNase I (Roche 公司)；MnCl2(BBI 公司)；磷酸接頭 (Sigma-aldrich 公司)；ATP (BBI 公司)；BSA (NEB 公司)；Bmsbl (NEB 公司)；T4DNA 連 接酶(NEB公司)；Tag DNA聚合酶(百奧邁科公司)；瓊脂糖(BBI公司)；dNTP(上海生 工)；酚氯仿抽提試劑(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB公司)；EcoP15I (NEB公 司)；T4DNA聚合酶(NEB公司)；Fokl酶(NEB公司)；Sfil酶(NEB公司)；感受態(tài)細胞 (invitrogen公司)；pU6Hl_GFP表達載體(NT Oimcs公司)。凝膠抽提試劑盒QIAEX II Gel Extrati0nKit(QIAGEN公司)；質粒抽提試劑盒(百奧邁科公司)。其他生化試劑均購 -f' Sigma-aldrich ^w]。2. siRNA全位點分子庫的構建2. 1HBV聚合酶基因的獲得從細胞H印G22. 2. 15的基因組DNA(如圖1所示) 中PCR擴增HBV聚合酶片段。IfepG22. 2. 15細胞含2個拷貝的HBV基因組，能穩(wěn)定分 泌HBsAg、HBeAg、HBcAg及Dane顆粒，并可檢測到細胞內HBV的DNA和RNA等中間復制 體(Sells etal.Proc Natl Acad Sci，1987 ;84 :1005_1009)，其含有 HBV 的血清亞型為 ayw(GenBankAccession number :U95551)，根據 GenBank 報道的核酸序列設計 PCR 擴增引 物，分成兩個片段為HBV聚合酶片段1和HBV聚合酶片段2，長度分別為1625bp (如圖2A 所示)和874bp (如圖2B所示)。引物序列如下HBV聚合酶片段1上游引物5-AATTCCACAACCTTTCACCAA-3’ ；
HBV聚合酶片段1下游引物5-TCACGGTGGTCTCCATGCGA-3，；
HBV聚合酶片段2上游引物5-ATGCCCCTATCCTATCAACAC-3，；
HBV聚合酶片段2下游引物5-CCACTGCATGGCCTGAGGAT-3，。
1)HBV聚合酶片段1序列
1aattccacaacctttcaccaaactctgcaagatcccagagtgagaggcctgtatttccct
61gctggtggctccagttcaggagcagtaaaccctgttccgactactgcctctcccttatcg
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3. 4結果分析用實時定量PCR 2_AAet法分析實驗結果，并作出柱狀圖，如圖6所 示，結果顯示靶向至HBV聚合酶基因的HBV-676的沉默效果達到80%。
權利要求
一種干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，具有如下序列結構正義鏈5’ GUUGGAGGACAGGAGGUUGGNN 3’SEQ ID NO3，反義鏈5’ CCAACCUCCUGUCCUCCAACNN 3’SEQ ID NO4，其中，N是A、T、C、G或U堿基的任何一種。
2.如權利要求1所述的一種干擾HBV基因的siRNA分子，其特征在于，所述N為T。
3.權利要求1 2中任一項所述的siRNA分子在制備抗病毒藥物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的病毒為乙型肝炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干擾HBV基因的siRNA分子及其應用。該siRNA分子正義鏈為SEQ IDNO3，反義鏈為SEQ ID NO4，其中，反義鏈可特異性地與HBV聚合酶基因的mRNA結合，降解mRNA，從而干擾轉錄后翻譯過程，達到抗乙型肝炎病毒的目的。
文檔編號A61P1/16GK101979554SQ20101052196
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權日2010年10月28日
發(fā)明者M·格拉漢姆, 付博峻, 唐小軍, 孫云成, 朱遠源, 李鐵軍, 王晉康, 陸毅祥 申請人:百奧邁科生物技術有限公司