專利名稱：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療腫瘤的藥物，具體涉及一種磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體及其制備方法；本發(fā)明還涉及所述脂質(zhì)體在制備治療卵巢癌藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞毒性藥物在對腫瘤進(jìn)行化療時，常因藥物不能在腫瘤部位達(dá)到有效濃度而導(dǎo)致化療失敗，同時也會增加毒副作用。卵巢癌是婦科腫瘤的元兇，死亡率很高。因?yàn)槁殉舶?gt;90%為葉酸受體陽性表達(dá)， 表達(dá)量高，而正常卵巢上皮葉酸受體陰性，在葉酸受體(葉酸)介導(dǎo)的卵巢癌靶向治療中， 將藥物與葉酸結(jié)合，利用葉酸受體在腫瘤細(xì)胞的過度表達(dá)，以葉酸受體為作用靶點(diǎn)，即可將藥物主動靶向腫瘤細(xì)胞，從而提高藥物在腫瘤組織分布，達(dá)到靶向診斷、治療的目的。紫杉醇是臨床常用的有效治療卵巢癌的藥物。納米技術(shù)是藥物傳輸?shù)牧己霉ぞ吆洼d體方法新穎，裝載藥物量大，體積小易于進(jìn)入細(xì)胞；在機(jī)體內(nèi)可被生物降解從而不造成對機(jī)體毒害。因此葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體是對卵巢癌非常有效的靶向治療藥物。以下文獻(xiàn)報道了不同的葉酸-紫杉醇脂質(zhì)體及其制備方法1, Yuan H, Miao J, Du YZ, et al. Cellular uptake of solid lipid nanoparticles and cytotoxicity of encapsulated paclitaxel in A549cancer cells. Int J Pharm. 2008Feb 4 ；348 (1-2) :137_45Yuan中，分別制備了聚乙二醇修飾的紫杉醇脂質(zhì)體和葉酸偶聯(lián)紫杉醇脂質(zhì)體。但是該方法制備的脂質(zhì)體有如下缺點(diǎn)一是制備脂質(zhì)體所用的原料僅有硬脂酸，缺乏膽固醇等對脂質(zhì)體膜起穩(wěn)定作用的物質(zhì)，造成脂質(zhì)體膜的流動性較強(qiáng)，包封的藥物容易泄漏；二是葉酸偶聯(lián)紫杉醇脂質(zhì)體僅將葉酸與脂肪酸相連接，中間沒有聚乙二醇連接， 制成的脂質(zhì)體在體內(nèi)代謝過快，影響藥效，而不具備長循環(huán)脂質(zhì)體延緩藥物代謝，增加體內(nèi)循環(huán)時間等優(yōu)越性；三是制成的兩種脂質(zhì)體粒徑均較大，分別為374. 3 士 9nm, 369. 3 士 49. 3nm，所以藥效很低對A549細(xì)胞(肺腺癌細(xì)胞)的IC5tl分別為1.86士0. 13 μ g/ml，0. 21 士0. 02 μ g/ ml。遠(yuǎn)大于本發(fā)明制備的葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇的粒徑140. 5士 10. 3nm，及對SKOV 3細(xì)胞的 IC50 0. 027 士 0. 002 μ g/ml，藥效遠(yuǎn)低于本發(fā)明的藥物。2、k folatere ceptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel Jun Wu, Qing Liu, Robert J. Lee. A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxe 1[J]. International Journal of Pharmaceutics. 316(2006) 148 153。
備中先將DSPE-PEG-FA (磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸)放入脂材中，然后用薄膜分散-擠壓法制備葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體。在容器中分別加入紫杉醇、磷脂、膽固醇和無
3水乙醇，溶解后除去乙醇，當(dāng)容器內(nèi)容物呈薄膜狀附著于容器壁時，加入水并進(jìn)行超聲波震蕩，然后將所得混合物用擠壓器通過0. Ium的微孔濾膜，即得紫杉醇納米脂質(zhì)體混懸液；該方法制備的脂質(zhì)體有如下缺點(diǎn)一是所得到的脂質(zhì)體連接葉酸前后的粒徑變化較大，加靶前紫杉醇脂質(zhì)體粒徑在 60nm左右，加靶后增大約30nm左右。原因在于制備中DSPE-PEG-FA(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸)的FA側(cè)(即親水性的靶頭葉酸端)在制備中有可能隱藏于脂質(zhì)體內(nèi)部 (位于雙層磷脂之間的水相中)，可能會減弱葉酸的靶向能力；二是藥效也較低，對KB細(xì)胞(人口腔鱗癌細(xì)胞)的IC5tl為0.048um;而本發(fā)明制備的藥物與文獻(xiàn)1的包封率相近，對SK0V3細(xì)胞的IC50僅為0. 036nm。三是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸在脂質(zhì)體中含量較高，與磷脂的摩爾比達(dá)0.5%，由于其中的葉酸可與人體內(nèi)的葉酸受體結(jié)合，而導(dǎo)致用藥者正常葉酸攝入的不足，引起疾病，如巨幼細(xì)胞性貧血，周圍神經(jīng)病。3、A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel ProdrugPhillip J. Stevens, Ma saru Sekido, Robert J. Lee. A Folate Receptor Targeted Lipid Nanoparticle Formulation for a Lipophilic Paclitaxel Prodrug[J]. Pharmaceutical Research. 21 (2004) :2153-2157該文獻(xiàn)中的藥物是合成產(chǎn)物，將I^aclitaxel-CHOL (紫杉醇-膽固醇)進(jìn)行化合連接，合成所得藥物藥效非常低，對KB細(xì)胞的IC50僅為0.61um?？赡芤蜃仙即?膽固醇合成物嚴(yán)重影響紫杉醇的藥效。4> Preparation and characterization of methoxy poly (ethylene glycol)/poly (e-caprolactone)amphiphilic block copolymeric nanospheres for tumor-speci □ c fοlate-mediated targeting of anticancer drugsEun Kyoung Park, Sang Bong Lee, Young Mong Lee. Preparation and characterizat ion of methoxy poly (ethyleneglycol)/poly (e-caprolactone) amphiphilic block copolymericnanospheres for tumor-speci □ c fοlate-mediated targeting ofanticancer drugs. Biomatrials. 26(2005) 1053-1061.此方法的合成原料中，使用PCL聚己內(nèi)酯，這是一種常用于研究的合成支架聚合物，因?yàn)樯锵嗳菪圆缓?，未被批?zhǔn)臨床應(yīng)用。5、葉酸靶向紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備及其生物學(xué)效應(yīng)的研究(蘇州大學(xué)2008屆放射醫(yī)學(xué)畢業(yè)生汪梅花的畢業(yè)論文，導(dǎo)師許玉杰)文獻(xiàn)中提到使用吐溫-80協(xié)助DSPE-PEG-FA進(jìn)入脂質(zhì)體中，未測包封率，而合成藥物對KB細(xì)胞的IC50為0. 095um,藥效低于文獻(xiàn)2。因?yàn)樯鲜鑫墨I(xiàn)方法所制備的葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體或者藥效較低，影響了臨床的使用效果，或使用不允許臨床使用的物質(zhì)。因此有必要開發(fā)出新的葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，不使用未被批準(zhǔn)臨床允許使用的材料，制備出粒徑小、藥效高的葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇脂質(zhì)體，用于治療卵巢癌。本發(fā)明提供了一種磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體，制備該脂質(zhì)體的原料為磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸、紫杉醇、蛋黃卵磷脂和膽固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸與蛋黃卵磷脂的摩爾比為0. 05% 0. 15%，且所述脂質(zhì)體的粒徑小于150nm。上述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體的制備方法， 其步驟是1)制備磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸膠束將磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸(以下簡稱DSPE-PEG2000-FA)溶解于甲醇和氯仿混合溶液(1 9，體積比)，加入蒸餾水進(jìn)行水浴超聲乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明DSPE-PEG2000-FA膠束溶液。2)用薄膜分散-擠壓法制備納米紫杉醇脂質(zhì)體混懸液在容器中分別加入紫杉醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇和無水乙醇，溶解后除去乙醇，當(dāng)容器內(nèi)物呈薄膜狀附著于容器壁時，加入水并進(jìn)行超聲波震蕩，然后將所得混合物用擠壓器通過0. Ium的微孔濾膜，即得紫杉醇納米脂質(zhì)體混懸液，呈細(xì)小油滴懸浮于水中。如果需要得到用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的富集過程的樣品，此步驟中，還可加入異硫氰酸熒光素作為熒光指示劑。如果需要得到凍干制劑，此步驟中，還可以將所得混懸液加入適量蔗糖，經(jīng)冷凍干燥制成凍干制劑。3)采用共孵育法制備DSPE-PEG2000-FA修飾的葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物將步驟1所得膠束溶液和步驟2所得混懸液混合，置60°C環(huán)境中1小時，得到 DSPE-PEG2000-FA修飾的紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物，為混懸液。本發(fā)明的有益效果1、葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物粒徑小粒徑測定以水為分散介質(zhì)，稀釋約20倍后，用激光粒度測定儀測得平均粒徑為 140. 5 士 10. 3nm，多分散指數(shù)(PDI)O. 263 士0. 061，粒徑在150nm以下可有效逃避非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(REQ的捕獲，增強(qiáng)藥效。而文獻(xiàn)1的兩種脂質(zhì)體粒徑分別是374. 3 士 9nm和369. 3 士49. 3nm。2、紫杉醇脂質(zhì)體連接葉酸前后粒徑變化小DSPE-PEG2000-FA為兩親性線型聚合物，一端DSPE鏈為親脂性，另一端為親水性。 在DSPE-PEG2000-FA修飾脂質(zhì)體形成過程中，DSPE端可與磷脂膜結(jié)合，F(xiàn)A作為靶頭暴露在脂質(zhì)體表面，既增加了脂質(zhì)體的體內(nèi)循環(huán)時間，又可靶向作用于高表達(dá)葉酸受體的病變部位。因?yàn)楸景l(fā)明首先制備了磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸的膠束，膠束的脂相磷脂酰乙醇胺側(cè)與脂質(zhì)體的脂相外層磷脂間融合(即親脂性端直接插入磷脂膜)。這樣，可使親水性的靶頭FA側(cè)(即磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸的的葉酸一端)全部在脂質(zhì)體外，可以充分發(fā)揮葉酸的靶向能力。而現(xiàn)有技術(shù)的方法(如背景技術(shù)中所述文獻(xiàn)2)由于沒有先制備膠束，會有部分葉酸端存在于雙層磷脂之間，脂質(zhì)體粒徑增大30nm，而減弱葉酸的靶向能力，降低藥效。
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本發(fā)明的脂質(zhì)體經(jīng)測定，連接葉酸后，較步驟1所得的納米紫杉醇的粒徑 (121. 6士 12. 7nm，PDI 0.262士0.031)僅增大19nm(見圖2、圖3)，但此差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t 值 2. 013 ；ρ {t0. 114 ；P > 0. 05)。3、脂質(zhì)體中藥物的包封率高，保證了藥物的純度和有效性包封率的測定采用葡聚糖凝膠(Sephadex G-50)柱過濾法分離未包封藥物，測定吸光度，計(jì)算濃度和含藥量，作洗脫曲線(見圖1)。按以下公式計(jì)算包封率包封率=脂質(zhì)體含藥量/(脂質(zhì)體含藥量+游離藥物量)X100%o測得包封率高達(dá)97%，比較原料藥紫杉醇納米脂質(zhì)體的包封率99%無顯著下降， 符合文獻(xiàn)(Shih-Jiuan Chiu, Shujun Liu, Danilo Perrotti. Efficient delivery of a Bcl-2-specific antisense oligodeoxy ribonucleotide(G3139)Via transferrin receptor-targeted liposomes [J]. Journalof Controlled Release. 2006 199 207)記載的< 2% 4%工藝標(biāo)準(zhǔn)，保證了藥物的純度和有效性。4、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸比例低，僅0. 1 %，不會導(dǎo)致正常葉酸攝入的不足。實(shí)施例中，制備所用原料紫杉醇蛋黃卵磷脂膽固醇DSPE-PEG2000-FA具體含量分別是2.5mg 47. Hmg 11.60mg 0.48mg，摩爾比為紫杉醇蛋黃卵磷脂膽固醇DSPE-PEG2000-FA = 1 45 9 0. 045 其中DSPE-PEG2000-FA (磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸)與蛋黃卵磷脂的摩爾比是0. 1%，小于背景技術(shù)中所述文獻(xiàn)2中0.5%的比例，降低了由于磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸中的葉酸結(jié)合葉酸受體導(dǎo)致正常葉酸攝入的不足的副作用，如巨幼細(xì)胞性貧血，周圍神經(jīng)病等。5、治療卵巢癌的離體實(shí)驗(yàn)效果好1)葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的富集程度檢測用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的富集過程，結(jié)果證實(shí)葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物對SK0V3細(xì)胞膜具有趨向性，藥物在癌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)富集。2)葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)分析藥物作用后細(xì)胞生長曲線結(jié)果表明對敏感株細(xì)胞SK0V3、耐藥株SK0V3/TAX細(xì)胞，葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇的藥效稍強(qiáng)于納米紫杉醇。3)MTT檢測藥物對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用與納米紫杉醇、市售紫杉醇注射液進(jìn)行了對比，結(jié)果證實(shí)葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞(SK0V3細(xì)胞或SKOV 3/TAX細(xì)胞)的殺傷效果強(qiáng)度均明顯高于對照藥物納米紫杉醇或普通紫杉醇。4)流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞增殖和凋亡指數(shù)結(jié)論葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照藥物納米紫杉醇或普通紫杉醇。5)電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變結(jié)論葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇比對照藥物納米紫杉醇穿膜作用好，在細(xì)胞內(nèi)聚集濃度高、殺傷作用更強(qiáng)。6、治療卵巢癌的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果好1)裸鼠腹腔種植瘤卵巢癌模型不給藥的荷瘤裸鼠生存期約為35天，而給藥后荷瘤裸鼠的生存期> 88天，證明了紫杉醇治療卵巢癌具有非常好的療效。2)流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果表明腹腔給藥凋亡晚期和壞死細(xì)胞比較多，腫瘤細(xì)胞殺傷效果腹腔組效果最好。3)電鏡觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變結(jié)果表明給藥后腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變明顯，出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。上述細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)表明葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體可靶向作用于腫瘤特異性葉酸受體，使傳統(tǒng)的化療藥物和腫瘤特異性的抗體結(jié)合，增強(qiáng)了藥物對腫瘤靶向選擇，提高了療效并減少藥物的毒副作用，有很可觀的臨床應(yīng)用前景?？傊景l(fā)明提供了的靶向葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇的新制劑及其制備方法。先將DSPE-PEG2000-FA制備成膠束，然后再將其與紫杉醇納米脂質(zhì)體共同孵育制備 DSPE-PEG2000-FA修飾的紫杉醇納米脂質(zhì)體。該制劑有良好的藥物包封率和膠體穩(wěn)定性，并可被葉酸(+)的敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞有效攝取，顯示葉酸依賴性的細(xì)胞毒性，藥效明顯強(qiáng)于紫杉醇注射液，同時該藥腹腔注射抗腫瘤療效明顯優(yōu)于靜脈注射。為葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇靶向治療卵巢癌的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。


圖1是對本發(fā)明制備的葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物進(jìn)行包封率測定時的洗脫曲線圖；圖2是本發(fā)明制備的葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物進(jìn)行粒徑測定時所得的粒徑透射電鏡圖，藥物的粒徑范圍140. 5 士 10. 3nm，多分散指數(shù)(PDI)O. 263 士0. 061 ；圖3是制備步驟1所得的納米紫杉醇進(jìn)行粒徑測定時所得的粒徑透射電鏡圖，粒徑范圍 121. 6士 12. 7nm。圖4SK0V3細(xì)胞葉酸受體免疫組化染色陽性40X ；圖5SK0V3/TAX細(xì)胞葉酸受體免疫組化染色陽性40X ；圖6無葉酸培養(yǎng)基中葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用后SK0V3細(xì)胞死亡率；圖7加葉酸培養(yǎng)基中葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用后SK0V3細(xì)胞死亡率；圖820min后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SKOV 3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖940min后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SKOV 3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖IOlh后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SK0V3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖11 后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SK0V3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖124h后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SK0V3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖13 后葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SK0V3細(xì)胞內(nèi)的富集；圖14細(xì)胞生長曲線；圖150. 02 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為2. 36% ；圖160. 02 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞周期分布， 凋亡率為15. 88% ；圖170. 02 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用4 后的細(xì)胞周期分布， 凋亡率為32.81% ；圖180. 02 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 2. 07% ；圖190. 02 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 10. 55% ；圖200. 02 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用4 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 16. 7% ；圖210. 02 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 0. 11% ；圖220. 02 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 0. 92% ；圖230. 02 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用4 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 1. 17% ；圖M0. 02 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布， 凋亡率為2. 36% ；圖250. 2 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布， 凋亡率為6. 34% ；圖262 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為7. 42% ；圖270. 02 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 2. 07% ；圖觀0. 2 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為
2.57% ；圖292 μ g/ml納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為
3.47% ；圖300. 02 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 0. 11% ；圖310. 2 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 0. 62% ；圖322 μ g/ml紫杉醇注射液對SK0V3細(xì)胞作用1 后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為 0. 94% ；圖332 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用于SK0V3細(xì)胞24h后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為32. 48% ；圖342 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用于SK0V3/TAX細(xì)胞24h后的細(xì)胞周期分布，凋亡率為13.4% ；
圖35納米紫杉醇作用SK0V3細(xì)胞后的電鏡圖；圖36葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用SK0V3細(xì)胞后的電鏡圖；圖37納米紫杉醇作用SK0V3/TAX細(xì)胞后的電鏡圖；圖38葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用SK0V3/TAX細(xì)胞后的電鏡圖；圖39裸鼠腹腔注入SK0V3細(xì)胞后5周，可見裸鼠腹腔內(nèi)有粟粒樣病灶，分布于腸管表面；圖40腹腔病灶HE染色后X 10鏡下證實(shí)為卵巢漿液性上皮性腺癌；圖41對照組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式散點(diǎn)圖；圖42對照組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式象限圖；圖43腹腔組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式散點(diǎn)圖；圖44腹腔組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式象限圖；圖45靜脈組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式散點(diǎn)圖；圖46靜脈組裸鼠腫瘤細(xì)胞流式象限圖；圖47給藥4天后對照組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖48給藥7天后對照組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖49給藥2天后腹腔組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖50給藥7天后腹腔組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖51給藥2天后靜脈組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖52給藥4天后靜脈組細(xì)胞凋亡壞死改變；圖53給藥7天后靜脈組細(xì)胞凋亡壞死改變。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的制備(一)1.儀器與材料1.1 儀器高效液相色譜儀(ShimadzuLC-lOAT，日本島津，包括SPD-10A紫外檢測)；N2000 色譜工作站(浙江智達(dá))；ZetasizerfOOO激光粒子測定儀(英國馬爾文)；超聲波清洗機(jī) (JP-010S，深圳潔盟)；冷凍干燥機(jī)(FD-1A-50，成都比朗)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-501，北京來亨)；電熱恒溫干燥箱(101-3，北京久恒隆)1.2 藥品紫杉醇(南京康海制藥有限公司，含量98. 6%)；蛋黃卵磷脂(德國avanti polar lipids公司)；膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸(德國avanti polar lipids公司)；紫杉醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量 99. 08% )；甲醇、乙腈均為色譜醇，其他試劑為分析純。2.制備過程2. 1納米紫杉醇(紫杉醇脂質(zhì)體)藥物的制備處方紫杉醇2. 5mg:蛋黃卵磷脂47. Hmg 膽固醇11.60mg: DSPE-PEG2000-FA0. 48mg, FITC 0. 5mg (摩爾比為紫杉醇蛋黃卵磷脂膽固醇DSPE-PEG2000-FA = 1 45 9 0.045)。
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精密取處方量紫杉醇/紫杉醇+異硫氰酸熒光素(FITC 0.5mg)、蛋黃卵磷脂和膽固醇置茄形瓶中，加入20mL無水乙醇，水浴超聲使藥物和脂材溶解，于45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓除去乙醇。加入適量水30°C水浴超聲波震蕩30min，用擠壓器將脂質(zhì)體依次過0. Sum, 0. 4um,0. 2um,0. Ium的微孔濾膜，即得紫杉醇脂質(zhì)體混懸液。加入適量蔗糖，經(jīng)冷凍干燥制成凍干制劑。2. 2DSPE-PEG2000-FA 膠束的制備采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備DSPE-PEG2000-FA膠束。將lmgDSPE-PEG2000_FA 溶解于甲醇和氯仿混合溶液((1 9，體積比))，加入約5.3ml蒸餾水水浴超聲乳化，除去甲醇和氯仿，得到澄清透明DSPE-PEG2000-FA膠束溶液。2. 3DSPE-PEG2000-FA修飾的葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的制備采用共孵育法制備DSPE-PEG2000-FA修飾的納米紫杉醇藥物。精密量取處方量的紫杉醇脂質(zhì)體混懸液和DSPE-PEG2000-FA膠束溶液，充分混合，置60°C的電熱恒溫干燥箱1 小時，即得DSPE-PEG2000-FA修飾的紫杉醇納米脂質(zhì)體混懸液。3.產(chǎn)物葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物的鑒定3. 1鑒定方法3. 1.1粒徑測定取制備的脂質(zhì)體混懸液和膠束適量，以水為分散介質(zhì)，稀釋約20倍后，用激光粒度測定儀測定樣品的平均粒徑。3. 1.2包封率的測定采用葡聚糖凝膠(S印hadex G_50)柱過濾法分離未包封藥物，取脂質(zhì)體混懸液 0. 5ml上柱分離，以水為洗脫液洗脫，流速控制為0. 8 1. OmL/min ；以每隔^iin分管接收洗脫液，共接取16份，分別稀釋至一定濃度后；對所有樣品于227nm測定吸光度，計(jì)算濃度和含藥量，作洗脫曲線，見圖1。含脂質(zhì)體的接收液合并后以無水乙醇破乳，稀釋至一定濃度后。測定含量，按以下公式計(jì)算包封率包封率=脂質(zhì)體含藥量/ (脂質(zhì)體含藥量+游離藥物量)X 100%。3. 1. 3紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制、色譜測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成準(zhǔn)確稱取IOmg紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)對照品，用甲醇溶解后定容，得到1000mg/L的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用甲醇稀釋配制成100、50、25、10、5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，4°C避光保存。色譜條件色譜柱DiamonsilC18(4. 6謹(jǐn)X 250謹(jǐn)，5 μ m)；流動相乙腈甲醇水 (40 12 48)；流速1.0ml/min ；檢測波長227nm;柱溫 40°C。標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍取配制的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件進(jìn)樣，錄色譜峰并對其積分、分析，以峰面積area(Y)和質(zhì)量濃度concentration(X)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸確定線性范圍，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 19946X+2617，r = 0. 999。線性范圍為5 IOOmg/ L03. 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Spssl6. 0軟件，對不同數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)及X2檢驗(yàn)。3. 2鑒定結(jié)果3. 2.1所得產(chǎn)物的粒徑
終產(chǎn)物葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的粒徑(140. 5 士 10. 3)nm,多分散指數(shù)(PDI)O. 263 士0. 061，較步驟1所得的納米紫杉醇的粒徑(121. 6 士 12. 7nm, PDI 0. 262 士0. 031)僅增大19nm，但此差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值2. 013 ；ρ值0. 114 ；P > 0. 05)。 葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇粒徑仍控制在150nm以下，可有效逃避非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的捕獲， 增強(qiáng)藥效。見圖2、圖3。3. 2. 2 包封率葉酸-紫杉醇納米脂質(zhì)體藥物的包封率高達(dá)97%，比較原料藥紫杉醇納米脂質(zhì)體的包封率99%無顯著下降，符合< 2% 4%工藝標(biāo)準(zhǔn)，保證了藥物的純度和有效性。實(shí)施例2葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的制備(二)方法同實(shí)施例1，但制備納米紫杉醇脂質(zhì)體時，原料中不加異硫氰酸熒光素 (FITC)，其它材料同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)例1葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇靶向治療卵巢癌的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究1.實(shí)驗(yàn)材料SK0V3細(xì)胞，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李春海教授饋贈；SK0V3/TAX，本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)，方法按 Sudimack JJ,Adams D,Rotaru J，et al. Folate receptor-mediated liposomal delivery of a lipophilic boron agent to tumor cells in vitro for neutron capture therapy. Pharm Res,2002,19 (10) :1502-1508;BALB/c雌裸鼠，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物部；培養(yǎng)液RPM 1-1640 (Sigma)、無葉酸RPM 1-1640培養(yǎng)液(GIBCO)、葉酸受體單克隆抗體M0V18(EnZO life Science)、凋亡檢測試劑盒均購自北京寶賽公司；葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇實(shí)施例1。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1免疫組化染色篩查卵巢癌葉酸受體陽性細(xì)胞株參照文獻(xiàn)(M R Buist, CFM Molthoff, P Kenemans, et al. Distribution of OV-TL 3and M0vl8in normal and malignant ovarian tissue[J]J Clin Pathol 1985 ； 48 :631-636methods[J], Cancer Res, 1990,50(2) :3218-3223)的方法，免疫組化染色篩查卵巢癌葉酸受體陽性細(xì)胞株。陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞膜著色(棕黃色)。2. 1. 1SK0V3細(xì)胞爬片入丙酮固定10分鐘。PBS沖洗，5分鐘X 3。2. 1. 2用3%過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗， 5分鐘X3。2. 1. 3正常動物非免疫血清工作液封閉，室溫孵育30分鐘，傾去血清，勿洗。2. 1.4滴加適當(dāng)比例稀釋的M0V18，37°C孵育1小時。PBS沖洗，5分鐘X3。空白對照為不加一抗，其他步驟相同。2. 1. 5滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，37°C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X3次。2. 1. 6滴加鏈親和素-過氧化酶工作液，37°C孵育30分鐘。PBS沖洗，5分鐘X 3次。2. 1. 7滴加新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察5-lOmin。MOV-18單抗免疫組化染色結(jié)果如圖4、圖5示。2. 1.8自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。
2. 2檢測游離葉酸對于葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的干擾作用參照文獻(xiàn)(Paranjpe PV, Chen Y, Kholodovych V, et al. Tumor-targeted bio-conjugate based delivery of camptothecin :design, synthesis and in vitro evaluation. J Control Release, 2004,100(2) :275 292)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。因葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對SK0V3細(xì)胞的殺傷作用是由葉酸受體介導(dǎo)的，則培養(yǎng)基內(nèi)加入葉酸會與葉酸受體競爭性結(jié)合而降低藥物對細(xì)胞的殺傷效果。2.2. 1將濃度為0.025yg/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物作用于對數(shù)生長期的 SK0V3細(xì)胞(培養(yǎng)基為加入ImM/L葉酸的1640)，對照組細(xì)胞采用無葉酸1640培養(yǎng)基。2. 2. 224h后用0. 25%胰酶消化細(xì)胞使待測細(xì)胞濃度為1. 5X 106/ml。取Iml細(xì)胞， 在 40C T 1000r/min 離心 lOmin，棄上清。2. 2. 3加入Iml冷PBS液，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，在4°C下1000r/min離心IOmin,
棄上清。重復(fù)該步驟兩次。2. 2. 4 將細(xì)胞重新懸浮于 500 μ 1 Binding Buffer。2. 2. 5加入20 μ 1碘化丙啶(PI)，避光室溫反應(yīng)，1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，無葉酸組細(xì)胞死亡率明顯高于加葉酸組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。見表 1，圖6、圖7。表1葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇作用后SK0V3細(xì)胞的凋亡率
凋亡細(xì)胞數(shù)總細(xì)胞數(shù)凋亡率加葉酸組272234441. 16% *無葉酸組1148782314. 67%*Ρ < 0. 01加葉酸組vs無葉酸組本實(shí)驗(yàn)的原理是葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇與葉酸競爭性結(jié)合癌細(xì)胞上的葉酸受體，故加葉酸組，藥物對細(xì)胞的殺傷率較低，定量的間接驗(yàn)證葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇確實(shí)是通過葉酸受體起作用的。卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌SK0V3細(xì)胞及其耐藥株SK0V3/TAX細(xì)胞均為葉酸(+)細(xì)胞，可介導(dǎo)葉酸納米紫杉醇藥物通過葉酸受體介導(dǎo)的胞吞作用富集于細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮抗腫瘤效果。細(xì)胞培養(yǎng)基中加入游離葉酸封閉葉酸受體可明顯降低葉酸納米紫杉醇藥物對細(xì)胞的殺傷作用，也進(jìn)一步證明了藥物對細(xì)胞的作用是由細(xì)胞表面的葉酸受體介導(dǎo)的。文獻(xiàn)報道約93%的卵巢癌患者中過表達(dá)葉酸(林鳳云，朱照靜.葉酸受體介導(dǎo)的靶向給藥研究進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊.2006，33 (3) :178-181)，故本實(shí)驗(yàn)中使用卵巢癌細(xì)胞模型來探討葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇對卵巢癌的靶向治療作用更接近臨床實(shí)際，有一定的臨床意義。2. 3葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的富集實(shí)驗(yàn)方法用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)的富集過程，具體方法參照文獻(xiàn)(Jun ffu, Qing Liu, Robert J. Lee. A Folate receptor-targeted liposomal formulation for paclitaxel[J]. International Journal of Pharmaceutics. 316(2006) :148 153)。
操作步驟為將濃度為0. 01mg/ml的異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記的葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物加入貼壁生長的SK0V3細(xì)胞中。藥物分別作用20min，40min，lh,2h,4h,8h后，倒掉培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，加入4%多聚甲醛4°C固定。1 后倒掉固定液，加入甘油/ PBS混合液封片，激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀察葉酸(+)的SK0V3細(xì)胞通過葉酸主動攝取葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的過程，即藥物被細(xì)胞內(nèi)吞的過程和藥物富集于腫瘤細(xì)胞的濃度。結(jié)果隨葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物對SK0V3細(xì)胞作用時間的延長，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度越來越大；同時在各時間點(diǎn)都觀察到細(xì)胞膜處藥物濃度聚集，說明葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物對細(xì)胞膜的趨向性，腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取是通過葉酸受體介導(dǎo)的。但隨著時間的推移，細(xì)胞膜上的葉酸受體飽和后，將會影響藥物的繼續(xù)吸收，表現(xiàn)為胞膜處熒光強(qiáng)度相對減弱。見圖 8-13(葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物在SK0V3細(xì)胞內(nèi)的富集過程)。圖8-13示隨著藥物作用時間延長，腫瘤細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，胞漿輪廓越來越清晰，胞膜處綠色熒光聚集以 4h最強(qiáng)，他開始減弱。結(jié)論葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物對SK0V3細(xì)胞膜具有趨向性，藥物在癌細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)富集。2. 4葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)分析2. 4. 1藥物作用后細(xì)胞生長曲線取對數(shù)生長期的SK0V3細(xì)胞、SK0V3/TAX細(xì)胞，分別用0. 25%胰酶消化后制成 IXioVml的單細(xì)胞懸液，以每孔Iml接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。M小時后棄培養(yǎng)液，分三組加入含藥培養(yǎng)液，空白組不加藥，對照組加0. 2μ g/ml納米紫杉醇注射液，實(shí)驗(yàn)組加 0. 2 μ g/ml葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇。加藥后每隔4 換相同培養(yǎng)液一次，每隔24h計(jì)數(shù)1次， 每次每組計(jì)數(shù)3孔的細(xì)胞，取平均數(shù)，連續(xù)7d。繪制細(xì)胞生長曲線，按I^tterson公式(Yang LY, Trujillo JM. Biological characterization of multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two)計(jì)算細(xì)胞在對數(shù)生長期的細(xì)胞群體倍增時間(TD)。結(jié)果表明對敏感株細(xì)胞SK0V3、耐藥株SK0V3/TAX細(xì)胞，葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇的藥效稍強(qiáng)于納米紫杉醇。但實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞SK0V3及SK0V3/TAX生長速度均極慢，未出現(xiàn)明顯對數(shù)生長期。見圖14細(xì)胞生長曲線。2. 4. 2MTT檢測藥物對卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用實(shí)驗(yàn)分組用藥物如下實(shí)驗(yàn)組實(shí)施例2葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇；對照組1 納米紫杉醇；(南京康海藥業(yè)有限公司)對照組2 市售紫杉醇注射液。(海南中化聯(lián)合制藥工業(yè)有限公司)取對數(shù)生長期的卵巢癌敏感株SK0V3細(xì)胞、耐藥株SK0V3/TAX細(xì)胞，濃度為 4 XioVml,以每孔200 μ 1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)基，分別加入含有葉酸偶聯(lián)納米紫杉醇(實(shí)驗(yàn)組)、納米紫杉醇(對照組1)、紫杉醇注射液(對照組2)藥物的培養(yǎng)液，藥物濃度梯度均為200,20,2,0.2,0. 02，0. 002 μ g/ml，每孔設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)48h 后棄含藥培養(yǎng)液，每孔加20 μ IMTT (5mg/ml)。4小時后棄MTT，每孔加入150 μ 1DMS0。振蕩 5min后，用自動酶標(biāo)儀測492nm處各孔吸光度OD值。對照孔培養(yǎng)液中不加藥，空白孔中為無細(xì)胞的培養(yǎng)基。計(jì)算細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值X100 % )，以濃度一存活曲線作回歸方程，得出各種藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。見表2。表2各種藥物對兩組細(xì)胞IC50值(μ g/ml)
權(quán)利要求
1.一種磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體的制備方法，其步驟是1)制備磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸膠束，將磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸溶于甲醇和氯仿混合溶液，加入蒸餾水進(jìn)行水浴超聲乳化后，除去甲醇和氯仿，得到澄明的膠束溶液；2)用薄膜分散-擠壓法制備納米紫杉醇脂質(zhì)體混懸液，在容器中分別加入紫杉醇、蛋黃卵磷脂、膽固醇和無水乙醇，溶解后除去乙醇，當(dāng)容器內(nèi)容物呈薄膜狀附著于容器壁時，加入水并進(jìn)行超聲波震蕩，然后將所得混合物用擠壓器通過0. Ium的微孔濾膜，即得紫杉醇納米脂質(zhì)體混懸液；3)采用共孵育法制備磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體， 將步驟1所得膠束溶液和步驟2所得混懸液混合，置60°C環(huán)境中1小時，得到所述脂質(zhì)體藥物，為混懸液。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，步驟幻中，所述通過0.Ium的微孔濾膜是用擠壓器將脂質(zhì)體依次過過0. Sum, 0. 4um, 0. 2um的微孔濾膜后，再通過0. Ium的微孔濾膜。
3.權(quán)利要求1所述的制備方法，步驟幻中，所得混懸液加入蔗糖，經(jīng)冷凍干燥制成凍干粉。
4.一種磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體，制備該脂質(zhì)體的原料為磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸、紫杉醇、蛋黃卵磷脂和膽固醇，其特征是磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸與蛋黃卵磷脂的摩爾比為0. 05% 0. 15%，且所述脂質(zhì)體的粒徑小于150nm。
5.權(quán)利要求4所述的脂質(zhì)體，其特征是按權(quán)利要求1所述方法制備的。
6.權(quán)利要求4或5所述的脂質(zhì)體在制備治療腫瘤藥物中的用途。
7.權(quán)利要求4或5所述的腫瘤，是卵巢癌。
8.一種治療卵巢癌藥物，其活性成分是權(quán)利要求4或5所述的脂質(zhì)體。
全文摘要
一種磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸修飾的納米紫杉醇脂質(zhì)體，磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸與蛋黃卵磷脂的摩爾比為0.05％～0.15％，且所述脂質(zhì)體的粒徑小于150nm。制備方法為先將DSPE-PEG2000-FA制備成膠束，然后再將其與紫杉醇納米脂質(zhì)體共同孵育得到。本發(fā)明的原料中不使用臨床不允許使用的材料。該脂質(zhì)體粒徑小、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-葉酸的含量低，有良好的藥物包封率和膠體穩(wěn)定性，并可被葉酸(+)的敏感和耐藥的卵巢癌細(xì)胞有效攝取，顯示葉酸依賴性的細(xì)胞毒性，藥效明顯強(qiáng)于紫杉醇注射液。
文檔編號A61K47/22GK102188382SQ20111011430
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者佟鈴霞, 李紅霞, 程光 申請人:李紅霞