專利名稱：無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒株，還涉及該病毒株的構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明利用逆向分子生物技術(shù)設(shè)計(jì)重組活疫苗，在細(xì)胞基質(zhì)中增殖，經(jīng)冷凍干燥可制備高效的狂犬病疫苗。本發(fā)明屬于生物疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
狂犬病病毒屬于彈狀病毒科，是一種不分階段RNA病毒，其基因組編碼五種蛋白R(shí)NA依賴的RNA酶(L)，核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、外膜蛋白(G)。狂犬病通過(guò)動(dòng)物咬傷或抓傷傳播，沿外圍神經(jīng)至神經(jīng)中樞引起細(xì)胞功能損傷和感染動(dòng)物的死亡，可逃避免疫識(shí)別。 機(jī)體抗狂犬病毒的免疫主要是狂犬病病毒糖蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體和CD/、⑶/細(xì)胞免疫。機(jī)體內(nèi)在的防御機(jī)制在狂犬病免疫應(yīng)答也重要作用，包括活疫苗L、N和P蛋白引起的保護(hù)性免疫。抗病毒免疫與致病性相關(guān)，與病毒糖蛋白表達(dá)水平相關(guān)，盡管糖蛋白表達(dá)水平與免疫增效的關(guān)系不甚清楚，但糖蛋白基因保留了非嗜神經(jīng)性基因片段和高效復(fù)制的基因片段，使重組活病毒具有更高效的安全性和免疫原性，與傳統(tǒng)活疫苗相比，用該重組病毒生產(chǎn)的疫苗具有安全、高效、低廉、方便使用的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用逆向遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)國(guó)內(nèi)外的減毒活疫苗株進(jìn)行定向突變，降低了減毒疫苗株的致病性，提高了病毒在細(xì)胞基質(zhì)中的復(fù)制水平，因而增強(qiáng)了免疫原性和病毒基因的穩(wěn)定性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段首先，本發(fā)明提供了一種制備無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒的方法，其特征在于將狂犬病毒基因組中的糖蛋白基因進(jìn)行以下位點(diǎn)的突變Arg333 —Gln，Aspl64 —Ser。即將狂犬病毒基因組中的糖蛋白基因中的第333位的Arg突變?yōu)镚ln，將位于第164位的Asp突變?yōu)镾er。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，是使所述的重組減毒狂犬病毒基因組中包含兩個(gè)拷貝的含有以下位點(diǎn)突變的糖蛋白基因Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser0在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的重組減毒狂犬病毒糖蛋白基因來(lái)自狂犬病毒 CTN-I 株、aG 株、SAD 株、EAR 株、Flurg-LEP 株、Flurg-HEP 株或 PM 株。無(wú)致病狂犬病病毒的G基因上的333位以及164位的位點(diǎn)突變導(dǎo)致G蛋白基因穩(wěn)定，不易返祖。其次，本發(fā)明提供了由以上任一所述的方法制備得到的無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒。按照本發(fā)明所述的方法制備得到了一株無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒，該病毒在免疫缺陷的動(dòng)物中傳一代或多代無(wú)致病性；本發(fā)明的一株無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒，含有雙拷貝的G基因，且G基因中存在以下位點(diǎn)的突變Arg333 —Gln，Aspl64 —Ser，該病毒株命名為CTN-GAGA，分類命名為重組減毒狂犬病毒，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6209，保藏日期為2012年6月14日。再次，本發(fā)明還提供了所述的重組狂犬病毒在制備預(yù)防由狂犬病毒引起的疾病藥物中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述的藥物可包括注射制劑和口服制劑。本發(fā)明的藥物可口服，也可注射，口服制劑包括加餌料，注射制劑可通過(guò)包括肌肉、腦內(nèi)、皮下腹腔進(jìn)行注射。最后，本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，其特征在于含有以上任一所述的重組狂 犬病毒。優(yōu)選的，所述的疫苗為凍干疫苗，其還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。優(yōu)選的，所述的疫苗可用于包括狗、貓、狼、狐貍或松鼠等在內(nèi)的動(dòng)物的免疫。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明具體實(shí)施例所涉及的材料來(lái)源病毒株狂犬病毒CTNl株、CVS-Il株購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)生物制品檢定所。實(shí)施例I狂犬病毒全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pSDI-1 包含 CTN-I 株基因組 3 '和 5'末端(CTN1-200 和 11750-11200)插在I7RNA聚合酶和Delta肝炎病毒抗原核酶序列之間。為了獲得5'末端基因序列，首先用引物 5 ' -ACGTTAACAA-3 '、引物 5 ' -AATTCCTGCAGTAACGACTCACTATAGGG-3 ' PCR擴(kuò)增插入酶切位點(diǎn)(EcoRI)，產(chǎn)物進(jìn)行EcoRI/Smal酶切并插入到質(zhì)粒PX8dT，該質(zhì)粒的是PBluescrpit II的衍生質(zhì)粒，BssHII-Cla I片段被刪除。PSDI-I的MunI-BgI片段被 CTNl 株的 MunI-Bg/ II 克隆 PZAD1-9 (40_482nt)、Sph I -Aat II 克隆、PSCTN(4041-4273nt)、PSCTN Aat II -Bg/ II 克隆(11475-11759)取代產(chǎn)生克隆 PSD1-1170，通過(guò)在482-4041nt4273-11472nt插入Aat II，XhoI限制性酶切位點(diǎn)構(gòu)建含有狂犬病毒全長(zhǎng)cDNA克隆的重組表達(dá)載體pCTN-1。實(shí)施例2高度減毒表達(dá)2拷貝相同糖蛋白基因的重組狂犬病毒的構(gòu)建采用PCR方法進(jìn)行狂犬病毒G基因Arg333 — Gin (相應(yīng)密碼子由AGA突變?yōu)镃AG)，Aspl64 — Serl64 (相應(yīng)密碼子由GAU突變?yōu)锳GU)的突變，I、含有雙拷貝的G基因的載體的構(gòu)建引物5 ' -CGATGTATACGTACGAAGATGTTCCTCAGCTCTCCTG-3 ' (B siWI 位點(diǎn))，引物 5 ' -CTTATCAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTACAGTCTGTCTCACCCCCA-3 ' (NheI 位點(diǎn))，模板為PCTN-I，產(chǎn)物用NheI和BsiWI限制內(nèi)切酶切，克隆形成PCTN-G，二次克隆形成PCTN-G-G，雙拷貝的G基因可測(cè)序。PCR的條件94°C預(yù)變性I分鐘，變性30s，45°C退火60s，72°C延伸120s，35次循環(huán)。2、含有雙拷貝的G基因的載體的定點(diǎn)突變
模板p CTN-G,弓丨物I:5' -AGGAATTCCCCGGGAAGATGGTTCCTGAGGCTCTCCTATTTGTA-3'引物2:5' -ACGCTCTAGAGCCCTTAATTAACGTTAACAGTCTGGTCTCACCCCA 3'，G基因中插入EcoRI和XbaI位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物酶切連接到pBlue-Script II K ( + )形成克隆pAG。用QuickChange XL定點(diǎn)試劑盒進(jìn)行突變，引物3:5' -GTCTTGTGACATTTTTACCAAGAGTAGAGGGAAGAGAGC-3'，引物4:5' -GCTCTCTTCCCTCACTCTTGGTAAAAATGTCACAAGAC-3'引物5:5' -GATGTCTTGTGACATTTTTACCTCCAGTAGAGGGAAGAGAGCATC-3'引物6:5' -GATGCTCTCTTCCCTCTACTGGAGGTAAAAATGTCACAAGACATC-3'突變后產(chǎn)物質(zhì)粒用XamI和PacI酶切連接后得到含有突變位點(diǎn)的雙拷貝G基因的重組狂犬病毒載體PCTN-GAGA以及含有突變位點(diǎn)的單拷貝G基因的重組狂犬病毒載體pCTN-GA。實(shí)施例3轉(zhuǎn)染BHK-21或BSR細(xì)胞用3. 2cm直徑的固體培養(yǎng)皿培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)基MEM+10%小牛血清。細(xì)胞80%鋪滿，按0.5M0I接種痘病毒天然毒株，感染I小時(shí)后，用不含小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，洗滌細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)。用5. Oii g含有突變位點(diǎn)的重組狂犬病毒載體pCTNGA-GA或pCTNGA、pCTN_P、pCTN_N、pCTN_L、pCTN-G質(zhì)粒按磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)染培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)4天后，上清移到BHK-21細(xì)胞在37°C培養(yǎng)4天。實(shí)施例4重組病毒G基因分析BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)的重組病毒CTN-GAGA，用PBS 洗滌，再用RNeasyMiniKitCQiagen 按說(shuō)明操作提取重組病毒 RNA。用 Superscript One StepRT-PCRkit (Invitrogen)，引物 1:5' -AACATGTTATGGTGCCATTAAACCGCT-3'和引物 2:5' -GGGTGTTAGTTTTTTTCATGGACTTGG-3'進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符，所述的重組病毒CTN-GAGA中含有雙拷貝的G基因，且G基因中存在以下位點(diǎn)的突變Arg333 — Gln(相應(yīng)密碼子由AGA突變?yōu)镃AG)，Aspl64 — Serl64 (相應(yīng)密碼子由GAU突變?yōu)锳GU)。該重組病毒CTN-GAGA株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCCNo. 6209，保藏日期為2012年6月14日。
實(shí)施例5重組狂犬病毒對(duì)新生小鼠的致病性新生小鼠15只腦部注射5 ill PBS含IO4個(gè)感染性病毒顆粒，感染3天后，用乙醚麻醉取腦按4倍體積加入PBS研磨離心，上清存于-80°C以確定病毒滴度。成年小鼠10只乙醚麻醉，腦腔注射10 U IPBS含IO5個(gè)感染性病毒顆粒，觀察30天是否有臨床癥狀，結(jié)果如表I所示。表I.重組狂犬病病毒對(duì)成年鼠的致病性
權(quán)利要求
1.一種制備無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒的方法，其特征在于將狂犬病毒基因組中的糖蛋白基因進(jìn)行以下位點(diǎn)的突變Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于在所述的狂犬病毒基因組中包含兩個(gè)拷貝的含有以下位點(diǎn)突變的糖蛋白基因Arg333 — Gin, Aspl64 — Ser。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的狂犬病毒糖蛋白基因來(lái)自狂犬病毒 CTN-I 株、aG 株、SAD 株、EAR 株、Flurg-LEP 株、Flurg-HEP 株或 PM 株。
4.由權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法制備得到的無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒。
5.如權(quán)利要求4所述的重組減毒狂犬病毒，命名為CTN-GAGA，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6209，保藏日期為2012年6月14日。
6.權(quán)利要求4或5所述的重組減毒狂犬病毒在制備預(yù)防由狂犬病毒引起的疾病藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物包括注射制劑和口服制劑。
8.一種疫苗組合物，其特征在于含有權(quán)利要求4或5所述的重組減毒狂犬病毒。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其特征在于所述的疫苗組合物為凍干疫苗，其還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)致病性的重組減毒狂犬病毒株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于生物疫苗領(lǐng)域，本發(fā)明的方法是將狂犬病固定毒經(jīng)逆向遺傳學(xué)克隆產(chǎn)生重組的狂犬病毒，其中狂犬病毒糖蛋白上決定免疫原性或致病性的位點(diǎn)的氨基酸333(Arg333→Gln)和164(Asp164→Ser)位點(diǎn)經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變，使其致病性降低，回復(fù)毒力返阻風(fēng)險(xiǎn)率降低，更優(yōu)選的，是將該突變的糖蛋白基因雙拷貝化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，由本發(fā)明方法制備得到的重組狂犬病毒株可用于制備低廉、適于口服或注射的狂犬病疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102796710SQ20121022078
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者呂宏亮, 張澍, 高斌戰(zhàn) 申請(qǐng)人:北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克爾生物制藥有限公司