專利名稱：整合素阻斷劑多肽ap25在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制腫瘤血管生成、具有整合素親和性和結(jié)合能力的一種整合素阻斷劑多肽AP25，此阻斷劑是一種多肽，該整合素阻斷劑多肽可用于實(shí)體腫瘤的治療。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是人類健康的首要?dú)⑹帧鹘y(tǒng)腫瘤治療雖然具有一定療效，但由于化學(xué)藥物非特異的細(xì)胞毒性，對(duì)患者具有較大的毒副作用，同時(shí)還容易產(chǎn)生耐藥性，給腫瘤患者帶來巨大痛苦。從1972年R)lkman提出了腫瘤血管增生學(xué)說以來，通過抑制腫瘤血管增生來治療腫瘤的報(bào)道大量涌現(xiàn)，并取得了巨大成功。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。絕大多數(shù)惡性實(shí)體腫瘤如卵巢癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等都是血管依賴性腫瘤。 新生血管一方面為腫瘤生長提供營養(yǎng)和氧氣，另一方面還是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。因此，抑制腫瘤新生血管可以有效抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。腫瘤新生血管受許多細(xì)胞因子調(diào)控，其中與腫瘤血管生成相關(guān)的重要腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分子之一是整合素家族的部分成員。整合素是細(xì)胞表面一種重要的粘附分子，是多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的受體，廣泛存在于細(xì)胞表面，是一個(gè)相當(dāng)大的受體家族。整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互粘附，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡起重要的調(diào)控作用，并在腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。整合素都是由一條α鏈和一條β鏈組成，兩條鏈在與配體的結(jié)合中都起作用，不同的α鏈和β鏈的組合決定了配體的特異性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)15種α鏈和9種β鏈。在腫瘤細(xì)胞中，整合素的組分發(fā)生了復(fù)雜的變化，大體上講，參與組織結(jié)構(gòu)的整合素?cái)?shù)量下降，而與細(xì)胞遷移有關(guān)的整合素?cái)?shù)量上升。整合素α 5β 1、α ν β 5、α ν β 3等都與血管新生和細(xì)胞遷移有關(guān)，其中α ν β 3的作用尤為重要。α ν β3由α ν亞基(CD51，150kD)和β 3亞基(CD61， 105kD)形成的跨膜異二聚體糖蛋白，又名VN受體。α ν β 3能識(shí)別配體分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp，RGD)。這類配體包括FN、VN、TSP_1和vWF等。α ν β 3可以表達(dá)于多種細(xì)胞類型，并與多細(xì)胞活動(dòng)過程中的多種配體結(jié)合，參與腫瘤的血管生成，侵襲轉(zhuǎn)移、 炎癥、傷口愈合和凝血等生理和病理過程。如α ν β 3能夠與金屬蛋白酶結(jié)合，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而更有利于侵入。此外，兩個(gè)受α ν β3影響的過程是細(xì)胞凋亡和血管新生，在參與血管新生的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，α ν β3的表達(dá)量也升高。在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，血管生長因子類與整合素的表達(dá)有著密切的關(guān)系，如VEGF、FGF都能夠上調(diào)α ν β 3的表達(dá)。 整合素α ν β3在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜高表達(dá)，而在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常器官系統(tǒng)不表達(dá)，為設(shè)計(jì)含有RGD序列的α ν β3配體小分子拮抗肽和α ν β3的單克隆抗體來治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。目前，國際上開發(fā)出的針對(duì)整合素的抑制劑主要是特異性抗體，如Vitaxine;或小分子配體抑制劑，如西侖吉肽等。還有一些整合素阻斷劑已進(jìn)入II期臨床，而我國尚未有相似或同類產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)。因此，非常有必要開發(fā)我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的此類藥物。ZL200510040378. 5高效抑制血管生成多肽及其制備方法和應(yīng)用，介紹幾種整合素抑制劑， 其一為整合素阻斷劑多肽序列為=Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有兩對(duì)二硫鍵，配對(duì)方式為1-4、2_3)(命名為AP25，1 kq. NO. 1)，該序列包含了整合素配體序列(Ala-Cys-As p-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly)(見 kq. NO. 2)和新生血管抑制序列 (Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)(見 kq. NO. 3)，其中整合素配體序列中含有 RGD-4C序列(Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly)(見 kq. NO. 4)，使該多肽序列可以有效地結(jié)合于腫瘤特異性表達(dá)的整合素亞型，并且該序列中含有新生血管抑制序列，能夠抑制腫瘤新生血管形成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果。先前專利中只是對(duì)黑色素瘤做了研究，本發(fā)明針對(duì)該序列做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤有治療作用，增加了其適用癥，拓展了其社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明針對(duì)序列Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gl y-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有兩對(duì)二硫鍵，配對(duì)方式為 1-4,2-3)做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種實(shí)體腫瘤有治療作用，增加了其適應(yīng)癥。技術(shù)方案整合素阻斷劑多肽AP25在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述的整合素阻斷劑的序列為 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg -Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有兩對(duì)二硫鍵，配對(duì)方式為1_4、2_3)(命名為AP25，見kq. NO. 1)，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、肺臟、肝臟、食管、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌以及肉瘤。有益效果研究發(fā)現(xiàn)，序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 是內(nèi)皮抑素的第60-70個(gè)氨基酸，在體外具有很好的抑制腫瘤新生血管生成的活性，其活性甚至高于內(nèi)皮抑素本身。RGD-4C序列是整合素的一個(gè)重要配體。因此，含有RGD-4C序列的多肽Ala-C ys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly 能夠特異性的識(shí)別整合素。本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg -Ala-Ala-Val-Pro的N端連接上與整合素家族具有親和性和結(jié)合能力的RGD-4C序列Ala -Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly,構(gòu)建了一種與整合素有高親和性和結(jié)合能力的多肽。該整合素阻斷劑多肽序列為Ala-CyS-ASp-CyS-Arg-Gly-ASp-CyS -Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，其含有 25 個(gè)氨基酸，分子中RGD-4C序列具有整合素親和性和結(jié)合能力。研究表明此整合素阻斷劑多肽主要作用靶點(diǎn)為整合素α ν、α 5亞基，并且該序列中含有新生血管抑制序列，從而抑制腫瘤新生血管形成，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果。雖然在先前的專利ZL200510040378. 5公開了該序列對(duì)黑色瘤有治療效果，但并未公開對(duì)其他腫瘤有治療效果。國內(nèi)外大量的研究表明即使是同一組織類型、分化程度相同的腫瘤，對(duì)同一藥物的敏感性也有可能不同，因此，藥物開發(fā)中對(duì)某一分子需要進(jìn)行抗腫瘤譜的篩選。因?yàn)橛行┧幬镏粚?duì)特定腫瘤細(xì)胞有效，對(duì)其他腫瘤是無效或低效，因此需要實(shí)驗(yàn)去摸索和驗(yàn)證其治療效果。發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)獲知該整合素阻斷劑靶點(diǎn)明確，在體外能夠明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的遷移、增殖及管狀結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)人的某些腫瘤細(xì)胞的增殖也有抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)具有明顯的抗腫瘤效果，且副作用小、用量少、成本低。說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的整合素阻斷劑多肽科學(xué)、合理、可行有效，能作為制備治療人類實(shí)體腫瘤的治療藥物，極大拓展了該整合素阻斷劑的治療譜，為將來藥物開發(fā)提供了新的思路和前景，具有顯著的社會(huì)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。以下所述的整合素阻斷劑多肽指的是整合素阻斷劑多肽AP25。


附圖1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)確定多肽的作用靶點(diǎn)；附圖2整合素阻斷劑多肽抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖作用；附圖3整合素阻斷劑多肽抑制人胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖作用；附圖4整合素阻斷劑多肽抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖作用；附圖5整合素阻斷劑多肽抑制人結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞的增殖作用；附圖6整合素阻斷劑多肽抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖作用；附圖7整合素阻斷劑多肽抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖作用；附圖8整合素阻斷劑多肽抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的遷移作用；附圖9整合素阻斷劑多肽抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的管狀結(jié)構(gòu)形成作用；附圖10整合素阻斷劑多肽對(duì)人鼻咽癌CNE裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖11整合素阻斷劑多肽對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖12整合素阻斷劑多肽對(duì)人甲狀腺癌SW-579裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖13整合素阻斷劑多肽對(duì)人胰腺癌SW-1990裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖14整合素阻斷劑多肽對(duì)人肺癌H460裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖15整合素阻斷劑多肽對(duì)人肝癌Bel-7402裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖16整合素阻斷劑多肽對(duì)人食管癌Ecl09裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖17整合素阻斷劑多肽對(duì)人胃癌MGC-803裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖18整合素阻斷劑多肽對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖19整合素阻斷劑多肽對(duì)人腎癌A498裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖20整合素阻斷劑多肽對(duì)人膽囊癌GBC-SD裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖21整合素阻斷劑多肽對(duì)人結(jié)腸癌HT-四裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖22整合素阻斷劑多肽對(duì)人卵巢癌SK-0V-3裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖23整合素阻斷劑多肽對(duì)人子宮內(nèi)膜癌HHUA裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；
附圖M整合素阻斷劑多肽對(duì)人宮頸癌HeLa裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖25整合素阻斷劑多肽對(duì)人前列腺癌DU-145裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖沈整合素阻斷劑多肽對(duì)人膀胱癌HT1376裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖27整合素阻斷劑多肽對(duì)人睪丸癌5637裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；附圖觀整合素阻斷劑多肽對(duì)肉瘤HT-1080裸鼠異種移植腫瘤生長抑制作用；
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1整合素阻斷劑多肽靶點(diǎn)分析采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)粘附實(shí)驗(yàn)確定整合素阻斷劑多肽的作用靶點(diǎn)。即先用一定濃度的多肽鋪96孔板，HUVEC細(xì)胞分別用不同的整合素亞基抗體孵育后進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)。與未用抗體孵育的細(xì)胞相比，如果用某種抗體孵育過的細(xì)胞對(duì)多肽的粘附明顯減少，則說明此多肽通過該整合素亞基與HUVEC作用。具體操作如下將多肽用PBS配制為 150μ g/ml的溶液，按每孔100μ 1鋪96孔板，4°C放置16小時(shí)后BSA于22°C水浴中封閉4 5小時(shí)。HUVEC細(xì)胞(只用第2 5代)在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90% 以上的匯合度時(shí)用無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液孵育4小時(shí)。胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5X105個(gè)/ml。將細(xì)胞分別用α ν、β 3、 α ν + β3、α5、β 1、α5+β 1整合素亞基抗體于4°C孵育2小時(shí)，并每隔一段時(shí)間震蕩細(xì)胞懸液，使細(xì)胞與抗體充分接觸。棄去96孔板中的BSA，鋪入細(xì)胞，每孔100 μ 1細(xì)胞懸液(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，于37°C粘附90分鐘。用PBS輕輕洗去未粘附的細(xì)胞后用甲醇-考馬斯亮藍(lán)混合液染色并固定40分鐘。用脫色液潤洗96孔板，除去考馬斯亮藍(lán)背景。向96孔板中加入1 % SDS,每孔100 μ 1，混和均勻于620nm處測(cè)吸光值。結(jié)果見圖1，用α ν、α ν + β 3、α 5、α 5+β 1整合素亞基抗體孵育組的細(xì)胞粘附數(shù)量與未用整合素亞基抗體孵育組相比具有極顯著性差異；用β3整合素亞基抗體孵育組的細(xì)胞粘附數(shù)量與未用整合素亞基抗體孵育組相比具有顯著性差異；用β 1整合素亞基抗體孵育組的細(xì)胞粘附數(shù)量與未用整合素亞基抗體孵育組相比具無顯著性差異。由此可以判斷，此整合素抑制劑多肽主要通過α ν、α 5兩種整合素亞基與HUVEC細(xì)胞相互作用。實(shí)施例2整合素阻斷劑多肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖抑制試驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)整合素阻斷劑多肽抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長的活性，內(nèi)皮細(xì)胞只用第 2-6代。HUVEC細(xì)胞在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%以上的匯合度時(shí)用胰蛋白酶消化收集，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3 X IO4個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，100 μ 1/孔，并于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。整合素阻斷劑多肽用培養(yǎng)液稀釋到各個(gè)預(yù)定濃度。恩度用培養(yǎng)液稀釋到終濃度。待細(xì)胞完全貼壁后，將各個(gè)稀釋液分別加入96孔板中(ΙΟΟμΙ/孔)。以加入整合素阻斷劑多肽稀釋液的作為給藥組， 以加入恩度、紫杉醇作為陽性對(duì)照組，以不加任何藥物的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。在37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱孵育72h。向96孔板中加入5mg/ml的MTT，每孔20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μ 1DMS0溶解，搖床10分鐘輕輕混勻。用酶標(biāo)儀在測(cè)定波長為570nm，參比波長為630nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算生長抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下PI(% ) =1-給藥組/陰性組試驗(yàn)得到的結(jié)果以mean士SD表示，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)T檢驗(yàn)，*P < 0. 05為顯著性差異， "P <0.01為極顯著性差異。表1.整合素阻斷劑多肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖抑制作用
權(quán)利要求
1.整合素阻斷劑多肽AP25在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述的整合素阻斷劑的序列為 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-A rg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro,其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、肺臟、肝臟、食管、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸、直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)、繼發(fā)的癌以及肉瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制腫瘤血管生成、具有整合素親和性和結(jié)合能力的一種整合素阻斷劑，此阻斷劑是一種多肽，該整合素阻斷劑多肽可用于實(shí)體腫瘤的治療。該整合素阻斷劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中所述的整合素阻斷劑的序列為Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有兩對(duì)二硫鍵，配對(duì)方式為1-4、2-3)，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦、甲狀腺、胰腺、肺臟、肝臟、食管、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌以及肉瘤。本發(fā)明其極大拓展了該整合素阻斷劑的治療譜，為將來藥物開發(fā)提供了新的思路和前景，具有顯著的社會(huì)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102488890SQ20111044303
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者徐寒梅, 楊永晶, 胡加亮 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)