專利名稱：一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，尤其是一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝的設(shè)計方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(PPV)能夠引起母豬繁殖障礙疾病，導(dǎo)致母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母豬不育等。目前該病已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。德國學(xué)者M(jìn)ayr首次最早發(fā)現(xiàn)了 PPV，我國學(xué)者潘雪珠等1983年成功實現(xiàn)該病毒的分離。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產(chǎn)生抗體時間長、不需要低溫保存的優(yōu)點；弱毒疫苗免疫效力較強、產(chǎn)生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術(shù)要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時預(yù)防兩種病或多種病的、能夠誘導(dǎo)較強的免疫反應(yīng)，但生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜、成本較高；基因疫苗生產(chǎn)工藝簡單、免疫劑量小、成本低廉、可構(gòu)建多基因或多價疫苗，但其安全性受到廣泛關(guān)注。由于滅活疫苗的存在上述優(yōu)點，因此該方法得到了廣泛的應(yīng)用。我國均普遍使用豬細(xì)小病毒滅活疫苗,使用的主要滅活劑有福爾馬林、￠-丙內(nèi)酯(^-PL) ,N-乙酰乙烯亞胺(AEI)、二乙烯亞胺(BEI)等。有試驗表明，豬細(xì)小病毒用福爾馬林滅活后制成疫苗的保護(hù)效果不如用N-乙酰乙烯亞胺滅活后制成疫苗的保護(hù)效果好；用^-丙內(nèi)酯滅活疫苗的保護(hù)力較好。免疫佐劑也是影響豬細(xì)小病毒滅活疫苗免疫效果的重要因素，但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低。目前經(jīng)常采用的佐劑是蜂膠、氫氧化鋁和油水乳劑。豬細(xì)小病毒滅活多聯(lián)疫苗的使用較為廣泛，主要有豬細(xì)小病毒-豬偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒-乙腦病毒等二聯(lián)苗，因為除了豬細(xì)小病毒外，豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征障礙病毒(PRRSV)、乙腦病毒(JEV)等均能引起母豬的繁殖障礙，而且多聯(lián)苗的使用可以簡化免疫程序，降低臨床應(yīng)激反應(yīng)，適合規(guī)?；B(yǎng)豬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種解決豬細(xì)小病毒的濃縮、純化及滅活的工藝設(shè)計問題；提供一種安全可行的疫苗生產(chǎn)方法，使該疫苗的生產(chǎn)能夠不再依賴傳統(tǒng)工藝從而生產(chǎn)出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產(chǎn)要求。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟(I)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細(xì)菌及細(xì)胞碎片雜質(zhì)，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于lg/L后，將豬細(xì)小病毒液排出；(2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進(jìn)行超濾處理，進(jìn)一步濃縮毒液，直到病毒血凝價達(dá)到到28 213時停止?jié)饪s，得到濃縮液；(3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價為28 213的細(xì)小病毒毒液；(4)將步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。血凝實驗(HA)是指病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象成為血凝，也稱為直接雪凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的實驗稱血凝實驗，病毒血凝價是指血凝試驗的檢測結(jié)果。固含量，又叫“不揮發(fā)份含量”，是乳液或涂料在規(guī)定條件下烘干后剩余部分占總 量的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。進(jìn)一步，所述的微濾和超濾膜分離材料可以是有機膜材料也可以是無機膜材料。主要包括陶瓷材料、金屬材料及有機高分子材料。其中有機高分子主要有醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚乙烯醇或聚哌嗪酰胺；無機氧化物材料主要有氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯以及氧化鉿。進(jìn)一步，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓力0. 01 0. 5MPa，膜面流速I 5m/ s。進(jìn)一步，在步驟(4)中，所述細(xì)小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液，采用二乙烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為0. I % I %，滅活溫度為25 38°C，滅活時間為24 120小時。進(jìn)一步，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品的具體步驟為(I)油相制備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-804 8份，混合后，在壓強為0. IMP 0. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用；(2)水相制備取濃縮后滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解；(3)乳化取油相2 4份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相I份，持續(xù)攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，后通過剪切機2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的技術(shù)方案用于豬細(xì)小病毒滅活疫苗的純化、濃縮工藝設(shè)計，提高了疫苗的抗原含量、去除了雜蛋白，改善了疫苗的免疫效果，同時減少了注射疫苗時動物的應(yīng)激反應(yīng)；使動物在獲得疫病保護(hù)的同時不影響相關(guān)生產(chǎn)性能，增加了養(yǎng)殖戶的收益，具有廣泛的社會效益和經(jīng)濟效益。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例I本實施案例說明豬細(xì) 小病毒毒液制備的方法I、細(xì)胞制備從液氮罐中取出細(xì)胞置37°C水浴中快速融化，將細(xì)胞移入裝有10%胎牛血清細(xì)胞生長液的細(xì)胞瓶中，37°C培養(yǎng)，當(dāng)長成良好單層時用胰酶消化液消化細(xì)胞，按I 2傳代逐級擴大。將擴大培養(yǎng)的種子細(xì)胞接種到15000ml毫升轉(zhuǎn)瓶中，每瓶加IOOOml含10%新生牛血清的細(xì)胞生長液，37°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶速度為6 12轉(zhuǎn)/小時，待長成良好單層后，用胰酶消化液消化細(xì)胞，按I : 3分瓶傳代。2、病毒繁殖取F13代BJ-2株P(guān)PV生產(chǎn)種毒，按2%接種量接種于生長良好的ST細(xì)胞，同時加入含2%胎牛血清的細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)情況。3、收獲與保存接毒后每天觀察細(xì)胞生長和病變(CPE)的情況，并做好詳細(xì)記錄。培養(yǎng)至72 96小時，當(dāng)CPE達(dá)到70-80%時收獲培養(yǎng)物，反復(fù)凍融2 3次，_20°C以下保存?zhèn)溆?，時間不超過6個月。實施例2本實施案例說明豬細(xì)小病毒純化、濃縮的方法取血凝價為28的豬細(xì)小病毒液20000毫升，進(jìn)行純化、濃縮，測定血凝價，比較其濃縮前后的差異。具體步驟如下(I)將原料液加入孔徑為0. 22微米的微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，濃縮液返回原料罐，大約10分鐘后將原料液排出；收集滲透壓，此時觀察滲透液、清澈、明亮，既已除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進(jìn)入下一步超濾濃縮步驟。(2)細(xì)小病毒毒液的超濾濃縮將已預(yù)處理的滲透液，用lm2的截留分子量為30KD的聚醚砜平板膜包濃縮，進(jìn)一
步濃縮毒液，濃縮參數(shù)見下表
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，其制備步驟具體如下 (1)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述滲透液中不含有細(xì)菌及細(xì)胞碎片雜質(zhì)，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于lg/L后，將豬細(xì)小病毒液排出； (2)將通過步驟(I)處理的滲透液，進(jìn)行超濾處理，進(jìn)ー步濃縮毒液，直到病毒血凝價達(dá)到到28 213時停止?jié)饪s，得到濃縮液； (3)將步驟(2)處理完的濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價為28 213的細(xì)小病毒毒液； (4)將步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述微濾膜孔徑為IOOnm 220nm，超濾膜孔徑為5KD 200KD。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的微濾和超濾的膜為陶瓷材料、金屬材料、有機高分子材料、無機氧化物材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述有機高分子材料為醋酸纖維素、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚酰胺、聚こ烯醇或聚哌嗪酰胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述無機氧化物材料為氧化鋁、氧化鈦、氧化錯、氧化鉿。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述微濾及超濾的操作條件為溫度5 50°C，壓カO. 01 O. 5MPa，膜面流速I 5m/s。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述細(xì)小病毒毒液的滅活包括收集步驟(3)得到的細(xì)小病毒毒液，采用ニこ烯亞胺作為滅活劑，滅活劑濃度為O.1% 1%，滅活溫度為25 38°C，滅活時間為24 120小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品的具體步驟為 (1)油相制備取注射用白油90 98份，加硬脂酸鋁I 3份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-80 4 8份，混合后，在壓強為O. IMP O. 15MP、溫度為115 130°C的條件下，滅菌備用； (2)水相制備取濃縮后滅活的病毒液90 98份，加入滅菌的吐溫-802 8份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解； (3)乳化取油相2 4份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相I份，持續(xù)攪拌30 70分鐘，攪拌速度600 1200r/min，后通過剪切機2 3次剪切，剪切速度3000 5000r/min,即制成豬細(xì)小病毒滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備方法，其制備步驟具體如下(1)將豬細(xì)小病毒液從原料罐中放入微濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾，得到滲透液及濃縮液，所述濃縮液返回原料罐，當(dāng)豬細(xì)小病毒液固含量大于或等于1g/L后，將豬細(xì)小病毒液排出；(2)將滲透液進(jìn)行超濾處理，進(jìn)一步濃縮毒液，直到病毒血凝價達(dá)到到28～213時停止?jié)饪s，得到濃縮液；(3)將濃縮液用微濾系統(tǒng)再過濾，處理完后得到血凝價為28～213的細(xì)小病毒毒液；(4)將細(xì)小病毒毒液滅活及將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品。本發(fā)明提供一種安全可行的疫苗生產(chǎn)方法，使該疫苗的生產(chǎn)能夠不再依賴傳統(tǒng)工藝從而生產(chǎn)出高滴度的毒液，提高抗原含量，滿足免疫生產(chǎn)要求。
文檔編號A61P31/20GK102688485SQ20111027610
公開日2012年9月26日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者傅元華, 沈明君, 潘杰, 范娟, 錢鐘 申請人:揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司