專利名稱：皮膚護理組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及涂敷于人體皮膚的局部用組合物及其在改進皮膚的狀況和表觀中的應用。
消費者正逐漸追求抗衰老化妝產(chǎn)品，其可以處理或延遲慢性老化和光老化皮膚的明顯征兆，例如皺紋、紋線、下垂、色素沉著過度和老年斑。
消費者還常常尋求化妝品中除抗衰老以外的益處。敏感皮膚的概念也使消費者更加需要可以改善敏感、干燥和/或薄片狀皮膚的表觀和狀況并緩解紅色和/或刺激皮膚的化妝品。消費者也期待具有油/皮脂控制效果的化妝品。
許多人關心其皮膚色素沉著的程度。譬如，帶有老年斑或雀斑的人可能希望此類著色斑點變得不明顯。其他人可能希望減小因與日光接觸所引起的皮膚顏色變深或希望增亮其天然膚色。為了滿足這些需要，人們努力開發(fā)出降低黑素細胞中的顏色生產(chǎn)的產(chǎn)品。然而，目前的物質被認為易于產(chǎn)生不良副作用，如皮膚刺激性。
所以此類物質不適合化妝品使用，或者它們只可以在一定濃度下使用，而在該濃度下其皮膚增亮作用比預期的小。人們認為利用不同皮膚增亮物質的聯(lián)合形式可以減小副作用，但使用聯(lián)合形式卻存在因競爭作用導致的皮膚增亮作用削弱的巨大危險。因此，特別需要改進化妝用皮膚增亮產(chǎn)品的有效性，使它們不刺激皮膚。
J07277939描述了一種用于改進皮膚老化和皮膚炎癥的皮膚護理組合物，其含有(A)Flor dr manita和(B)至少一種選自氧清除劑、抗氧劑、細胞活化劑、抗炎劑、酪氨酸酶抑制劑和保濕劑的活性劑。其中，組分B所述的組分很多選擇槲皮素、槲皮醇素(quercitolin)、兒茶素、沒食子酸、γ-亞麻酸和二十碳五烯酸。
J05271046描述了一種皮膚增亮組合物，其含有具有18-22個碳原子和兩個或多個不飽和鍵的不飽和脂肪酸，如亞油酸和花生四烯酸，以及多酚。
WO 99/26588描述了一種抗衰老皮膚護理制劑，其中含有偶聯(lián)亞油酸且其可以任選地含有常規(guī)防曬劑，如二苯酮。
上述現(xiàn)有技術沒有概括偶聯(lián)亞油酸于酚類化合物(其不是防曬劑)的特定協(xié)同聯(lián)合形式，也沒有概括這種特定聯(lián)合形式在處理皺紋、敏感皮膚、干燥皮膚、控制油/皮脂分泌或增亮皮膚中的應用。起防曬劑作用的酚類化合物特別排除在本發(fā)明的范圍內。
防曬劑在此定義為是指當利用食品和藥物管理?？翘幏饺擞梅罆袼幬锂a(chǎn)品；末次?？_在聯(lián)邦注冊卷64，98期，1999年5月21日，27666-27691中所述的標準方案測試化妝品時對人體皮膚提供至少2的防曬因子(SPF)的成分。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，通過將化妝品組合物涂敷在皮膚上可以獲得對因慢性老化或光老化導致的正常(但化妝上不良的)皮膚狀況，如皺紋、紋線、下垂、色素沉著和老年斑的有效治療和預防，所述的化妝品組合物含有與酚類化合物聯(lián)合的偶聯(lián)亞油酸和/或其衍生物組成，條件是該酚類化合物不是防曬劑。我們還發(fā)現(xiàn)，此類化妝品組合物的使用有利于提供除抗老化以外的其他皮膚益處，譬如平撫敏感和/或刺激皮膚，控制油/皮脂的分泌且增亮皮膚。
按照本發(fā)明的第二方面，提供一種產(chǎn)生至少一種選自下列的皮膚護理益處的美容方法處理/預防起皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；促進皮膚中膠原的沉積作用，提高皮膚中核心蛋白聚糖的生產(chǎn)，增強組織修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；控制油/皮脂分泌，該方法包括在皮膚上涂敷上述化妝品組合物。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明組合物在提供至少一種選自下列皮膚護理益處中的應用處理/預防起皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；促進膠原沉積在皮膚中，提高皮膚中核心蛋白聚糖的生產(chǎn)，增強組織修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；和控制油/皮脂分泌。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供與酚類化合物或其混合物聯(lián)合的偶聯(lián)亞油酸和/或其衍生物在提供至少一種選自下列美容皮膚護理益處的化妝品局部組合物中的應用，條件是所述的酚類化合物不是防曬劑處理/預防皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；促進膠原沉積在皮膚中，促使皮膚中核心蛋白聚糖的生產(chǎn)，增強組織修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；和控制油/皮脂分泌。
本發(fā)明的組合物、方法和應用產(chǎn)生抗老化益處，由此能夠促使光滑和柔軟皮膚具有改進的彈性并且減少或延遲皺紋和衰老皮膚的出現(xiàn)，同時改進皮膚色澤。因此獲得表觀、紋理和狀況的全面改善，特別是皮膚的光澤、透明度和總體年輕化表觀。本發(fā)明的組合物、方法和應用也有益于平撫和平緩敏感和/或刺激皮膚，增亮皮膚且控制油/皮脂的分泌。所以，本發(fā)明有利于提供廣泛的皮膚護理益處。
此處所用的術語“處理”在其范圍內包括減輕、延緩和/或預防上述正常皮膚狀況(如皺紋、老化和/或光損傷)和/或刺激皮膚，并且通過預防或減輕刺激、起皺且提高柔軟性、堅固度、光滑度、彎曲性和彈性來全面提高皮膚的品質并改善其表觀和紋理。本發(fā)明的組合物、方法和應用可以有效處理已經(jīng)起皺、老化、光損傷、刺激的病癥，或者用于處理年輕皮膚以預防或減少上述那些因正常衰老/光老化過程導致的不良變化。發(fā)明詳述偶聯(lián)亞油酸偶聯(lián)亞油酸(此后稱為CLA)是二元不飽和長鏈(C18)脂肪酸。CLA包括一系列的亞油酸的位置和幾何異構體，其中可以是位置(6，8)，(7，9)，(8，10)，(9，11)，(10，12)或(11，13)上順式和反式雙鍵的多種構型。因此，存在24種不同的CLA異構體。
本發(fā)明還包括游離酸的衍生物，因此其含有偶聯(lián)亞油酸部分。優(yōu)選的衍生物包括那些從酸的羧基的取代作用衍生的化合物，例如酯(如甘油三酯、甘油單酯、甘油二酯、磷酯)、酰胺(例如神經(jīng)酰胺衍生物)、鹽(例如堿金屬和堿土金屬鹽、銨鹽)；和/或那些從C18碳鏈的取代作用衍生的化合物，如α羥基和/或β羥基衍生物。
在甘油三酯衍生物的情況中，包括所有取代在甘油主鏈上的CLA的位置異構體。所述的甘油三酯必須含有至少一個CLA部分。例如，在甘油主鏈上的三個可酯化位置中，第1和2位置可以被CLA酯化而第3位可以被另一脂質酯化，或者同樣地，CLA可以在甘油主鏈的1和3位上酯化且在2位上被另一脂質酯化。
適用于本發(fā)明的CLA的最優(yōu)選異構體是順式9反式11(c9 t11)或反式10順式12(t10 c12)異構體。優(yōu)選在所述的組合物中存在至少1％(重量)的總CLA(和/或CLA部分)是c9，t11和/或t10，c12異構體的形式。更優(yōu)選在所述的組合物中存在至少20％(重量)且首選至少40％(重量)的總CLA和/或CLA部分是c9，t11異構體和/或t11，c12異構體的形式。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述的偶聯(lián)亞油酸富集c9t11或t10，c12異構體。所謂“富集”是指組合物中存在至少50％(重量)的總CLA和/或CLA部分為順式9，反式11或反式10順式12異構體。優(yōu)選在組合物中存在至少70％(重量)、更優(yōu)選至少80％(重量)和首選至少90％(重量)的總CLA和/或CLA部分為c9，t11異構體或t10，c12異構體。
本發(fā)明的含有CLA的CLA和/或其衍生物是商購的油，它們富集偶聯(lián)亞油酸甘油三酯，如桐油或脫水蓖麻油(Unichema)。一種混合異構體產(chǎn)品購自Sigma，并且富集c9 t11異構體的CLA購自MatreyaInc.。同樣地，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方式CLA可以按照WO 97/18320所公開的方法制備，該文獻在此引入作為參考。一個優(yōu)選的制備方法公開在下文實施例1中。
無論術語“偶聯(lián)亞油酸”或“CLA”用于說明書中何處，其應被理解為包括含CLA部分的衍生物。CLA部分是指CLA衍生物的CLA脂肪?；糠?。
按照本發(fā)明所用的CLA是以有效量存在于所述的局部用組合物中。通常，活性物質的量占該組合物的0.0001％至50％(重量)。更優(yōu)選該含量為0.01％至10％且首選0.1％至5％，從而以最小的成本得到最大的效益。
本發(fā)明的組合物還特別含有視黃酸、視黃醇、視黃基酯和/或LRAT/ARAT抑制劑。酚類化合物酚類化合物根據(jù)其基本化學結果可以分為至少10個不同的種類。此類化合物包括簡單酚類化合物(C6)、苯醌類(C6)、酚酸類(C6-C1)、苯乙酮類(C6-C2)、苯基乙酸類(C6-C2)、羥基肉桂酸類(C6-C3)、苯基丙烯類(C6-C3)、香豆素類、異香豆素類(C6-C3)、色酮類(C6-C3)、焦油醌類(naftoquinone)(C6-C4)、咕噸酮類(C6-C1-C6)、芪類(C6-C2-C6)、類黃酮類(flavonoid)(C6-C3-C6)、木酚素類、新木酚素(C3-C3)2和木質素(C6-C3)n。
術語類黃酮類化合物表示一組非常大的化合物，其由兩個芳環(huán)組成，芳環(huán)提高三個碳單位相連，如C6-C3-C6。類黃酮族的化合物包括類異黃酮類化合物、單體黃酮醇類化合物、二氫類黃酮類化合物、原化色素類化合物、花色素類化合物、黃酮類化合物、二氫黃酮類化合物、查耳酮類化合物、雙氫查耳酮類化合物、異黃酮類化合物、新黃酮類化合物、橙酮類化合物、2-次苯甲基苯并呋喃酮類化合物、黃烷-3-醇類化合物和anthrocyanin類化合物。術語“類異黃酮”也包括異黃酮類化合物、紫檀烷類化合物、異二氫黃酮類化合物、魚藤酮類化合物、異黃烷類化合物和異黃醇類化合物。
優(yōu)選用于本發(fā)明組合物中的酚類化合物是類黃酮類化合物，包括黃酮類化合物，如柚皮素；黃醇類化合物，如槲皮素、兒茶素(如表棓兒茶素沒食子酸酯，EGCG)；類異黃酮類化合物，如黃豆苷原、染料木黃酮、lycetin；酚類化合物，如沒食子酸；和綠茶多酚類化合物。
柚皮素、槲皮素、黃豆苷原、染料木黃酮、EGCG和綠茶多醇可以購自Sigma。含有酚類化合物的植物提取物也適用于本發(fā)明。譬如，蘆丁、報春花、紫羅蘭、柑橘屬含有槲皮素和柚皮素，達到含有黃豆苷原和染料目黃酮，并且多種綠茶如普洱茶(Camellia sinensisand assamica)含有EGCG和綠茶多酚。
本發(fā)明特別排除在外的酚類化合物是那些常用于防曬劑的酚類化合物，如對氨基苯甲酸和二苯酮。
本發(fā)明中所用的酚類化合物或其混合物的含量是約0.01％至約10％(重量)，優(yōu)選約10％至約1％(重量)，首選約0.1％至約5％。皮膚可接受賦形劑本發(fā)明所用的組合物還含有皮膚/化妝上可接受的賦形劑以給活性成分起稀釋劑、分散劑或載體的作用。所述的賦形劑可以含有皮膚護理產(chǎn)品中常用的物質，如水、液態(tài)或固態(tài)潤膚劑、硅油、乳化劑、溶劑、濕潤劑、增稠劑、粉末、拋射劑等。
所述的賦形劑通常是在組合物的5％至99.9％(重量)，優(yōu)選25％至80％(重量)，并且可以在其他化妝附加劑不存在下，構成該組合物的余量。任選的皮膚有益物質和化妝品添加劑除了活性劑以外，還可以含有其他特殊的皮膚有益活性劑，如防曬劑，其他皮膚增亮劑、皮膚曬黑劑。所述的賦形劑也可以進一步含有添加劑，如香料、遮光劑、著色劑和緩沖劑。產(chǎn)品制備、形式、應用和包裝為了制備本發(fā)明方法中所用的局部組合物，可以采用制備皮膚護理產(chǎn)品的常規(guī)方式?；钚猿煞忠话阋猿Ｒ?guī)方式摻混在皮膚/化妝上可接受的載體中。活性成分首先可以適當?shù)厝芙饣蚍稚⒃谝徊糠炙谢蛄硪徊糠秩軇┗蛞后w中以便混合在組合物中。優(yōu)選的組合物是水包油或油包水或水包油包水乳液。
所述組合物可以是常規(guī)的皮膚護理產(chǎn)品的形式，如膏霜、凝膠和洗液，膠囊等。組合物也可以是所謂的”洗除式“產(chǎn)品，例如盆浴或淋浴用凝膠，可以含有活性劑的傳遞體系從而在漂洗中增強對皮膚的粘著。首選的產(chǎn)品是“免洗”產(chǎn)品，它是一種涂敷在皮膚上但無需在涂敷于皮膚之后進行一步有意的漂洗步驟的產(chǎn)品。
所述的組合物可以以常規(guī)方式包裝為任何適當?shù)臉邮?，如罐、瓶、管、走珠等。也可以考慮將本發(fā)明的組合物包裝為兩種獨立組合物的套盒，其中之一含有偶聯(lián)亞油酸同時第二組合物含有酚類化合物，這兩種獨立的組合物可以同時或連續(xù)涂敷在皮膚上。
本發(fā)明的組合物也可以配制為適合口服消化的形式，如片劑、膠囊等。
對于需要處理的皮膚，每天可以進行一次或多次的本發(fā)明的方法。皮膚表觀的改善一般是在3至6個月之后變得明顯，這取決于皮膚的狀況、本發(fā)明方法所用活性成分的濃度、組合物的用量及其涂敷的頻率。通常，將少量如0.1至5ml的的組合物涂敷在皮膚上，組合物取自適當?shù)娜萜骰蛲糠笃?，并且用手或手指或適當?shù)难b置鋪展和/或擦抹到皮膚中。隨后可以進行漂洗步驟，也可以不進行漂洗步驟，這取決于該組合物是否配制為免洗或洗除式產(chǎn)品。
為使本發(fā)明更加容易理解，給出下列實施例，其僅僅是舉例說明。
表1
2.富集c9 t11異構體的CLA的制備(I)月桂基酯的制備將從紅花制備的CLA(2.0kg)加入到2×摩爾當量的月桂醇(1-十二烷醇；98％Aldrich chemicals出產(chǎn))和5.96kg的軟化水。溫度調至25℃且加入與少量水預混的1％(w/w)的念珠地絲菌(AmanoPharmaceuticals出品，日本)，并且劇烈攪拌。在44小時時中止該反應。將容器加熱至80-90℃，排出水層，該油用軟化水洗滌且在100℃真空下干燥30分鐘。使油冷卻至50℃，其經(jīng)含有Whatman濾劑和一薄層的硅藻土-hyflo-助濾劑的布氏系統(tǒng)過濾。(II)富集c9，t11CLA酯的分離通過分子蒸餾以25-35ml/分鐘在130℃下除去殘留的月桂醇。通過在158℃下以25-35ml/分鐘的流量蒸發(fā)可以將殘余物粗分為月桂基酯(富集c9，t11 CLA)和游離酸(富集t10，c12CLA)。通過在171℃下以30-40ml/分鐘的流量進一步蒸餾可以除去任何殘留在月桂基酯中的游離酸。90℃下用330ml的4M AR氫氧化鈉中和2790g的月桂基酯殘余物，隨后從水相分離出油，油在熱的軟化水中洗滌3次，進一步用0.1M堿洗滌且用熱水洗滌2次。富集月桂基酯的油樣品按上述方法干燥。(III)富集c9，t11CLA月桂基酯的皂化富集c9，t11CLA的月桂基酯用AR氫氧化鈉/96％食用級乙醇皂化，并且用AR濃鹽酸再次酸化。將含有富集CLA游離脂肪酸的反應混合物在100℃下干燥且按照上述方法在約50℃下過濾。在132℃下以25-30ml/分鐘蒸除月桂醇。為了除去任何殘留的月桂醇，用SP392米赫毛霉脂肪酶(5％，批次lux 0110，Novo Nordisk出產(chǎn))將存在于反應混合物中的游離醇酯化為脂肪酸。在真空155℃下以15-20ml/分鐘利用分子蒸餾從月桂基酯分離出含有富集C9 t11CLA的脂肪酸。按照上述方法制備的富集C9 t11CLA的組成如下表2所示表2
(II)富集t10，c12CLA的制備在130℃下以25-35ml/分鐘通過分子蒸餾除去殘留的月桂醇。以25-35ml/分鐘的流量通過在158℃下蒸發(fā)可以將殘余物粗分為月桂基酯(富集c9，t1 CLA)和游離酸(富集t10，c12 CLA)。富集t10，c12CLA的分離由上述步驟(II)得到的CLA游離酸重新在160℃-165℃下以20-30ml/分鐘蒸餾從而降低酯的含量。通過在131℃和25-30ml/分鐘的流量下蒸餾可以進一步減少殘留的月桂醇。為了除去所有殘留的月桂醇，用SP392米赫毛霉脂肪酶(5％，批次lux 0110，Novo Nordisk出產(chǎn))將存在于反應混合物中的游離醇酯化為脂肪酸。真空155℃下以15-20ml/分鐘、利用分子蒸餾從月桂基酯分離出含有富集C10 t12CLA的脂肪酸。按照上述方法制備的富集C10 t12 CLA的組成如下表3所示表3
實施例2-t10，c12 CLA甘油三酯的制備按照實施例1制備的富集t10，c12 CLA(10g)與1.01g(10.1％)甘油(Pricerine 9083甘油CP，得自Ellis & Everards)混合，并且加入0.5g(約5％)的SP392米赫毛酶非特異性脂酶(米赫毛酶，NovoNordisk產(chǎn)，批次Lux 0110)。該混合物在真空下60℃旋轉蒸發(fā)并且排出微量氮。
96小時后，該混合物經(jīng)布氏濾器上的一個薄層的硅藻土高級(super-cel)助濾劑過濾使該反應中止，收集CLA甘油三酯油相，其組成如下表4所示表4
實施例3人體皮膚成纖維細胞中的前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的測量方法皮膚成纖維細胞條件培養(yǎng)基的制備將2期(P2)的初級人包皮成纖維細胞接種在12孔平板中達到10000個細胞/cm2且在5％二氧化碳和4％氧的氣氛下在Dulbeccos改進的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中維持24小時，該培養(yǎng)基中補充10％胎牛血清。此后，細胞用無血清DMEM洗滌并在新制的無血清DMEM中培養(yǎng)60分鐘。隨后成纖維細胞單層再用無血清DMEM洗滌。一式三份向細胞加入試驗試劑和載體對照使終體積為0.4ml/孔新制無血清DMEM，并且進一步培養(yǎng)24小時。這種成纖維細胞條件培養(yǎng)基或者立刻加以測定，或者在液氮中急凍且儲存在-70℃以便進一步分析。此后將細胞計數(shù)且將斑點印跡分析所得的數(shù)據(jù)標準化為細胞數(shù)。實施例4皮膚成纖維細胞條件培養(yǎng)基中前膠原-I和核心蛋白聚糖蛋白的斑點印跡分析向得自用載體(作為對照)或試驗試劑處理的皮膚成纖維細胞的條件培養(yǎng)基的樣品中補充20mM二硫蘇糖醇(1∶10稀釋的200mM儲備溶液)和0.1％十二烷基硫酸鈉(1∶100稀釋的10％儲備溶液)，充分混合且在75℃下培養(yǎng)2分鐘。該試驗的標準品是通過連續(xù)稀釋的純成纖維細胞條件培養(yǎng)基制成，該培養(yǎng)基得自將成纖維細胞接種在175cm2燒瓶內至10000個細胞/cm2且維持在上述無血清DMEM中。
此后，用得自Bio-Rad的96孔生物斑裝置按照制造商說明書中所述的方法將試驗樣本一式三份涂在一片預濕的Immobilon-P轉移膜上。每孔中使用約200μl的培養(yǎng)基。令培養(yǎng)基經(jīng)膜在重力作用下過濾(30分鐘)，其后膜用PBS(200μl)洗滌2次。這些PBS洗滌液經(jīng)膜在重力作用下過濾(2×15分鐘)。此后將該生物印跡裝置與真空復式接頭連接，在抽濾下進行第三次和末次PBS洗滌。拆開該裝置，取出膜并按照要求迅速切割，隨后置于封阻緩沖液中4℃下過夜。
由核心蛋白聚糖試驗制備的膜用存在于PBS中的3％(w/v)BSA/0.1％(v/v)吐溫20封阻，而那些前膠原-I分析的膜用存在于PBS中的5％(w/v)脫脂干燥奶粉/0.05％吐溫封阻。第次日，室溫下用1∶10000稀釋的初級抗體探測2小時膜的人前膠原-I(MAB1912；大鼠單克??；Chemicon Int.Inc.，Temecula，CA)或人核心蛋白聚糖(兔多克隆；Biogenesis)。隨后膜用TBS/0.05％吐溫20(3×5分鐘)洗滌，并且在室溫下用1∶1000稀釋的125I-偶聯(lián)的抗大鼠或抗兔F(ab’)2片段(Amersham)按照要求培養(yǎng)1小時。此后，Immobilon抽提物用TBS/吐溫20(3×5分鐘)洗滌，隨后令其在室溫下空氣中干燥。干燥的膜卷在玻璃紙中并在分子動力學磷光體篩下暴露16-18小時。結束時，通過磷成像(phosphorimager)(Molecular DynamicsPhosphorimager SF)利用ImageQuantTM軟件掃描暴露的篩。通過計算機輔助成像分析、利用ImageQuantTM中的定量工具評估印跡強度，標準化為細胞數(shù)目，并且相對于100個隨意單位的載體處理對照值測定不同試驗試劑對核心蛋白聚糖和前膠原-I合成的作用。實施例5試驗下表5表示與酚類化合物表棓兒茶素沒食子酸酯(EGCG)聯(lián)合的偶聯(lián)亞油酸對人體皮膚成纖維細胞中的前膠原-I和/或核心蛋白聚糖合成的協(xié)同作用，并且給出了所涂敷活性劑的量。為了使結果標準化，相對于100隨意單位的載體處理對照值測定試驗物質的作用。試驗中所用試劑的濃度對細胞的生存力沒有影響。
表5
表5的結果表明，和對照品比較，偶聯(lián)亞油酸和表棓兒茶素沒食子酸酯的聯(lián)合形式協(xié)同增量調節(jié)人體皮膚成纖維細胞中前膠原-I和/或核心蛋白聚糖的合成。核心蛋白聚糖在皮膚中的水平于皮膚狀況和表觀的改善有關。提高皮膚中核心蛋白聚糖的水平對于控制和矯正皮膚中膠原的沉積作用十分重要，其于許多皮膚益處有關，如皺紋消失和光損傷皮膚的皮膚修復。
將2期(P2)的初級人包皮成纖維細胞接種在96孔平板中達到10000個細胞/cm2且在5％二氧化碳的氣氛下在Dulbeccos改進的Eagles培養(yǎng)基(DMEM)中維持24小時，該培養(yǎng)基中補充10％胎牛血清。將表7中所列的試驗物質一式三份加入新制的細胞培養(yǎng)基(DMEM，補充10％胎牛血清)，二甲基亞砜和乙醇終濃度＜1％。向培養(yǎng)基中加入10nM佛波醛(phorbal)肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(Sigma)并且使細胞進一步培養(yǎng)24小時。只含有載體的對照品不含有任何試驗化合物或任何PMA。隨后立刻按照下面的方法分析成纖維細胞/培養(yǎng)基，或者在液氮中急凍且儲存在-70℃以便進一步分析。此后將細胞計數(shù)且將斑點印跡分析所得的數(shù)據(jù)標準化為細胞數(shù)。前列腺素2(PGE2)試驗在氫氣振搖培養(yǎng)平板之后取體積為50μl培養(yǎng)基用于PGE2試驗。用于Biotrak PGE2免疫測定試劑盒(Amersham，UK)測定PGE2水平。該試驗基于樣品中未標記PGE2與固定量的辣根過氧化物酶標記PGE2之間對于有限量的固定PGE2特異性抗體的競爭作用。根據(jù)同時獲得的標準曲線測定未標記樣品PGE2的濃度。ICAM-1試驗棄去培養(yǎng)基，細胞用Dulbecco PBS洗滌。向洗滌過的細胞用3分鐘加入150μl 0.1％Triton X-100(Sigma)以提取細胞膜中的ICAM。將提取物轉移到Eppendoff離心管中且在1000g下離心2分鐘除去細胞碎片。ICAM試驗使用了體積為100μl的上清液。用市售的免疫酶(immunoenzymometric)分析試劑盒(R & D Systems)評估可溶性ICAM-1?；谄叫羞M行的標準曲線測定樣品中ICAM-1的濃度。
由PGE2和ICAM試驗獲得的結構概括在下表6中。
表6
上述結果表明，通過前列腺素E2(PGE2)生產(chǎn)測定，用炎癥刺激物PMA(佛波醛肉豆蔻酸酯乙酸酯)刺激的細胞引起炎癥反應增強。根據(jù)PGE2生產(chǎn)的測定，偶聯(lián)亞油酸與酚類化合物的特定聯(lián)合協(xié)同地降低了這種炎癥反應。這些結果由此證明，本發(fā)明范圍內的活性劑的特定聯(lián)合表現(xiàn)出令人驚奇的協(xié)同抗炎活性。
上述結果還證明，用PMA刺激的細胞提高了ICAM生產(chǎn)。用偶聯(lián)亞油酸與酚類化合物的聯(lián)合形式處理這種細胞可以協(xié)同地降低胞內粘著分子(ICAM)的生產(chǎn)，是炎癥的另一標志。這些結果進一步證實了本發(fā)明范圍內的活性劑的特定聯(lián)合形式表現(xiàn)出良好和令人驚奇的抗炎活性。
權利要求
1.一種局部用組合物，含有(a)偶聯(lián)亞油酸和/或其衍生物；(b)酚類化合物或其混合物；(c)皮膚可接受賦形劑；條件是酚類化合物不是防曬劑。
2.權利要求1的局部用組合物，其中至少1％(重量)的酸和/或其衍生物的偶聯(lián)亞油酰部分是作為順式9，反式11異構體和/或反式10，順式12異構體存在。
3.按照權利要求2的局部用組合物，其中至少50％(重量)，并且優(yōu)選至少90％(重量)的酸和/或其衍生物的偶聯(lián)亞油酰部分是作為順式9，反式11異構體和/或反式10，順式12異構體存在。
4.按照上述權利要求任一項的局部用組合物，其中所述的酚類化合物選自簡單酚類化合物(C6)、苯醌類(C6)、酚酸類(C6-C1)、苯乙酮類(C6-C2)、苯基乙酸類(C6-C2)、羥基肉桂酸類(C6-C3)、苯基丙烯類(C6-C3)、香豆素類、異香豆素類(C6-C3)、色酮類(C6-C3)、焦油醌類(C6-C4)、咕噸酮類(C6-C1-C6)、芪類(C6-C2-C6)、類黃酮類(C6-C3-C6)、木酚素類、新木酚素(C3-C3)2和木質素(C6-C3)n
5.按照實施權利要求任一項的局部用組合物，其中所述的酚類化合物選自酚酸類混合物、類黃酮類混合物、異黃酮類混合物或其衍生物，或它們的混合物。
6.按照權利要求5的局部用組合物，其中所述翻兩番混合物是表棓兒茶素沒食子酸酯、柚皮素、槲皮素、兒茶素、黃豆苷原、染料木黃酮、lycetin、沒食子酸或綠茶多酚。
7.按照實施權利要求任一項的局部用組合物，其中所述的酚類化合物在該組合物的存在水平為0.01至10％(重量)。
8.按照實施權利要求任一項的局部用組合物，其中所述的組合物是免洗組合物。
9.一種提供至少一種選自下列的皮膚護理益處的美容方法處理/預防起皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；提高/維持皮膚中的膠原水平，提高/維持皮膚中的核心蛋白聚糖水平，增強組織的修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚的紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；控制油/皮脂的分泌；該方法包括將上述任一權利要求所述的局部用組合物涂敷在皮膚上。
10.權利要求1-8任一項所述的組合物在產(chǎn)生至少一種選自下列的化妝皮膚護理益處中的應用處理/預防起皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；提高/維持皮膚中的膠原水平，提高/維持皮膚中的核心蛋白聚糖水平，增強組織的修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚的紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；控制油/皮脂的分泌。
11.與酚類化合物或其混合物聯(lián)合的偶聯(lián)亞油酸和/或其衍生物在產(chǎn)生至少一種選自下列的化妝皮膚護理益處的化妝品局部用組合物中的應用，處理/預防起皺紋、下垂、干燥、老化和/或光損傷皮膚；提高/維持皮膚中的膠原水平，提高/維持皮膚中的核心蛋白聚糖水平，增強組織的修復；平撫刺激、紅色和/或敏感皮膚；改善皮膚的紋理、光滑度和/或堅固度；增亮皮膚；控制油/皮脂的分泌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種局部用組合物,含有(a)偶聯(lián)亞油酸和/或其衍生物;(b)酚類化合物或其混合物;和(c)皮膚可接受賦形劑;條件是所述的酚類化合物不是防曬劑。該皮膚護理組合物適于處理皺紋和平撫敏感皮膚。
文檔編號A61K8/365GK1376050SQ00813273
公開日2002年10月23日 申請日期2000年7月11日 優(yōu)先權日1999年7月30日
發(fā)明者K·E·巴雷特, M·R·格林, 胡恒龍, P·帕馬, J·R·鮑維, A·V·勞林斯 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司