專利名稱：治療方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過口粘膜大劑量投用干擾素刺激哺乳動物體內針對病理學條件的宿主防御機制的方法。具體地說，本發(fā)明可應用于自身免疫病、腫瘤疾病、神經性變性疾病、寄生蟲病和病毒病的治療方法。
本發(fā)明的背景技術α干擾素廣泛用于治療包括多毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、低級淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤在內的各種血液學惡性疾病，和包括腎細胞癌、黑色素瘤、癌樣腫瘤及與愛滋病相關的卡波西氏肉瘤在內的實體瘤(Gtutterman,J.U.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,199491:1198-1205)。通常在借助胃腸外給藥注射大劑量(往往是數百萬單位)的α干擾素(IFN-α)才能看到抗腫瘤作用。β干擾素(IFN-β)臨床上已被批準用于治療復發(fā)-緩解性多發(fā)硬化癥及慢性乙型和丙型病毒性肝炎。
α干擾素和β干擾素都是Ⅰ型干擾素。Ⅰ型干擾素是一大類天然存在的細胞因子，包括16個以上IFN-α子類、加上IFN-β和IFN-ω。Ⅰ型干擾素結合到單細胞表面受體上，刺激一系列復雜的信號轉導過程，最終導致抗病毒、抗增殖和其他免疫調節(jié)作用、細胞因子誘導作用，以及Ⅰ類和Ⅱ類HLA調節(jié)作用(Pestka等人，RevBiochem.,1987 56:727)。Ⅰ型IFN的各個亞型在活性上是不同的。借助掃描大量的IFN-α等位基因亞型已識別每個位置上最常觀察到的氨基酸，并已合成出具有共同序列的Ⅰ型合成干擾素(Alton等人，“干擾素系統(tǒng)的物生學”，E.de Maeyer and H.Schellekens eds.Elsevier(1983)1991-128)。這種共有干擾素可從市場購得(Infergen,Amgen,Ine.)，并且最近已證明它具有比IFN-α2a或IFN-α2b高的活性(w/w)；而且已有人提出共有IFN將在臨床上優(yōu)于各種天然亞型的IFN(Blatt等人，J.Interferon and Cyfokine Rsearch,1996 16:489-499)。
盡管有大量的給藥途徑(包括靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、局部注射和損傷部位內注射)通常用于Ⅰ型干擾素給藥，但因為干擾素是一種可被蛋白水解酶失活的蛋白質，并且在胃腸道內大多不能以其天然形式被吸收，所以一般不使用口服給藥途徑。確實有許多研究未能在口服給藥后在血液中檢測到干擾素(Canttll and Pyhala,J.Gen.Virol.,1973 20:99-104；Wills等人，H.IFN Res.,1984 4:399-409；Gilson at al,J.IFN Res.,1985 5:403-408)。
普遍認為，為了獲得最大治療效果應使用可能的高劑量的干擾素。雖然重組物的可用性意味著非常高的劑量水平是可行的，但在實踐中業(yè)已發(fā)現(xiàn)，干擾素用藥的副作用嚴重地限制了可以使用的干擾素劑量和持續(xù)治療時間。這些副作用包括嚴重的不適和抑郁，在某些病例中甚至導致自殺。Hoofnagle近年在New England Journal ofMedicine上總結了這些問題(Hoofnagle,J.H.,and Lau,D.,New Eng J.Medicine,1996 334:1470-1471)。對患有乙肝炎e抗原陽性的慢性乙型肝炎病人所作的α干擾素治療效果的meta分析顯示有25％至40％的緩解率，其中包括用每天5百萬單位(IU)或每周3次每次1千萬IU治療3至6個月的典型的慢性乙型肝炎病人。但這些結果都末達到治愈的目的，因為經聚合酶鏈反應試驗顯示，大多數病人仍為肝炎表面抗原陽性，并且?guī)в胁《綝NA。此外，這樣高劑量的干擾素很難忍受，有10％至40％的病人因不能耐受的副作用要求降低劑量。但是每天1百萬IU的可忍受劑量，緩解率只有17％(Perrillo等人，NewEng J.Medicine,1990,323:295-301)。在患有慢性丙型肝炎的病人中，長期維持的改善與HCV RNA有關，這種情況只發(fā)生在10-20％的采用每周3次3百萬單位的劑量治療了6個月的病人中(Hoofnagleand lau，文獻出處同上)。在患腫瘤的病人中，通常只有使用最高耐受劑量的α干擾素才能看到有意義的反應率。因此對于多發(fā)性骨髓瘤病人，在每天用2-3千萬國際單位治療的病人中反應率為50％，用3百萬IU臺療的病人反應率只有10-20％。但只有極少數病人能夠較長時期忍受大劑量治療(Alre等人，Ear.J.Hematol.,1998,41:123-130)。因此，在此領域中顯然需要一種能夠在不誘發(fā)嚴重副作用的情況下完成大劑量干擾素給藥的辦法。
迄今已有許多關于在治療各種病毒性疾病特別是在治療流感中作為鼻噴霧劑或口服液體配方給藥的小劑量干擾素的效力的軼事性報道。但在大多數報道中，所使用的干擾素制劑都是比較粗制的。用較高劑量鼻內干擾素治療鼻病毒感染的安慰劑對照試驗顯示治療是有效的，但副作用的發(fā)病率相當高(Hayden等人，J.Infect Dis.,1983,148:914-921)。同樣，雖然有許多包括隨機雙盲臨床試驗的研究(Douglas等人，New Engl.J.Med.,1986,314:65-80；Hayden等人，New Engl.J.Med.,1986,314:71-75)已經證明通過鼻飼給藥投用高劑量重組干擾素α2在抗鼻病毒感染中的效力，但這些研究并沒有提供有關全身作用的證據。
最近有一系列專利說明書描述了使用低劑量口服給藥的異種來源的干擾素治療家畜的感染性鼻氣管炎(“運輸熱”)，和貓白血病，以及治療其他一些病癥，以增強疫苗的效力、改善食物利用的效率、以及預防牛泰勒氏梨漿蟲病。分別參閱美國專利No.4,462,985、澳大利亞專利No.608519、澳大利專利No.583332和美國專利No.5,215,741。另外，美國專利No.5,017,371公開了按這種方式使用干擾素治療惡性腫瘤化療或放療后的副作用。在這些說明書中，所使用的干擾素都是按Cantell的方法制備的、加在磷酸鹽緩沖鹽水中以每磅體重0.01至5IU的劑量給藥的人α干擾素。雖然這些說明書中都提出經口咽粘膜并優(yōu)選以適合與口粘膜長時間接觸的方式完成如此低劑量的干擾素的給藥對于治療包括腫瘤在內的各種病理條件可能是有效的，但除了運輸熱、貓白血病、犬細小病毒感染和泰勒氏梨漿蟲以外的病理條件的實驗證據大都是軼事性的。具體地說，還沒有提出在任何動物模型中對人類腫瘤進行這種治療的適當的對照試驗。
已經有人對近年來有關通過口或口咽粘膜給藥的非常低劑量干擾素的效果的研究結果進行了綜述(Bocci,Clin.Pharmacokinet..1991,21:411-417；Critic.Reu.Therap.Drug Carrier Systems.1992,9:91-133；Cummins and Georgiades,Archiuum.Immun.Therap.Exp.,1993,41:169-172)。已有人提出這種類型的治療對于治療HIV感染是特別有用的，并且至少可以改善愛滋病患者的生存質量(Kaiser等人，AIDS,1992,6:563-569；Koech等人，Mol.Biol.Ther.,1990,2:91-95)。然而，其他一些報告指出這些治療并沒有提供臨床益處。也已有人報告了使用包含低劑量干擾素的含片治療乙型肝炎的階段Ⅰ的研究結果(Zeilinska等人，Archiv.Immunol.Therap.Exp.,1993.41:241-252)。
相反，Brigham和Women＇s Hospital的國際專利申請No.WO95/27499指出在充分認定的動物模型中，如果在誘導抗原之前以胃管法投用β干擾素，至少可部分地抑制如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化癥及自身免疫性關節(jié)炎等自身免疫病的發(fā)展。借助這種途經或腹腔內途徑與胃內“旁觀者”抗原結合給藥的β干擾素在誘導耐受性方面甚至更有效。這意味著β干擾素在提高口服耐受性的誘導作用中是有效的，而不是在誘導體液或細胞對外源性抗原的反應方面有效。
在澳大利亞臨時專利申請No.PN9765中，揭示了借助口粘膜途徑向口咽腔內給藥的低劑量干擾素在防止小鼠遭受高轉移性腫瘤細胞的攻擊方面是有效的。這些結果異乎尋常的特征，連同目前幾乎沒有物質對這些頗具侵害性的腫瘤呈現(xiàn)活性這一事實，都表明在治療癌癥時向口咽腔內投用干擾素是有用的。在治療向腹腔內注射腦心肌炎病毒(EMCV)(該病毒通常引起以牽連中樞神經系統(tǒng)和腦炎為特征的迅速惡化的致死性疾病)的小鼠時，經口粘膜給藥的低劑量干擾素也是有效的。雖然這個系統(tǒng)是非常嚴格的抗病毒活性試驗，但經口粘膜的干擾素給藥途徑與腹膜內給藥差不多同樣有效。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供一種通過口粘膜完成干擾素給藥刺激哺乳動物宿主防御機制的方法，其中給藥劑量高于胃腸道外給藥時引發(fā)病理學反應的劑量，即通常在人體內有高于大約20×106IU的均質干擾素-α。對于另一種類型的干擾素，誘發(fā)病理反應的劑量可能不同于均質干擾素α在人體內誘發(fā)這種反應的劑量。
一個方面，本發(fā)明可看作是一種通過口粘膜接觸給哺乳動物投用免疫刺激量的干擾素刺激哺乳動物體內免疫反應的方法，其中所述劑量超過胃腸道外給藥時同種干擾素誘發(fā)病理反應的劑量。
換言之，本發(fā)明提供一種借助經口粘膜完成干擾素給藥的提高干擾素治療指數的方法。
口粘膜給藥可能涉及以單一劑量完成干擾素有效劑量的給藥，或者在足以引發(fā)相當于單一劑量的免疫刺激作用的時間里以多次較小劑量完成有效劑量的給藥。類似地，可以在足以誘發(fā)相當于單一劑量的作用的時間里完成干擾素劑量的連續(xù)給藥。
在其應用方面，本發(fā)明借助口粘膜接觸將有效劑量的干擾素提供給哺乳動物治療自身免疫病、分枝桿菌病和神經性變性疾病、腫瘤條件及病毒感染方法，其中所述劑量超過胃腸道外給藥時同種干擾素誘發(fā)病理反應的劑量。具體地說，本發(fā)明提供治療關節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病、狼瘡和多發(fā)性硬化癥等自身免疫病、麻風和結核病等分枝桿菌病、海綿狀腦炎和Crelltzfeldt-Jakob病等神經性變性疾病、癥疾等寄生蟲病、以及宮頸癌、生殖器瘡疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1和HSV-2等病毒病的方法。
本發(fā)明還提供治療多發(fā)性骨髓瘤、多毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、低級淋巴病、皮膚T細胞淋巴瘤、癌樣腫瘤、宮頸癌、包括卡波西氏肉瘤在內的肉瘤、腎腫瘤、包括腎細胞癌、肝細胞癌、鼻咽癌、血癌、結腸直腸癌、成膠質細胞瘤、乳頭狀瘤、肺癌、結腸癌和惡性黑色素瘤在內的各種癌癥、以及包括惡性腦腫瘤在內的腦腫瘤的方法。在一個實施方案中，該方法通常可應用于治療非病毒病源學的腫瘤。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供適合口粘膜給藥的藥物組合物，該組合物包括治療有效劑量的至少一種干擾素和醫(yī)藥上可接受的載體，其中所述劑量超過胃腸道外給藥時引發(fā)病理反應的劑量?？梢宰鳛槿芤?、片劑、錠劑、凝膠、糖漿、軟膏或控釋口粘膜釋放系統(tǒng)提供該組合物。非必選的是該組合物可以包含緩沖劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、吸收促進劑和增粘劑等。
在一個實施方案中，藥物組合物是以含有大約20×106IU到大約1000×106IU干擾素、優(yōu)選大約20×106IU到大約500×106IU、最優(yōu)選大約50×106IU到大約500×106IU的單位劑量形式提供的。
該方法可以作為單獨的治療方法或作為放療、化療的輔助療法來實踐，或者用諸如白介素-2、-12或-15之類的細胞因子或干擾素誘導劑來實踐。
該方法優(yōu)選采用選自α-、β-、γ-、ω-和共有干擾素的Ⅰ型或Ⅱ型干擾素來完成，最優(yōu)選采用重組IFN-α。
本發(fā)明的詳細敘述現(xiàn)在將僅僅參照下面的定義和實施例詳細介紹本發(fā)明。文中提及的全部專利和出版物均特意并入，以供參考。定義本文使用的術語“干擾素”指的是Ⅰ型或Ⅱ擾素，包括通常以α、β、γ和ω命名的干擾素以及它們的混合物(包括共有序列)。干擾素可以通過各種商業(yè)渠道購買，并且已被批準用于治療許多主治病癥。干擾素可以來自天然資源，但優(yōu)選的是重組產品。就本發(fā)明的目的而言，術語“干擾素”還包括具有干擾素活性的多肽或其片段，以及在諸如美國專利第5,582,824、5,593,667和5,594,107號中公開的為了在不影響其生物活性性質的前提下提高穩(wěn)定性而引入序列修飾的干擾素的嵌合或突變形式。
本語“高劑量”意思是高于借助諸如靜脈或腹腔內之類的胃腸道外途徑給藥時通?？扇淌艿耐N干擾素的最大劑量。正象目前預計的那樣，對于70 kg重的成人，干擾素的高劑量是高于大約20×106IU的均質α干擾素。優(yōu)選的劑量是高于大約30×106IU。在本發(fā)明特別優(yōu)選的形式中，總劑量從大約50×106IU到大約1000×106IU，更優(yōu)選從大約50×106IU到500×106IU。本文所說的“高劑量”通常被看作是經口粘膜給藥時的治療有效劑量，該劑量如果經胃腸道外給藥將誘發(fā)病理反應，這種反應可由不可接受的副作用或毒性代用標志的出現(xiàn)來證實。高劑量的定義必然是靈活的，因為它可以依據病人的個體敏感性、身高、體重和年令、待治療病癥的性質及嚴重程度、所用的具體干擾素以及給藥的特殊載體而有所變化。用特定的干擾素為病人治療的醫(yī)生將能迅速地確定適合待治療的病人的高劑量范圍。
干擾素可以非必選地與干擾素合成與釋放的誘導劑同時給藥。誘導劑可以與干擾素一起給藥，也可以分開給藥。例如，干擾素的誘導劑包括諸如polyI:C之類的多核苷酸；優(yōu)先使用低分子量可口服給藥的干擾素誘導劑。適當的誘導劑在技術上是已知的，例如雙二乙氨乙基芴酮Tilorone(美國專利No.3,592,819；Albrecht等人，J.Med.Chem.,1974,17:1150-1156)和喹諾酮衍生物Imiguimcd(Savage等人，Brit.J.Cancer,1996 74:1482-1486)。
本發(fā)明的方法和組合物可以非必選地與一種或多種適合具體病癥的其它治療結合使用，而且醫(yī)生或獸醫(yī)將能夠迅速地選擇在該環(huán)境下適當的這類其它治療。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療哺乳動物腫瘤病的方法，該方法包括上述干擾素的給藥步驟。腫瘤病癥包括轉移性的癌。
盡管本發(fā)明的方法可以在沒有采用其他藥劑進行同時治療的情況下使用，但預期本發(fā)明的這個實施方案在下述情況下將是特別有用的(a)作為按標準方法進行外科手術、化學治療或放射治療后的輔助治療；
(b)用于治療對干擾素敏感的腫瘤，單獨利用或與常規(guī)的化療或放療結合使用本發(fā)明的方法；以及(c)用于治療抗干擾素的腫瘤，單獨利用、最優(yōu)選的是與常規(guī)的化療或放療結合使用本發(fā)明的方法。
上述方法的目的是誘導和/或維持緩解疾病?！芭c其他治療結合”意思是在進行放療或其他化學治療之前、期間和/或之后完成干擾素給藥。最適宜的方法將取決于下文討論的各種因素。
具體地說，預期本發(fā)明的方法將優(yōu)先與至少一種選自下列一組方法的治療結合使用，這組方法包括采用細胞生長抑制藥物、一種或多種具有抗腫瘤活性又具有不同于干擾素作用機理的細胞因子、抗血管生成劑以及增強干擾素活性的藥劑進行的化療。優(yōu)選的第二種細胞因子是白介素-1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素12(IL-12)或白介素15(IL-15)；優(yōu)選的血管生成抑制劑是AGM-1470；增強干擾素作用的處理優(yōu)選體溫升高或精氨酸丁酯。
優(yōu)選的準備與干擾素結合給藥的細胞生長抑制藥物包括但不只限于環(huán)磷酰胺、順式鉑氨、卡鉑、卡美斯汀(BCNU；N,N-雙(2-氯基乙)-N-亞硝基脈)、氨甲喋呤、亞德里亞霉素、α-二氟甲基烏氨酸和5-氟尿喀啶。
對這種方法敏感的腫瘤條件包括但不只限于對高劑量IFN-α胃腸道外給藥有反應的癌，例如血液惡性瘤、多發(fā)性骨髓瘤、多毛細胞白血病，或慢性骨髓性白血病、低級淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤；實體瘤，例如腎細胞癌和黑色素癌；類癌腫瘤；或與愛滋病有關的卡波西氏肉瘤，特別是非病毒病原性惡性腫瘤。病毒性病癥可以是急性或暴發(fā)性感染，如鼻病毒、流感、水痘瘡疹、帶狀瘡疹、登革熱；或病毒性腦炎，包括但不只限于麻診病毒腦炎、Marray Valley腦炎、日本乙型腦炎、森林腦炎和Herpes腦炎；出血熱，例如感染Ebola病毒、Marburg病毒、Lassa熱、Hanta病毒以及由動物傳播給人的其他病毒(如馬麻疹病毒感染)。其中許多病癥目前還沒有治療辦法和/或可利用的疫苗，而且支持療法可能是不適當的。另外，病毒病癥可能是慢性感染的結果，例如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎或其他類型病毒性肝炎，以及CMV、HIV、HPV以及HPVⅠ型和Ⅱ型感染。乙型肝炎和丙型肝炎目前都用干擾素經胃腸道外給藥治療；對于已發(fā)展成愛滋病的HIV感染的長期干擾素治療正在臨床試用之中。
在第二個實施方案中，待治療的疾病是瘧疾，而且Ⅰ型和Ⅱ型干擾素再次給藥。瘧疾的病原生物體可以是三日瘧原蟲、惡性瘧原蟲、卵形瘧原蟲。特別期待的是本發(fā)明的方法將阻止瘧疾向腦型瘧疾發(fā)展。
在第三個實施方案中，本發(fā)明提供治療自身免疫機能紊亂(例如復-緩解型或慢性進行性的HIV、類風濕性關節(jié)類及多發(fā)性硬化癥)或免疫缺陷(如愛滋病)的方法，其中包括上述的干擾素給藥步驟。
另外，本發(fā)明的方法和劑量形式可以與其他療法結合使用。例如，對于皰疹病毒感染，可以使用Acyclovir(阿若洛韋)或Ganciclovir(更昔洛)。對于HIV感染，可以使用疊氮胸苷(阿西夫定)或一種或多種其他HIV反轉錄酶抑制劑，和/或HIV蛋白酶抑制劑。
在本發(fā)明的藥物組合物制劑中，可以使用各種適合IFN的載體和賦形劑，對于本領域的技術人員這些是顯而易見的。在RemingtonThe Science and Practice of Phanrmacy(19th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995)及其以前的版本中闡述了有代表性的配制技術。在美國專利No.4,496,537中介紹的那樣，IFN配方可包括諸如甘氨酸或丙氨酸之類穩(wěn)定性增強劑，和/或的一種或多種載體(如載體蛋白質)。例如，為了治療人的疾病，可以將藥品級人血清白蛋白非必選地與作為稀釋劑的磷酸鹽緩沖鹽水一起使用。在IFN的賦形劑是人血清蛋白的場合，人血清蛋白可以得自人血清，也可以是重組源的。在使用血清蛋白時，血清蛋白通常是均質源的。
可以借助任何使IFN與受體的口粘膜腔接觸的方法完成IFN的給藥。因此，應當明確地理解，本發(fā)明不限于任何具體類型的的配方。本說明書描述深入口粘膜腔完成IFN給藥；這可以用液體、固體、或氣溶膠、以及滴鼻或噴霧來實現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括但不限于液體、噴霧劑、糖漿、錠劑、含片和噴霧劑配方。熟悉此項技術的人將承認對于氣溶膠或噴霧劑配方，制劑的粒度可能很重要的，并將知道適當的粒度調整方法。
一個方面，干擾素以單次量給藥。另一方面，干擾素以多次低劑量分布在一段時間內給藥，以使總效應相當于較高的單次量給藥。實現(xiàn)這種給藥方式的一種途徑是提供一種附著在或植入到口粘膜腔中能持續(xù)或受控釋放干擾素的裝置，而且該裝置是為了在一段時間內釋放相當于較高的單次量的量的干擾素而設計的。
適合口粘膜使用的有代表性的干擾素配方包括下述配方(所有的百分比均為重量百分比)片劑右旋糖BP 45％；白明膠BP 30％；小麥淀粉BP11％；羧甲纖維素鈉BP5％；卵白蛋白BPC4％；亮氨酸3％；丙二醇BP 2％；和50×106IUIFN-α2。該片劑可以原樣使用并允許在嘴里緩慢地溶解，也可以溶解在水中并在需要時含在嘴中保持與口粘膜接觸。
干擾素軟膏可以象在美國專利No.4,615,184中介紹的那樣由甘油45％、羧甲纖維素鈉2％、檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)25％、加至100％的蒸餾水和50×106IU IFN-α2來制備。干擾素軟膏可粘附在口頰粘膜上。
同樣，將所需劑量的干擾素加到市售的嗽口液或止咳糖漿配方中就可以制備嗽液或糖漿。
在上文提到的特定劑量范圍內，任何個體病例的最佳治療劑量取決于所涉及病癥的性質、疾病的階段、以前的治療情況、其他正在繼續(xù)的治療、哺乳動物的一般健康狀況、治療對象對干擾素的敏感性等因素，所以，該劑量任憑醫(yī)生或獸醫(yī)考慮所有這些情況后所作的決斷。療程長短將隨被治療的病情而異，例如，治療緩慢生長的癌(如前列腺癌)可能涉及與快速生長的癌(如肝細胞癌)不同的療程。類似地，急性感染(如由Ebola病毒引起的感染)可能涉及與慢性感染(例如肝炎)不同的療程。
文中揭示的有效劑量是經胃腸道外給藥時在哺乳動物體內可以產生病理反應的劑量，而且在經口粘膜給藥時既有效又無毒或低毒。病理反應可以是急性的、慢性的或累積性的，并可以通過血液化學的變化(例如白細胞減少、骨髓機能減退)或其他組織學參數得到證實。文中所用的術語“病理反應”包括諸如發(fā)燒、不適、類似流感的癥狀之類不良的副作用；諸如靜脈炎之類的血管反應；以及注射部位的局部炎性反應。從個體對干擾素敏感性的差異上看，這些反應在病人群體中將有相當大的變化。
對于許多病人，口粘膜給藥劑量超過按已批準的胃腸道外給藥方法準備耐受的已知劑量是完全可能的。在一個實施方案中、總劑量可以在一段時間內以多次低劑量完成給藥，甚至或可以從附著到或植入到口粘膜上的控釋裝置連續(xù)地或以脈動方式給藥。干擾素和干擾素配方小鼠IFN-α/β小鼠干擾素-α/β(Mu IFN-α/β)是由新域病病毒(NDV)誘導的C243-3細胞的培養(yǎng)基制備的并按以前介紹的方法提純(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.,1974,146:809-815)。在象前面的介紹(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.,1974，146:809-815)那樣，在受皰疹口腔炎病毒(VSV)攻擊的小鼠929細胞上檢測時，這項研究中使用的制劑具有4×106國際單位(IU)/ml的滴度和5×107IU/mg蛋白質的比活性。對照美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)的鼠性IFN-α/β國際基準制劑(G-002-9004-5411)對該制劑進行標準化處理。
人體干擾素-α-1-8象以前介紹的那樣(Meister等人，J.Gen.Virol.,1986,67:1633-1643)，制備和純化重組的人體干擾素-α1-8(HuIFN-α1-8；BDBBlot no.CGP 35269-1,Ciba Geigy,Basel,Switzerland)。象以前介紹的那樣(Tovey等人，Nature,1977 267:455-457)，這項研究所用的制劑在受VSV攻擊的均質的人體WISH細胞上具有70×106IU/ml的滴度，而且在異質的鼠L929細胞上有1×106IU/ml的滴度。對照NIH人體IFN-α國際基準制劑(G-023-901-527)和NIH鼠IFN-α/β標準(G-002-9004-5411)兩者完成該制劑的標準化。該IFN制劑的比活性為2×108IU/mg蛋白質。
重組的鼠干擾素-α重組的鼠干擾素-α購自Life Technologies公司。這項研究所用的制劑(批號HKK404)在受VSV攻擊的鼠L929細胞上檢測(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)時具有6×106IU/ml的滴度和6×108IU/mg蛋白質的比活性。
重組的鼠干擾素-β重組的鼠干擾素-β購自R&D Systems公司。這項研究所用的制劑(批號1976-01S)在受VSV攻擊的鼠L929細胞上檢測(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)時具有3.2×104IU/ml的滴度和8×106IU/mg蛋白質的比活性。
重組的鼠干擾素-γ重組的鼠干擾素-γ購自R&D Sysyems公司。這項研究所用的制劑(2580-03SA)在受VSV攻擊的鼠L929細胞上檢測(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Mled.,1974,146:406-415)時具有2×105IU/ml的滴度和1×107IU/mg蛋白質的比活性。
所有的干擾素制劑在同一試驗中同時滴定，并對照美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)的鼠干擾素α/β國際基準制劑(G-002-9004-5411)進行標準化處理。
小鼠干擾素α/β和重組小鼠干擾素兩者均在給藥前用FerimmuneTM賦形劑重新配制。賦形劑干擾素制劑將用包含牛血清蛋白質(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或下述的專有賦形劑進行稀釋。將牛血清血蛋白餾份V(RIA級，無疫球蛋白；藥品批號A7888；Sigma,VSA)以100μg/ml的最終濃度溶解在PBS(pH7.4)中并借助過濾(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA)除菌。
在本文所述的實驗中，用專有賦形劑稀釋干擾素制劑。所用的賦形劑是以片劑形式(Ferimmune harma,Pacific)供應的下述賦形劑
**在無水基礎上計算的***推導自右旋糖(葡萄糖)BP(無水的) 44.46％葡萄糖BP(作為葡聚糖40注射劑) 0.03％將一片溶解于1.5ml磷酸鹽緩沖鹽水中，以16,000g離心15分鐘，然后無菌過濾(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA)，并在使用前在4℃下貯存。每天使用前制備賦形劑。干擾素遞送系統(tǒng)初步的實驗結果表明用P20 Eppendorf微量移液管將5μl結晶紫施加到正常成年小鼠的每個鼻孔中，這將導致染料幾乎立即分布到口咽腔的整個表面上。在施加染料后約30分鐘，口咽腔的著染仍很明顯。采用同樣方式施加帶125I-標記的重組干擾素α1-8，獲得基本上相似的結果。所以，這種給藥方法被用在所有的后續(xù)實驗中。
就本說明書中介紹的動物實驗目的而言，人們將會清楚地理解，有關IFN給藥途徑的表述“口粘膜”或“口咽”或“鼻內/口”或“鼻內加口”或“in/or”都是指深入鼻腔的IFN制劑給藥，以使它迅速分布到口粘膜腔內，即受體動物的口和咽部內，以便與該腔的粘膜襯接觸。EMCV(腦心肌炎病毒)分比比號095001截止日期1997年12月制備使用以前描述的方法(Gresser I.Bourali C,Thomas MT,Falcoff E.重復接種干擾素制劑對感染腦心肌炎病毒的小鼠的影響，Pro Soc Exp.Biol Med.,1968年2月，127:491-6)在小鼠L929的細胞上增殖EMCV毒株JH。
特征這項研究所用的病毒原液在小鼠L929細胞上的滴度為5×108.62TCID50。
貯存在-70℃貯存EMCV原液。在病毒滴定的第1天斷電，被迫暫時轉移到溫度近似相同的備用庫。材料始終保持凍結狀態(tài)。在病毒滴定的第8天，將-70℃的冰箱溫度升至-60℃。即將使用前制備稀釋的EMCV，并存放在冰上或動物室冰箱內備用。Friend紅白血病細胞E.Affabris,Rome博士獲得了Friend紅白血病細胞(FLC)的抗IFN-α/β克隆3C18，并且作了詳細介紹(Virology,1982,120:441-452)。借助活體內繼代移種法保留這些細胞。簡單地說，借助腹膜內注射(ip)給DBA/2小鼠接種大約100LD50的3C18細胞，一周后從小鼠腹腔中收獲腫瘤細胞并計數，然后再次用100LD50的3C18細胞給其他小鼠接種。用這種方法重復繼代移種60至100次。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在第60至第100次活體內繼代移種所用的3C18細胞對肝和脾臟具有高轉移性(Gresser等人，Int.J.Cancer,1987,39:789-792)。在有IFN-α/β存在的條件下活體外培養(yǎng)活體內繼代移種的細胞證實了抗干擾素性的表型(Belardell等人，Int.J.Caner,1982 30:813-820)。L1210R6克隆&EL4可移植的腫瘤L1210淋巴瘤細胞的抗干擾素-α/β克隆L1210R6是在我們的實驗室分離的(Gresser等人，1974，干擾素和細胞分裂，Ⅸ.抗干擾素的L1210細胞特征和來源，J.Nat.Cancer Inst.,52:553-559)。
EL4可移植性腫瘤最初來源于接種化學致瘤劑1-2二甲基苯并蒽的小鼠(Gorer,P.A.,1950,Br.J.Cancer,4:372-381)。
借助用無特異病原體的DBA/2小鼠進行一系列活體內繼代移種保留L1210淋巴瘤細胞。
借助用無特異病原體的C57BL/6小鼠進行活體內繼代移種維持EL4腫瘤。B16黑色素瘤B16黑色素瘤是源于C57BL/6小鼠自發(fā)來源的可移植性腫瘤(Fidler I.J.and Kriple,M.L.,1977,Science 197:893-897)。B16黑色素瘤是一種迅速生長的、高度退行發(fā)育的，主要向肺轉移的黑色素生成的腫瘤。一般認為B16黑色素瘤迅速生長的，有高度攻擊性的人類腫瘤核型。
B16黑色素瘤細胞在無特異病原體的C57BL/6小鼠體內靠-系列繼代移種維持的。動物在這項研究中所用的小鼠是從無特異病原體的群體(IFFACREDO,France)獲得的。這些小鼠按照EEC標準圈養(yǎng)在無特異病原體的動物試驗室內(位于Institut Federatif CNRS,Villejuif)。干擾素的生物檢定按照常規(guī)方法檢定干擾素。簡單地說，樣品(20μl)用80μl包含2％熱滅活的胎牛血清(FCS)(Gibco,France)的Eagle氏極限基本培養(yǎng)基MEM(Gibco,France)稀釋，并且用多道移液管(Finnpipette,Labsystem,50-300ml)添加到微量滴定板(Falcon，批號3072)的每個孔中。將WISH或L929細胞(2×104細胞/孔)添加到包含2％FCS的100μl MEN中并在含5％CO2的空氣氣氛(Forma 3029 CO2孵箱)中在37℃下孵化過夜。然后用裝有10倍物鏡的OlympusIM GLDW倒置顯然微鏡檢查細胞的毒性征象。然后，從1∶10稀釋開始以包含2％FCS的總體積為200μl的Eagle氏MEM對未呈現(xiàn)可檢出毒性的樣品進行連續(xù)的加倍稀釋，其方法是用多道移液管將100μl稀釋材料歸入每孔包含100μl新鮮的含2％FCS的Eagle氏MEM的微板上。同時還制備NIH人IFN-α的參考標準(G-023-901-527)或NIH Mu IFN-α/β的參考標準(G-002-9004-5411)的適當的連續(xù)加倍稀釋液。然后，在適當的環(huán)境中用100ml包含2％FCS的Eagle氏MEM將WISH或L929細胞(2×104細胞/孔)添加到每塊板上，并在含有5％CO2的空氣環(huán)境中在37℃下保溫過夜。然后檢查細胞單層的毒性征象并且沒有任何顯著的毒性，將培養(yǎng)物抽吸出來并用200μl含有2％FCS和100 TCID50的VSV(WISH細胞為2×10-4VSV23，或L929細胞為10-5VSV23)的Eagle氏MEM替代。然后，將這些板在包含5％CO2的空氣氣氛中在37℃下保溫過夜。然后，用OlympusIM VLWD倒置顯微鏡檢查細胞單層有無特異病毒的細胞病變作用。干擾素的滴度是由給出50％抗特異病毒細胞病變效應的稀釋度的倒數確定的，并且以國際參考單位/毫升(IU/ml)表示。實施例1用EMCV(腦心肌炎病毒)致死性攻擊反高劑量干擾素對存活率的影響用注射了致死量的EMCV的雄性和雌性小鼠試驗經口粘膜途徑完成1,000、10,000、100,000IU的IFN-α給藥效果。試驗不同類型的IFN-α，并且將口粘膜途徑給藥的效果與經腹腔(ip)途徑給藥的效果進行比較。除了在致死性攻擊后監(jiān)測存活率外，還使用各種臨床化學和血液學參數監(jiān)測IFN療法的毒性。
在病毒感染后開始經口粘膜途徑用105IU的IFN-α給小鼠進行治療，每天一次治療4天，結果所有的動物都得到完全保護。經IFN治療的動物全部存活，而且在未經治療的感染病毒的對照組動物到第7天全部死亡的條件下，在感染致死劑量的EMCV(100LD50)后存活100天。
按體重計算，經口粘膜途徑用105IU治療小鼠相當于人的劑量為240×106IU，據我們所知，這個劑量遠遠大于人的實際用藥劑量。
因為用105IU的IFN-α經in/or途徑治療小鼠產生比用104IU IFN-α治療動物可產生更大程度的保護作用，所以用更高劑量的IFN-α可能會獲得更大的效果(對抗更大的病毒或腫瘤負荷)。迄今為止，我們尚未在劑量-反應曲線中觀察到任何平臺指征。
我們的結果還證明，以in/or途徑給藥的超高劑量的IFN具有高度保護性抗病毒作用，并且以這種途徑給藥的105IU IFN-α可完全抵御所用劑量的EMCV。盡管事實上按體重計算所用劑量遠遠高于對人的給藥劑量(相當于240×106IU)，但并沒有觀察到臨床的、生物化學的或血液學的毒性證據。相反，在臨床實踐中經胃腸道外給藥的IFN最大耐受劑量是在每天20-30×106IU范圍內。實施例2高劑量IFN-α對受高轉移性腫瘤細胞攻擊的小鼠的影響第0天，用105個抗干擾素克隆3C18的Friend紅白血病細胞或105個L1210淋巴瘤細胞(抗干擾素的L1210R細胞)靜脈內攻擊每組10只6周令的DBA/2小鼠。接種后，這些小鼠一部分保留不作治療，另一部分經in/or途徑進行治療，每天治療兩次，治療20天，其中一部分用加在10μl賦形劑中的105IU小鼠IFN-α/β，另一部分單獨采用10μl賦形劑(對照組)。
50％經in/or途徑用IFN治療的動物存活，而且在接種高轉移性Friend紅白血病細胞后存活100天以上。30％經in/or途徑用IFN臺療的動物存活，并且在用L1210淋巴瘤細胞攻擊后存活100天以上。臨床觀察提示，如果不殺死動物，所有經IFN治療存活100天的動物具有正常的壽命。對器官的組織學檢查表明不存在殘留的腫瘤。相反，所有未治療動物和對照組動物分別在受Friend紅白血病細胞攻擊后的第13天死亡或在受L1210淋巴瘤細胞攻擊后的第14天死亡。
這些結果是特別有意義的，因為這兩種腫瘤細胞都是有高度攻擊性的，而且所用的攻擊劑量相當于LD50的大約20,000倍。此外，F(xiàn)riend白血病和LR10淋巴瘤是完全不同的腫瘤類型，其中Friend白血病細胞攜帶一種反錄病毒即Friend白血病病毒，而L1210淋巴瘤則與任何已知病毒病原學無關。用in/or IFN-α治療已接種L1210淋巴瘤的動物所得到的結果似乎等于甚或優(yōu)于在該模型中用IFN-α系統(tǒng)治療所得到的結果(I.Gresser，來公布的結果)。在我們的澳大利亞臨時專利申請No PN 9765中所報導的我們以前的研究中，接種了Friend白血病細胞并用100或1,000IU的IFN-α治療的小鼠無一存活，而且以10,000 IU的劑量治療只有10-20％的動物被認為是被治愈的。實施例3高劑量IFN-α對受高轉移性B16黑色素瘤細胞或EL4腫瘤細胞攻擊的小鼠的影響用105個B16黑色素瘤細胞或105個EL4腫瘤細胞靜脈內攻擊每組10只6周令的C57B1/6小鼠。接種后，這些小鼠一部分留下不作治療，另一部分經in/or途徑進行治療，每天治療兩次，治療20天，其中一部分用加在10μl賦形劑中的105IU小鼠IFN-α/β而另一部分單獨采用10μl賦形劑(對照組)。
30％經in/or途徑用IFN治療的動物存活，而且在接種高轉移性B16黑色素瘤細胞或EL4腫瘤細胞之后存活100天以上。相反，未經治療的動物和對照組動物則分別在受B16黑色素瘤細胞攻擊后第20天和在受L4腫瘤細胞攻擊后第22天死亡。臨床觀察提示，即使在第20天時停止干擾素治療，如果不殺死動物，在第100天還活著的所有經過IFN治療的動物仍將存活下去。對器管的組織學檢查表明，在第100天殺死的經干擾素治療的動物體內沒有殘留的腫瘤。實施例4口粘膜給藥的干擾素對抗皰疹口腔炎病毒的效果用10μl體積100 LD50的瘡疹性口腔炎病毒(VSV)(tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1974,146:406-415)鼻內感染來自無特異病原體繁殖群體的數組10只6周令小鼠。病毒感染后幾小時一部分小鼠留下不作治療，另一部分經鼻內/口途徑進行治療，每天1次，治療4天，其中一部分用加在10μlFerimmune賦形劑中的給定劑量的干擾素α/β進行治療，而另一部分只用10μl Ferimmune賦形劑(對照組)。
用鼠干擾素α/β治療成年鼠導致受致死劑量VSV感染的動物存活的百分率顯著提高。因此，在未治療的或只用賦形劑進行對照治療的受病毒感染的動物在第10天死亡的條件下，30％經10,000 IU干擾素α/β治療的動物在感染致死量的VSV后的第21天仍存活。臨床觀察提示，大多數經干擾素治療在第21天還活著的動物將繼續(xù)存活。實施例5口粘膜給藥的干擾素對細胞的蛋白質表達式的影響已知IFN-α在將蛋白質與其細胞表面受體結合后誘導許多細胞的蛋白質表達式。有人認為這些蛋白質提供有用的IFN作用標志。
我們評價了通過in/or途徑給藥的IFN對三種IFN誘導的蛋白質(即I類MHC抗原、LY 6A/E抗原和2’-5’-寡腺苷酸合成酶)表達式的影響。
在經腹腔給藥僅20 IU MuIFN-α就在外圍血液單核細胞和粒細胞上顯著增加H-2-Kd抗原表達式的條件下，經in/or途徑用高達20,000IU的MuIFN-α治療DBA/2小鼠(H-2Kd)并不顯著地增加外圍血液淋巴細胞、單核細胞或粒細胞上的H-2-Kd表達式。單核細胞上的表達式確實略微受到抑制。
同樣，通過in/or途徑用高達20.000IU的Mu IFN-α治療小鼠對Ly6A/E抗原的表達式沒有顯著的影響，而該抗原表達式在經胃腸道外途徑用Ⅰ型IFN治療后在各種淋巴樣細胞的表面上被顯著增強(Damout等人，J.Immunol.,1986,137:201-210)。通過in/or途徑用200或20,000 IU的Mu IFN-α或Hu IFN-α1-8獲得相似的結果。
用只有20 IU的Mu IFN-α經腹腔注射治療Swisss小鼠或DBA/2小鼠，結果是在外圍血液單核細胞或脾細胞兩者中2＇-5＇-寡腺苷酸合成酶的活性顯著增加。相反，在同一實驗中通過in/or途徑用高達20,000IU的Mu IFN-α治療小鼠沒有顯著地增加2＇-5＇-寡腺苷酸合成酶活性的表達式。另外，經in/or途徑用200或20,000IU的Mu IFN-α或MU IFN-α1-8進行治療在開始IFN治療后長達10天的時間里任何時候對2＇-5＇-寡腺苷酸合成酶的活性都沒有顯著影響。實施例6口粘膜給藥后干擾素的生物利用率為了檢驗IFN的生物利用率和藥物動力學，用125Ⅰ可能標識到最高比放射性的高單次劑量重組IFN-α來治療藥物-血液體積比最有利于這些研究的小鼠。
將70×106IU Hu IFN-α1-8的純制劑重新溶解在1.4ml的PBS中，并且象Mogensen等人介紹的那樣(Int.T.Cancer,1981,28:575-582)采用Hunter和Greenwood介紹的改良氯胺T法(Nature,1962,194:495-496)進行碘處理。
125I標記的HuIFN-α1-8(批號CGP35269-1)在受VSV攻擊的人體WISH細胞上檢測時呈現(xiàn)2×107IU/ml的生物學活性，而在受VSV攻擊的小鼠L929細胞上檢測時呈現(xiàn)1×106IU/ml的生物學活性。
6至7周令的雌性Swiss鼠用相當于1×106鼠IU的2×107IU125IHuIFN-α1-8(1.0369×107cpm/小鼠)經iv、ip注射或經in/or途徑治療。在指定的時間點，每組殺死3只鼠，收集血液并確定體積。分離并收集動物的腎、肝、肺、脾和胃/食管，打上印跡，并稱重，精確到±0.1μg。利用γ-計數器分別確定每個樣品的放射性。然后，借助離心(800g×10分鐘，4℃)分離全血，收獲血清，記數并在-80℃下冷凍。然后，如上所述利用標準的生物檢定法在人體WISH細胞和小鼠L929細胞上檢測血清的IFN含量。然后，借助親和層析法分離存在于血清樣品中的放射性物質，并借助SDS-PAGE法進行分析。
在每只鼠靜脈注射1.0369×107cpm帶125I標記的Hu IFN-α1-8之后5分鐘，在動物的外圍血液中檢測到非常高水平的放射性(＞2×106cpm/ml)。在第15分鐘和30分鐘，存在于全血中的放射性兩逐步降低。腹腔注射1.0369×107cpm的125I HU IFN-α1-8之后5分鐘，在動物的外圍血液中檢測到的放射性的水平大約比靜脈注射后檢測到的低20倍。在注射后第15和30分鐘的放射性水平逐步增加。在經in/or途徑完成125IIFN-α1-8給藥后第5、10或15分鐘在動物血液中檢測到的放射性水平顯著低于在腹腔注射相同劑量帶放射標記的IFN之后的給定時刻經定時間檢測到的放射性水平。就所有三種給藥途徑而言，經in/or完成帶125I標記的IFN-α1-8給藥后，在血清中檢測到的放射性水平比在全血中檢測到的高。與同樣體積的血清相比，每毫升全血中檢測到的放射性水平較低反映出在去掉全血中細胞成分之后計數的血清有效體積較大。
采用上述的標準生物檢定法檢測研究中所有的小鼠血清樣品以確定有生物活性的IFN存在，結果表明在所有試驗的時間點上，靜脈或腹腔注射125I Mu IFN-α1-8的所有動物的血清中都有容易檢測的有生物活性的IFN。反之，在經in/or途徑完成IFN給藥后在任何試驗的時間點在所有動物的血清中都沒有檢測到帶生物活性的IFN，盡管在這些動物的血清中有較高水平的放射性存在。
為了確定在經125I Mu IFN-α1-8治療的動物血清中檢測到的放射性物質是否確實代表天然IFN，樣品用蛋白質A-G瓊脂糖進行免疫沉淀，以便將存在于樣品中的免疫球蛋白沉淀出來，用親和純化的多克隆抗干擾素-α的抗體處理后再次進行免疫沉淀。然后，對樣品進行上述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
對靜脈或腹腔注射125I MU IFN-α1-8后血清中放射性物質進行的SDS-PAGE分析揭示出一條均勻的遷移帶，其中電泳遷移率與未注射125I MU IFN-α1-8的完全一致。估計該物質的表現(xiàn)分子量約為20000道爾頓，它與天然的HuIFN-α1-8的分子量完全相符。完全相符。反之，來自經in/or用125I MuIFN-α1-8治療的小鼠的血清樣品無一包含任何表觀分子量與天然IFN的分子量相似的物質，既使在每個凝膠上加入完全相同量的放射性物質。
帶放射標記物質的組織分布揭示在靜脈注射125I Mu IFN-α1-8后5分鐘，動物的腎臟中有非常高水平的放射性，在肝、肺和脾臟中也有高水平的放射性。隨后發(fā)現(xiàn)存在于這四個器官中的放射性水平在15和30分鐘逐漸降低。相反，在15和30分鐘時，胃中的放射性水平逐漸增高，達到與靜脈注射后30分鐘時動物血清中存在的放射性差不多的水平。
借助腹腔注射完成125I Mu IFN-α1-8給藥導致在15分鐘內受檢的所有組織中放射性均達到峰值水平，接下來在第30分鐘降低。類似地，經in/or途徑完成125I Hu IFN-α1-8給藥導致在15分鐘后被研究的所有組織中的放射性均達到峰值水平，30分鐘時存在的放射性水平有些下降。經in/or途徑完成125I Hu IFN-α1-8給藥后存在于胃/食管中的放射性水平比在任何其他器官中檢測到的水平高一個數量級，而且顯著高于借助靜脈或腹腔途徑完成同樣劑量的帶放射標記的Hu IFN-α1-8給藥后存在于這些組織中的放射性水平。實驗例7經鼻內/口給藥后干擾素的藥物動力學為了準確地測定HuIFN-α1-8的藥物動力學，以每只小鼠1.0369×107cpm的劑量用125I HUIFN-α1-8經iv、ip或in/or途徑給小鼠治療，并在24小時期間內的一系列時間點測定在全血和血清中存在的放射性水平。
靜脈注射后存在于小鼠血液中的125I標記的Hu IFN-α1-8的藥物動力學曲線十分接近對數清除曲線。這個結果與以前利用密切相關的分子(即重組人αA/D(Bg1))進行的小鼠研究(Bohoslawed等人；J.IFN Res.,1986,6:207-213)的結果相符。根據濃度時間曲線下的面積計算出的生物可利用物質的量也與人αA/D的那個量相似。靜脈注射125I HU IFN-α1-8后觀察雙相對程清除曲線(其為通過腎臟清除的物質的特征)，結果與實施例6的結果一致。腹腔注射后，帶125I標記的IFN-α1-8的藥物動力學與以前報導的肌肉注射IFN的結果十分相似。
靜脈或腹腔注射帶125I標記的IFN-α1-8后，在所有動物的血清中存在很容易檢測到的有生物活性的IFN。
1、抗腫瘤活性的討論因為Friend紅白血病細胞(FLC)在靜脈注射后對肝和脾臟都表現(xiàn)出很高的惡性程度和轉移性，所以Friend紅白血病模型構成非常嚴格的抗腫瘤活性臨床前試驗。使用該模型得到的結果確實是采用胃腸道外途徑注射IFN-α治療人類腫瘤的基礎。因此，在這項研究進行的全部試驗中，所有末經治療的和用對照制劑治療的動物均在10至11天死亡。如果不作治療，僅僅注射4或5個FLC細胞就會殺死小鼠。相反，某些經口粘膜途徑用鼠IFN-α治療的動物在接種105個FLC后仍然存貨100天以上，并且可以認為它們已被治愈。
的確，根據以前的工作判斷，經口粘膜途徑給藥的IFN-α似乎比經胃腸道外給藥的環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤更為有效，后一途徑僅使注射FLC的動物存活時間增加幾天(Gresser等人，J.Natl.CanerInst.,1988,80:126-131)。順式鉑氨、長春花新堿、阿霉素、博來霉素或表鬼臼毒吡喃葡糖苷等其他藥物則對這種腫瘤無效(Gresser等人，J.Natl.Caner Inst.,1988,80:126-131)。
同樣，經口粘膜途徑給藥的IFN-α在抗FLC方面似乎比全身給藥的IL-1β、IL-2和INF-α等其他細胞因子更為有效，這些細胞因子在該模型中只表現(xiàn)出很小的活性。
以前的工作已顯示，在該模型中胃腸道外給藥的IFN是最有活力的抗腫瘤藥物之一，而且即使腫瘤已經轉移到肝中才開始IFN臺療也是有效的(Gresser等人；Intl.J.Caner,1987,39:789-792)。目前的結果表明IFN經口粘膜途徑給藥同樣甚至更有效。
在淋巴瘤確診后開始治療時，每天IFN-α與單次劑量的環(huán)磷酰胺一起注射與單獨用其中任何一種藥劑治療的動物相比顯著地增加了患淋巴瘤的AKR小鼠的存活期(Gresser等人；Eur.J.Cancer,1978,14:97-99)。在各種臨床前動物腫瘤模型中也已報導了成功地用IFN-αZβ和BCNU、順式鉑氨(cis-DDP)、氨甲喋呤、阿霉素和α-二氟甲基烏氨酸進行聯(lián)合治療。還報導了采用5-氟尿嘧啶(5-FV)和IFN的聯(lián)合療法在治療轉移性結腸癌時是十分有益的(Ernstoff等人；Journal of Clinical Oncology,1989,7:1764-1765)。然而，其他一些已報導的研究則顯示當IFN治療與環(huán)磷酰胺(Marguet等人，Int,J.Cancer,1983,31:223-226；Lee等人，Biochern.Pharmacol.,1984 33:4339-3443)、阿霉素(Blackwill等人，Cancer Res.,1984 44:904-908)或5-FU(Marquet等人，1985 109:156-158)，即那些已證明與胃腸道外IFN臺療聯(lián)合使用可發(fā)揮有利作用的藥物結合反而降低了抗腫瘤活性。使用本文描述的方法可以很容易地試驗出IFN與其他化學療法的組合。
白介素-1(IL-1)與IFN α/B結合的療法對注射了FLC的小鼠可產生協(xié)同抗腫瘤效果(Belardell等人，Im.J.Cancer,1991 49:274-278)。同樣的療法對Eb淋巴瘤地轉移性變體(p11-R-Eb)也發(fā)揮顯著的抗腫瘤效果，而單獨使用其中任何一種藥劑都沒有效果(Gabriele等人，Invasion Metastasis,1993 13:147-162)。在所有受試的細胞因子中，已發(fā)現(xiàn)IL-1在與Ⅰ型IFN胃腸道外給藥治療結合時是最有效的。
將血管生成抑制劑AGM-1470[(氯乙酰)-氨基酸(3R-(3α,4α(2R*,3R*),5β,6β))-5-甲氧基-4-(2-甲基-3-(3-甲氧基-2-丁基)環(huán)氧乙基-1-氧雜螺(2,5)辛-6-基脂]與IFN-α/β一起給藥的聯(lián)合療法與單獨用其中任何一種藥劑的療法相比顯著地增加了抗腫瘤效果(Brem等人，J.Pediatric Surgery,1993 28:1253-1257)。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，高體溫將提高IFN-α/β對Lewis肺癌的抗腫瘤作用(yerushalmi等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1982 169:413-415)。精氨酸丁脂也已表明可增強IFN-α的抗腫瘤作用(Chany and Cerutti,Int,J.Cancer,1982 30:489-493)。對于給定類型和劑量的IFN比較經口粘膜途徑給藥與系統(tǒng)給藥(靜脈注射)兩者所獲得的保護程度，結果表明在某些病例中IFN經胃腸道外給藥比口粘膜給藥或多或少地更有效一些，而在另一些病例中則不然。
2、抗病毒活性的討論雖然在經in/or途徑完成125IIFN-α1-8、MuIFN-α/β和MuIFN-α給藥之后不能在動物的血清中檢測到抗病毒活性，但仍可在這些動物中觀察到對抗致死量EMCV感染的統(tǒng)計學上有意義的保護作用(表1)。
我們在明確定義的急性病毒感染的臨床前模型中所獲得的結果提供明確的證據，以支持將高劑量口粘膜IFN治療用于人全身性病毒急性感染的“原理的驗證”，并且表明在這個模型中多種IFN-α子型的天然混合物和單一重組的IFN-α異型(如Mu IFN-α)兩者都發(fā)揮統(tǒng)計學上有意義的抗病毒活性。天然的Mu IFN-α/β和HuIFN-α1-8經口粘膜給藥時似乎是同等有效的。重組MuIFN-β和MuIFN-γ也顯示有相似的抗病毒活性。
將經口粘膜途徑完成給定類型和劑量的IFN給藥時所得到保護程度與全身給藥(腹腔注射)后所得到的結果相比較，結果表明在某些病例中IFN經胃腸道外給藥在某種程度上比經口粘膜給藥更有效，而在其他病例中則不然。
表1用125I-IFN-α單一治療對注射EMCv的Swiss小鼠存活率的影響
表2用MuIFN-α單一治療(每天一次治療4天)對注射FMCV的Swiss小鼠存活率的影響
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3．一般性討論生物標志試驗研究的結果非常清楚地表明三種受試的生物標志(Ⅰ類MHC抗原、Ly6A/E抗原和2＇-5＇-寡腺苷酸合成酶活性)都沒有充分地反映出經口粘膜途徑給藥的IFN-α所呈現(xiàn)的非常顯著的生物活性(例如，抗腫瘤和抗病毒活性)。
繼腹腔內(ip)注射少至僅20 IU的IFN-α之后開始的所有試驗中觀察到三種IFN誘導的全部蛋白質的表達式中都有非常顯著的增加，而多達20,000IU的IFN-α經口粘膜途徑給藥后卻沒有任何可測量的效果，兩者之間的反差是顯著的。
雖然我們不能排除在較早的或中間的時間點上有可能觀察到對一種或另一種生物標志的影響，但是，這種情況似乎是不可能的，因為IFN影響這些蛋白質的基因代碼的轉錄，因此人們在IFN治療后只有經過很長的時間才可能看到對這些生物標志的影響。
另外，雖然我們不能排除在用IFN-α經口粘膜途徑治療后觀察到對許多其他IFN誘導的蛋白質之一的全身性影響，但這似乎不可能，因為這將意味著差動調節(jié)某些IFN誘導的基因的表達式。然而，完全有可能在IFN-α(經口粘膜途徑給藥后在局部(例如在鼻淋巴細胞中)觀察到對IFN生物標志的影響。
與對所研究的生物標志沒有可檢測的影響相符，即使在用高達20,000IU的IFN-α治療的動物中也沒有觀察到對任何在IFN經口粘膜給藥治療期間所監(jiān)測的血液學或血液化學參數的一致影響。
藥物動力學-生物活性研究的結果很清楚地表明采用比以前所用方法敏感一個數量級的檢測方法，在外圍血液中沒有可檢出的IFN循環(huán)的條件下，單次量的帶放射性標記的Hu IFN-α1-8經口粘膜給藥后可獲得統(tǒng)計學上有意義的抗病毒效果。與這些結果相一致，經口粘膜給藥的IFN發(fā)揮抗病毒活性的程度似乎遵循經典的劑量-反應關系。
在帶125I標記的IFN-α1-8經口粘膜給藥之后在動物的全血和血清中都發(fā)現(xiàn)容易檢測到的帶放射性標記的物質。這些結果與以前研究的結果(即在口服大量的未帶標記的IFN后在動物的血清中仍未檢測出IFN)恰好相反。但是，經口粘膜給藥后在全血和血清中檢測出的放射性物質是無生物活性的。此外，SDS-PAGE分析的結果表明這種物質是低分子量的，并且很可能反映繼IFN在胃和小腸中消化之后對降解產物的吸收作用。在口粘膜給藥后帶放射性標記的物質的組織分布的分析結果表明胃中的放射性水平明顯地高于受檢驗的任何其他器官。我們的結果十分清楚地表明即使口粘膜給藥后帶生物活性的IFN不被吸收，這種療法仍能在體內發(fā)揮有統(tǒng)計意義的抗腫瘤活性。
雖然不希望使觀察到的有益作用拘泥于任何已提出的機制，但我們的結果意味著經口粘膜給藥的IFN借助目前尚不明確的新機制發(fā)揮其抗腫瘤作用或抗病毒作用，這種機制不包括外源給藥的IFN的直接作用，或對內源性IFN的誘導作用。沒有可檢水平的循環(huán)IFN或沒有可檢水平的受試的三種生物標志都支持這一觀點。似乎這種機制至少可以部分地借助刺激鼻咽腔和口腔周圍豐富的淋巴樣組織發(fā)揮作用。因為我們已證明經口粘膜給藥的IFN在效力上至少與全身給藥的IFN相差無幾，所以我們的試驗結果強有力的支持在治療腫瘤病和病毒性疾病時借助口粘膜途徑完成IFN給藥。這對于IFN的臨床應用可能有重要意義。
本領域技術人員可以明確看出，雖然為了清晰和便于理解已對本發(fā)明作了相當詳盡的描述，但是不脫離說明書中公開的本發(fā)明的精神和范圍可以對本文描述的實施方案和方法作出各種修飾和改動。
權利要求
1．刺激哺乳動物體內宿主防御機制的方法，該方法包括通過口粘膜接觸給哺乳動物投用刺激量的干擾素，所述劑量大于約20×106IU干擾素。
2．刺激哺乳動物體內免疫反應的方法，該方法包括通過口粘膜接觸給哺乳動物投用免疫刺激量的干擾素，所述劑量大于約20×106IU干擾素。
3．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的有效劑量是以單一劑量投用的。
4．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的有效無毒劑量是在足以引發(fā)相當于單一劑量的免疫刺激作用的時間里以多次較小劑量投用的。
5．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的免疫刺激劑量是在足以引發(fā)相當于單一劑量的免疫刺激作用的時間里連續(xù)投用的。
6．治療腫瘤病理條件的方法，該方法包括通過口粘膜接觸給哺乳動物投用有效劑量的干擾素，所述劑量超過胃腸道外給藥時同種干擾素的非病理劑量。
7．治療病毒感染的方法，該方法包括通過口粘膜接觸給哺乳動物投用有效劑量的干擾素，所述劑量超過胃腸道外給藥時同種干擾素的非病理劑量。
8．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素包括Ⅰ型干擾素。
9．根據權利要求8所述的方法，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，和其混合物。
10．根據權利要求9所述的方法，其中IFN-α包括重組IFN-α。
11．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素包括Ⅱ型干擾素。
12．根據權利要求11所述的方法，其中Ⅱ型干擾素包括γ-IFN。
13．根據權利要求6所述的方法，其中腫瘤病理條件是非病毒病原學的。
14．治療哺乳動物的多發(fā)性骨髓炎、多毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病、低級淋巴瘤、細胞淋巴瘤、癌樣腫瘤、腎腫瘤、腎細胞癌、肝細胞癌、癌、肉瘤、血液惡性腫瘤、結腸直腸癌、成膠質細胞瘤、肺癌、結腸癌、和包括惡性腦腫瘤在內的腦腫瘤的方法，該方法包括通過口粘膜接觸給哺乳動物投用有效治療劑量的干擾素，所述劑量大于大約20×106IU。
15．根據權利要求14所述的方法，其中有效劑量的干擾素是以單一劑量投用的。
16．根據權利要求14所述的方法，其中有效劑量的干擾素是在足以引發(fā)相當于單一劑量的治療反應的時間里以多個較小劑量投用的。
17．根據權利要求14所述的方法，其中干擾素的劑量是在足以引發(fā)相當于單一劑量的治療反應的時間里連續(xù)給藥的。
18．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的總劑量是從大約20×106IU到大約1000×106IU的干擾素。
19．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約20×106IU到大約500×106IU的干擾素。
20．根據權利要求1所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約50×106IU到大約500×106IU的干擾素。
21．根據權利要求14所述的方法進一步包括與放射治療或化學治療結合。
22．根據權利要求14所述的方法進一步包括投用其他細胞因子或干擾素誘導劑。
23．根據權利要求14所述的方法，其中干擾素包括Ⅰ型干擾素。
24．根據權利要求23所述的方法，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、FN-ω、共有IFN，和其混合物。
25．根據權利要求24所述的方法，其中IFN-α包括重組IFN-α。
26．根據權利要求14所述的方法，其中干擾素包括Ⅱ型干擾素。
27．根據權利要求26所述的方法，其中干擾素包括γ-擾素。
28．在制備適于經口粘膜接觸刺激哺乳動物的宿主防御機制或免疫反應的藥物中干擾素的應用，該藥物包含刺激劑量的干擾素，所述劑量大于約20×106IU的干擾素。
29．根據權利要求28所述的應用，其中藥物包含有效、無毒、單一劑量的干擾素。
30．根據權利要求28所述的應用，其中藥物包含足以引發(fā)相當于單一劑量的宿主防御或免疫反應刺激作用的多個較小劑量的干擾素。
31．根據權利要求28至30中任何一項所述的應用，其中該藥物在足以引發(fā)相當于單一劑量的宿主防御機制或免疫反應刺激作用的時間里提供能刺激宿主防御或免疫反應的無毒劑量的連續(xù)給藥。
32．根據權利要求28至31中任何一項所述的應用，其中藥物適用于治療或預防腫瘤病理條件，所述劑量超過同種干擾素經胃腸道外給藥時的非病理劑量。
33．根據權利要求28至31中任何一項所述的應用，其中藥物適用于治療或預防病毒感染，所述劑量超過同種干擾素經胃腸道外給藥時的非病理劑量。
34．根據權利要求28至33中任何一項所述的應用，其中藥物包含干擾素和干擾素誘導劑。
35．根據利用要求28至34中任何一項所述的應用，其中單位劑量形式的藥物包含大約20×106IU到大約1000×106IU的干擾素。
36．根據權利要求28至35中任何一項所述的應用，其中藥物包括另一種用于同時、單獨或連續(xù)治療的治療劑。
37．根據權利要求28至36中任何一項所述的應用，其中治療劑選自細胞生長抑制劑、抗腫瘤劑、抗血管生成劑，及抗病毒劑。
38．根據權利要求28至37中任何一項所述的應用，其中干擾素是Ⅰ型干擾素。
39．根據權利要求38所述的應用，其中Ⅰ型干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，和其混合物。
40．根據權利要求39所述的應用，其中Ⅰ型干擾素是IFN-α。
41．根據權利要求28至37中任何一項所述的應用，其中干擾素是Ⅱ型干擾素。
42．根據權利要求41所述的應用，其中Ⅱ型干擾素是γ-IFN。
43．根據權利要求38或41所述的應用，其中干擾素是重組物。
44．適合口粘膜接觸刺激哺乳動物的宿主防御機制或免疫反應的干擾素組合物，該組合物包括刺激量的干擾素，所述劑量超過經胃腸道外給藥時引發(fā)病理學反應的量。
45．根據權利要求44所述的組合物，該組合物包含有效、無毒、單一劑量的干擾素。
46．根據權利要求44所述的組合物，該組合物包含足以引發(fā)相當于單一劑量的宿主防御或免疫反應刺激作用的多份較小劑量的干擾素。
47．根據權利要求44至46中任何一項所述的組合物，該組合物在足以引發(fā)相當于單一劑量的宿主防御或免疫反應刺激作用的時間里提供刺激宿主防御或免疫反應的無毒劑量的連續(xù)給藥。
48．根據權利要求44至47中任何一項所述的適合治療腫瘤病理條件的組合物。
49．根據權利要求44至47中任何一項所述的適合治療病毒感染的組合物。
50．根據權利要求44至49中任何一項所述的組合物，該組合物包含干擾素和干擾素誘導劑。
51．根據權利要求44至50中任何一項所述的組合物，該組合物以單位劑量形式包含大約20×106IU到大約1000×106IU的干擾素。
52．根據權利要求44至51中任何一項所述的組合物，該組合物包含另一種適合同時、單獨或相繼治療的治療劑。
53．根據權利要求44至52中任何一項所述的組合物，其中治療劑選自細胞生長抑制劑、抗腫瘤劑、抗血管生成劑和抗病毒劑。
54．根據權利要求44至53中任何一項所述的組合物，其中干擾素是Ⅰ型干擾素。
55．根據權利要求54所述的組合物，其中Ⅰ型干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，和其混合物。
56．根據權利要求55所述的組合物，其中Ⅰ型干擾素是IFN-α。
57．根據權利要求44至53中任何一項所述的組合物，其中干擾素是Ⅱ型干擾素。
58．根據權利要求57所述的組合物，其中Ⅱ型干擾素是γ-IFN。
59．根據權利要求54或57所述的組合物，其中干擾素是重組物。
60．單位劑量形式的用于口粘膜給藥的藥物組合物，該組合物包含大約20×106IU到大約1000×106IU的干擾素和醫(yī)藥上可接受的載體。
61．根據權利要求60所述的組合物，該組合物包括大約20×106IU到大約500×106IU的干擾素。
62．根據權利要求61所述的組合物，該組合物包括大約20×106IU到大約500×106IU的干擾素。
全文摘要
適合經口粘膜接觸以超過干擾素胃腸道外給藥量的干擾素刺激量刺激哺乳動物宿主防御機制或免疫反應的干擾素組合物,采用這類組合物的治療方法以及在制備這類口粘膜給藥的組合物時干擾素的應用。
文檔編號A61P43/00GK1218408SQ97194501
公開日1999年6月2日 申請日期1997年5月5日 優(yōu)先權日1996年5月9日
發(fā)明者邁克爾·格拉德·托文 申請人:太平洋制藥控股公司