專利名稱：具有廣譜抗腫瘤活性的1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有廣譜抗腫瘤作用的化合物i乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物， 以及所述化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途，這種抗腫瘤藥物能有效殺滅和預防各種腫瘤。
背景技術：
腫瘤仍然是人類健康的主要殺手，目前仍無有效的防治方法。腫瘤的發(fā)生有賴于細胞的異 常增殖，細胞的異常增殖的主要原因是信號通路的異常活躍，人類幾種主要腫瘤內都存在著
NF-icB信號的異常，針對這一靶點，將有效抑制腫瘤的增殖。在目甜的抗腫瘤藥物中，天然 產物如長春新堿、三尖杉酯堿等都占有非常重要的地位。
核因子kB (Nuclear factor k B， NF-kB)，最早被定義為一種B細胞核因子，是B細胞 動態(tài)平衡調節(jié)所必需的。NF-icB是Rel蛋白家族成員，有一個約300殘基的N末端Rel同源 區(qū)(與二聚化，核轉位，DNA結合等相關)是一個典型的由p50 (少數情況下p52)禾口p65 (Rel A)組成的異二聚物，可以和IicBa亞單位相結合。在休眠細胞中，NF-kB主要存在于胞質 中，與它的抑制因子IkB家族相結合，這種結合是通過多個錨蛋白重復實現的同時抑制其DNA 結合活性。 一般來說，IkB家族抑制NF-kB的入核是通過掩飾NF-k B 二聚體的核定位序列 (nuclear localization sequence, NLS)。而事實上，最常見的I k B a只能掩飾NF-k B兩 個NLS中的一個，所以還是會有一定量的沒有DNA結合活性的NF-kB-lKBa可能進入細胞 核，此時lKBa上的一段核輸出信號(nuciearexport signal, NES)就發(fā)揮作用將復合物 輸出核外，從而保證了核內的穩(wěn)定。活化狀態(tài)下，I k Bci被IKK所磷酸化而后泛素化經過26S 蛋白酶體降解，使NF-icB順利的進入核內結合到目的基因啟動子區(qū)的特定DNA序列上，促進 基因的轉錄。
近年來，發(fā)明人致力于從天然產物提取物中分離具有生物活性物質。通過對600多種天然 提取物分析研究，結果發(fā)現大高良姜提取物具有廣譜抗腫瘤、促進細胞凋亡作用。而這種作 用的實現是通過干擾NF- ic B信號轉導引起。在對于大高良姜提取物有效成分進行分離純化和 鑒定的基礎上，我們發(fā)現其中的單體化合物乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(l' -acetoxychavicol acetates, ACA)是引起這些效應的有效成分。進一歩研究結果表明，這種小分子化合物不僅 能在體外誘導細胞凋亡，而且能在小鼠腫瘤模型內有效殺滅腫瘤細胞。更值得一提的是，這 種小分子化合物無明顯毒副作用，且在體外十分穩(wěn)定。
ACA主要是從一種姜科植物大良姜(紅豆蔻)(Alpinia galanga.l)的根莖中提取出來， 在我國南方某些地區(qū)和東南亞一帶常用來作為姜的替代調味品。ACA在1位有一個立體化學 手性中心，其1位的天然構型為S型，其構型如下
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發(fā)明內容
本發(fā)明涉及到一種具有廣譜抗腫瘤活性的天然化合物r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯，或其具 有同等生物學活性的衍生物。r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯是通過抑制iKB蛋白質出核使大量
NF- k B-1 k B a復合物聚集核內，導致核內存在大量的無活性的NF- k B，嚴重影響核內轉錄的 進行。
本發(fā)明公開了l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯具有廣譜抗腫瘤作用，其可用于制備抗腫瘤藥 物，其中所述的腫瘤包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、 食道癌、膽管癌、白血病。
此外，本發(fā)明所述的r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯還能有效殺滅小鼠腫瘤模型體內腫瘤細 胞，而且對小鼠本身無明顯毒副作用。
實施方式
下面具體結合實施例，具體闡述本發(fā)明。應該理解，這些實施例僅用于闡述本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。
i、從大良姜中制備r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯
r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的提取和純化方法為把大良姜的根莖切碎，碎片干燥后用甲
醇提取。提取物干燥后通過硅膠層析柱用正己垸醋酸乙酯(5: 1)作為溶媒進行分離
得到純1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。其收獲為1公斤大良姜提取150-160mgl'-乙酰氧
基胡椒酚乙酸酯。
么用于檢測r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對于ikb蛋白質出核抑制作用的分裂酵母
5b/w'zo幼cc力ar。/ff/ces p。/ff6s的制備 5b^'zasacc力sr湖yces p，&分裂酵母JY266被用于本研究。含有野生型nmtl啟動 子(該啟動子在沒有維生素B1的培養(yǎng)液中能夠有力地引導轉錄)的pREPl質類粒被用于 S.pombe酵母轉化。為了能在S.pombe酵母中看見細胞核質間的傳送，編碼谷胱甘H^-轉移酶(GST) SV40T抗原的核定位信號(NLS)，綠色熒光蛋白(GFP)以及IkB蛋白的 核輸出信號(NES)的融合蛋白的載體被倒入到JY266酵母株中。
3、 1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對于阻止IKB出核作用的測定
在引入融合蛋白后，S.pombe酵母菌在沒有維生素Bl的培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)24小時， 然后酵母細胞以及含1%二甲亞砜的培養(yǎng)液的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯被種在％孔板中繼 續(xù)培養(yǎng)3小時。通過熒光顯微鏡對GST-NLS-GFP-1 k B NES融合蛋白的分布進行檢測，在1.2 yg/ml濃度下，1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全阻止了 S.po油e酵母菌的融合蛋白從細胞核 向細胞質進行輸出。
4、 1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯抗腫瘤作用的測定
實施例l本發(fā)明所述r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人肝癌細胞作用
(1》在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人肝癌細胞，每孔接種0.1ml含1X105細胞完全細 胞培養(yǎng)液謹EM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混合后，將細胞放入37'C細胞培養(yǎng)箱內(含5%〔02)培養(yǎng)48小 時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現6umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人肝癌細胞生長具有明顯抑 制作用，其生長抑制率達75%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞術分析結果表明6umol/L乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人 肝癌細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達7 0%。
實施例2本發(fā)明所述r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人腫癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人肺癌細胞，每孔接種O. lml含1XlCf細胞完全細胞 培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混勻后，將細胞放入37'C細胞培養(yǎng)箱內(含5%032)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現4um]/L1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人肺癌細胞生長具有明顯抑 制作用，抑制率大于75%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞儀分析結果表明r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人肺癌細胞
發(fā)生凋亡，6umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作用48小時后，其凋亡率可達70%。
實施例3.本發(fā)明所述l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人胃癌細胞作用
(1)在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人胃癌細胞，每孔接種0. lml含1乂105細胞完全細胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培養(yǎng) 液DMEM，與細胞混合后，將細胞放入37t:細胞培養(yǎng)箱內(含5%<:02)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現8umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人胃癌細胞生長具有明顯抑 制作用，其生長抑制率達80%,而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞術分析結果表明8umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述 人胃癌細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達7 5%。
實施例4本發(fā)明所述l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人結腸癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人結腸癌細胞，每孔接種0. lml含1X105細胞完全細 胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混勻后，將細胞放入37"C細胞培養(yǎng)箱內(含5y。C02)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現6umol/Ll，-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人結腸癌細胞生長具有明顯 抑制作用，抑制率大于65%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞儀分析結果表明1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述結腸癌細胞 發(fā)生凋亡，8timol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作用48小時后，其凋亡率可達60%。
實施例5本發(fā)明所述r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人乳腺癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人乳腺癌細胞，每孔接種0. lml含1乂105細胞完全細 胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入O. lml含不同濃度如上述制備的l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培養(yǎng) 液DMEM，與細胞混合后，將細胞放入37。C細胞培養(yǎng)箱內(含5%〔02)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現5ixmol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人乳腺癌細胞生長具有明顯 抑制作用，其生長抑制率達75%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞術分析結果表明1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人乳腺癌 細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達7 0%。
實施例6本發(fā)明所述r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人卵巢癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人卵巢癌細胞，每孔接種0. lml含1乂105細胞完全細 胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入O. lml含不同濃度如上述制備的l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培養(yǎng)液DMEM，與細胞混合后，將細胞放入37。C細胞培養(yǎng)箱內(含5%(]02)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現6umol/Lr -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人卵巢癌細胞生長具有明顯 抑制作用，其生長抑制率達80%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5.)用流式細胞術分析結果表明1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人卵巢癌 細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達7 5%。
實施例7本發(fā)明所述r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人口腔癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人口腔癌細胞，每孔接種0. lml含1X1()5細胞完全細 胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混勻后，將細胞放入37'C細胞培養(yǎng)箱內(含5%0)2)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現5pmol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人口腔癌細胞生長具有明顯 抑制作用，抑制率大于75%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞儀分析結果表明細1，-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人口腔 癌細胞發(fā)生凋亡，5umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作用48小時后，其凋亡率可達70%。
實施例8本發(fā)明所述l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人食道癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人食道癌細胞，每孔接種O. lml含1乂105細胞完全 細胞培養(yǎng)液鹿EM。
(2) 每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混合后，將細胞放入37。C細胞培養(yǎng)箱內(含5%0)2)培養(yǎng)48小 時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現8umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人食道癌細胞生長具有明顯 抑制作用，其生長抑制率達80%，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞術分析結果表明8umol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述 人食道癌細胞發(fā)生凋亡，其凋亡率達7 5%。
實施例9本發(fā)明所述l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人膽管癌細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人膽管癌細胞，每孔接種0. lml含1X1()5細胞完全細 胞培養(yǎng)液DMEM。
(2) '每孔加入0. lml含不同濃度如上述制備的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培 養(yǎng)液DMEM，與細胞混勻后，將細胞放入37。C細胞培養(yǎng)箱內(含5%0)2)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。(4) 結果發(fā)現6ymol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人膽管癌細胞生長具有明顯 抑制作用，''抑制率大于75%,而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞儀分析結果表明r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人膽管癌細
胞發(fā)生凋亡，6umol/Ll，-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作用48小時后，其凋亡率可達70%。
實施例IO本發(fā)明所述l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的抗人白血病細胞作用
(1) 在96孔細胞培養(yǎng)板內無菌接種人白血病細胞HL-60，每孔加入0. lml含1X10'細胞完 全細胞培養(yǎng)液1640。
(2) 每孔加入O. lml含不同濃度如上述制備的l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯完全細胞培養(yǎng)液 1640，與細胞混勻后，將細胞放入37'C細胞培養(yǎng)箱內(含5。/。C02)培養(yǎng)48小時。
(3) 終止細胞培養(yǎng)，用MTT法測定培養(yǎng)細胞活力。
(4) 結果發(fā)現4umol/Ll，-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯對上述人白血病細胞1-60生長抑制 率達到85%以上作用，而對相應的正常細胞生長無明顯抑制作用。
(5) 用流式細胞術分析結果表明r-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯能明顯誘導上述人白血病細
胞HL-60發(fā)生凋亡，在4 u mol/Ll'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作用48小時后人白血病細胞HL-60 凋亡率可達80%。
實施例ll本發(fā)明所述的r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的體內抗人肝癌細胞作用
(1) 取2 0克左右SC I D裸小鼠30只，在每只小鼠背部皮下接種l X 1 (T人肝癌細胞。
(2) 接種一周后，將30只小鼠分成A、 B兩組，每組各15只。其中A組每只小鼠腹腔內 每天注射10u g如上述制備的r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯。同時觀察腫瘤生長情況和小鼠生 長情況。
(3) 4周后處死實驗小鼠，測量和記錄小鼠背部腫瘤生長情況和小鼠本身的生長情況。
(4) 結果發(fā)現每天腹腔注射10u gl'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯A組小鼠其背部腫瘤生 長明顯受到抑制，而未注射l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯B組小鼠其背部腫瘤生長良好。A組 小鼠平均瘤重僅為對照組B組的1/5左右。
(5) 經病理組織切片觀察分析結果表明注射1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯實驗組瘤組織 內很少見到生長活躍的瘤細胞，而對照組瘤細胞生物十分活躍。
(6) 注射l'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯實驗組小鼠整個實驗過程中未見明顯毒副作用。
權利要求
1. 1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯在制備廣譜抗腫瘤藥物中的應用。1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的結構式為
2. r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的衍生物在制備廣譜抗腫瘤藥物中的應用。
3. 權利1和2所述的在制備廣譜抗腫瘤藥物的應用，其中的腫瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、膽管癌、白血病。
4. 如權利i和2所述的應用，其特征在于，r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物為單獨或 結合其它藥物的形式。
5. 如權利i和2所述的應用，其特征在于，r -乙酰氧基胡椒酚乙酸酯及其衍生物為單獨或 結合其它藥學可接受的輔劑形式。
6. 如權利4、 5所述的應用，其特征在于，其中的廣譜抗腫瘤藥物為人體用廣譜腫瘤治療藥物。
7. 如權利4、 5所述的應用，其特征在于，其中的廣譜抗腫瘤藥物為人體用廣譜腫瘤預防藥 物。OOCCH全文摘要
本發(fā)明涉及到一種從植物中提取的具有廣譜抗腫瘤活性的天然化合物1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯，或其具有同等生物學活性的衍生物。1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯是通過抑制IκB蛋白質出核使大量NF-κB-IκBα復合物聚集核內，導致核內存在大量的無活性的NF-κB，嚴重影響核內轉錄的進行，從而抑制腫瘤細胞增殖。本發(fā)明公開了1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯具有廣譜抗腫瘤作用，在一定濃度下對腫瘤細胞具有很高的抑制率，而對于正常細胞不顯示毒性。本發(fā)明公開了從植物中提取1’-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯的方法，其可用于制備抗腫瘤藥物，所述的腫瘤包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌、食道癌、膽管癌、白血病。
文檔編號A61K31/21GK101422451SQ20071016960
公開日2009年5月6日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權日2007年11月2日
發(fā)明者英 葉, 李博安 申請人:陜西新生醫(yī)藥科技有限公司;李博安;葉 英