專利名稱：基于NAD⁺和NADH的藥物的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的藥物制備及其應(yīng)用方法，具體是一種基于 NAD+(煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸；nicotinamide adenine dinucleotide,簡稱 NAD+)和 NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原態(tài))；nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form,簡稱NADH)的藥物的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴重危害人民群眾身體健康的最嚴重的多發(fā)病之一。目前采用的放射 性治療和化學(xué)治療等方法都有著對正常組織、細胞殺傷大等不良副作用。因此尋找對正常 組織無殺傷，而對腫瘤細胞有殺傷作用或者抑制生長作用的藥物有著重要的臨床意義。NAD+和NADH都是在脫氫酶的作用中轉(zhuǎn)移氫離子的輔酶它出現(xiàn)在細胞很多代謝反 應(yīng)中，如乙醇脫氫酶(ADH)催化的氧化乙醇反應(yīng)中。NAD+是接受氫離子的輔酶，而NADH是 在脫氫酶的作用中接受氫離子的輔酶。NAD+和NADH是參與能量代謝、線粒體功能、老化等 重要生物過程的重要的體內(nèi)生物分子；它們在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)及呼吸鏈中發(fā)揮 著不可替代的作用。除基礎(chǔ)研究外，NAD+現(xiàn)在醫(yī)療行業(yè)沒有直接應(yīng)用。在臨床上有初步的 關(guān)于NADH對帕金森氏病作用的研究。在細胞培養(yǎng)研究和動物腦缺血模型的研究中，NAD+的 施加極大地減少了有腦缺血和氧化應(yīng)激造成的原代神經(jīng)元和星狀膠質(zhì)細胞壞死。在細胞培 養(yǎng)研究中，NADH也可以減少由于DNA損傷劑誘導(dǎo)的星狀膠質(zhì)細胞壞死。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于NAD+和NADH的藥物的應(yīng) 用方法，可用于殺死神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細胞、神經(jīng)元腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、腎癌腫瘤細胞或 乳腺癌腫瘤細胞。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟步驟一，將粉狀的NAD+和NADH按0. 01 %至99. 99 %的質(zhì)量比例混合構(gòu)成含 0. 001 IOmM 的 NAD+ 及 0. 001 IOmM NADH 的藥物；步驟二，向離體培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞中加入步驟一所得的藥物并進行培養(yǎng)。所述的惡性腫瘤細胞為神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細胞、神經(jīng)元腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、腎癌 腫瘤細胞或乳腺癌腫瘤細胞。所述的培養(yǎng)是指加入NAD+和NADH之后培養(yǎng)惡性腫瘤細胞M 48h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中的NAD+和NADH可大量殺死神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細胞、神經(jīng)元 腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、腎癌腫瘤細胞或乳腺癌腫瘤細胞；為以后進一步制作以NAD+和 NADH作為主要成分的藥物提供了科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明涉及的惡性腫瘤細胞均可通過公開的市售的商業(yè)渠道獲得，例如中國科 學(xué)院上海生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫。


圖1為以99.99 % NAD+及0.01% NADH為主要成分的藥物減少神經(jīng)元腫瘤 (Neuro2A)細胞存活的結(jié)果圖。圖2為以99. 99% NAD+及0. 01 % NADH作為主要成分的藥物減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤(C6) 細胞存活的結(jié)果圖。圖3為以99. 99% NAD+及0. 01 % NADH作為主要成分的藥物減少乳腺癌(MCF-7) 細胞存活的結(jié)果圖。圖4為以99. 99% NAD+及0. 01 % NADH作為主要成分的藥物減少胃癌(MKN-45)細 胞存活的結(jié)果圖。圖5為以99. 99% NAD+及0.01% NADH作為主要成分的藥物減少腎癌(HEK293)細 胞存活的結(jié)果圖。圖6為以99. 99 % NADH及0. 01 % NAD+為主要成分的藥物減少神經(jīng)元腫瘤 (Neuro2A)細胞存活的結(jié)果圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1以NAD+和NADH作為主要成分的藥物減少神經(jīng)元腫瘤(Neuro2A)細胞的存活利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的
Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液 的影響)一文)將NAD+(Sigma公司)及NADH配成分別含IOmM NAD+和1 μ M NADH的溶液， 然后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制 的 IOmM 的 NAD+，進而得到 0. ImM NAD+ 禾口 0. 01 μ M NADH,以及 ImM NAD+ 禾口 0. 1 μ M NADH 作 為主要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入神經(jīng)元腫瘤(Neuro2A)細胞(中 國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用 LDH方法(乳酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖1及圖6所示在M小時以NAD+與NADH 作為主要成分的藥物處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的藥物可以殺 死20% 的神經(jīng)元腫瘤Neuro-2A細胞；在48小時NAD+處理后，含0. ImM IOmM NAD+ 的以及0.01-1 μ M NADH的藥物可以殺死60% 80%的神經(jīng)元腫瘤Neuro-2A細胞。實驗 還表明，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的藥物處理后，以NAD+和NADH作為 主要成分的藥物可以殺死40% 60%的神經(jīng)元腫瘤Neuro-2A細胞。實施例2以NAD+和NADH作為主要成分的藥物減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤(C6)細胞的存活利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液的 影響)一文)將NAD+ (Sigma公司)及NADH配成分別含IOmM NAD+和1 μ M NADH的溶液，然 后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制的 IOmM 的 NAD+，進而得到 0. ImM NAD+ 禾口 0. 01 μ M NADH,以及 ImM NAD+ 禾口 0. 1 μ M NADH 作為 主要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(中國科學(xué)院上海 生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用LDH方法(乳 酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖2所示在M小時以NAD+與NADH作為主要成分的藥物 處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01_1 μ M NADH的藥物可以殺死20% 的神 經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞；在48小時NAD+處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的 藥物可以殺死60% 80%的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。實驗還表明，含0. ImM IOmM NAD+的以及 0. 01-1 μ M NADH的藥物處理后，以NAD+和NADH作為主要成分的藥物可以殺死40% 60% 的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。實施例3以NAD+和NADH作為主要成分的藥物減少乳腺癌(MCF-7)細胞的存活利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的 M^j"Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液的 影響)一文)將NAD+ (Sigma公司)及NADH配成分別含IOmM NAD+和1 μ M NADH的溶液，然 后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制的 IOmM 的 NAD+，進而得到 0. ImM NAD+ 禾口 0. 01 μ M NADH,以及 ImM NAD+ 禾口 0. 1 μ M NADH 作為主 要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入乳腺癌(MCF-7)細胞(中國科學(xué)院上海 生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用LDH方法(乳 酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖3所示在M小時以NAD+與NADH作為主要成分的藥物 處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01_1 μ M NADH的藥物可以殺死20% 的乳腺 癌(MCF-7)細胞；在48小時NAD+處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的 藥物可以殺死60% 80%的乳腺癌(MCF-7)細胞。實驗還表明，含0. ImM IOmM NAD+的 以及0. 01-1 μ M NADH的藥物處理后，以NAD+和NADH作為主要成分的藥物可以殺死40% 60%的乳腺癌(MCF-7)細胞。實施例4以NAD+和NADH作為主要成分的藥物減少胃癌(ΜΚΝ-45)細胞的存活利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的 M^j"Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液的 影響)一文)將NAD+ (Sigma公司)及NADH配成分別含IOmM NAD+和1 μ M NADH的溶液，然 后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制的 IOmM 的 NAD+，進而得到 0. ImM NAD+ 禾口 0. 01 μ M NADH,以及 ImM NAD+ 禾口 0. 1 μ M NADH 作為主要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入胃癌(MKN-45)細胞(中國科學(xué)院上海 生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用LDH方法(乳 酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖4所示在M小時以NAD+與NADH作為主要成分的藥物 處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01_1 μ M NADH的藥物可以殺死20% 的胃癌 (ΜΚΝ-45)細胞；在48小時NAD+處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的 藥物可以殺死60% 80%的胃癌(MKN-妨)細胞。實驗還表明，含0. ImM IOmM NAD+的 以及0. 01-1 μ M NADH的藥物處理后，以NAD+和NADH作為主要成分的藥物可以殺死40% 60%的胃癌(ΜΚΝ-45)細胞。實施例5NAD+殺死腎癌(ΗΕΚ293)細胞利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的
Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液的 影響)一文)將NAD+ (Sigma公司)及NADH配成分別含IOmM NAD+和1 μ M NADH的溶液，然 后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制的 IOmM 的 NAD+，進而得到 0. ImM NAD+ 禾口 0. 01 μ M NADH,以及 ImM NAD+ 禾口 0. 1 μ M NADH 作為主 要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入腎癌(ΗΕΚ29;3)細胞(中國科學(xué)院上海 生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用LDH方法(乳 酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖5所示在M小時以NAD+與NADH作為主要成分的藥物 處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01_1 μ M NADH的藥物可以殺死20% 的腎癌 (ΗΕΚ293)細胞；在48小時NAD+處理后，含0. ImM IOmM NAD+的以及0. 01-1 μ M NADH的 藥物可以殺死60% 80%的腎癌(ΗΕΚ29;3)細胞。實驗還表明，含0. ImM IOmM NAD+的 以及0. 01-1 μ M NADH的藥物處理后，以NAD+和NADH作為主要成分的藥物可以殺死40% 60%的腎癌(ΗΕΚ293)細胞。實施例6以NADH和NAD+作為主要成分的藥物減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤(C6)細胞的存活利用含10% (體積分數(shù))小牛血清的 Dulbecco' s Modified Eagle Medium(見 Dos-Anjos等在《Analytical Biochemistry》(《分析化學(xué)》)378輯99 101頁上發(fā)表的 M^j"Quantitative gene expression analysis in a brain slice model -influence of temperature and incubation media”(一個腦片模型的數(shù)字化基因分析溫度和培養(yǎng)液的 影響)一文)將NADH (Sigma公司)及NAD+配成分別含IOmM NADH和1 μ M NAD+的溶液，然 后用含10% (體積分數(shù))小牛血清的Dulbecco' s Modified Eagle Medium稀釋配制的 IOmM 的 NADH，進而得到 0. ImM NADH 禾口 0. 01 μ M NAD+,以及 ImM NADH 禾口 0. 1 μ M NAD+ 作為 主要成分的藥物，然后將這些濃度的NAD+和NADH加入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(中國科學(xué)院上海 生科院細胞資源中心，上海市岳陽路320號細胞庫)中，細胞存活的程度采用LDH方法(乳 酸脫氫酶測量法)加以觀測。如圖1所示在M小時以NADH與NAD+作為主要成分的藥物 處理后，含0. ImM IOmM NADH的以及0. 01_1 μ M NAD+的藥物可以殺死10% 40%的神 經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞。
權(quán)利要求
1.一種基于NAD+和NADH的藥物的應(yīng)用方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將粉狀的NAD+和NADH按0. 01 %至99. 99%的質(zhì)量比例混合構(gòu)成含0. 001 IOmM 的 NAD+ 及 0. 001 IOmM NADH 的藥物；步驟二，向離體培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞中加入步驟一所得的藥物并進行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于NAD+和NADH的藥物的應(yīng)用方法，其特征是，所述的培養(yǎng) 是指加入NAD+和NADH之后培養(yǎng)惡性腫瘤細胞M 48h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于NAD+和NADH的藥物的應(yīng)用方法，其特征是，所述的 惡性腫瘤細胞為神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細胞、神經(jīng)元腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、腎癌腫瘤細胞或乳腺 癌腫瘤細胞。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基于NAD+和NADH的藥物的應(yīng)用方法，通過將粉狀的NAD+和NADH按0.01％至99.99％的質(zhì)量比例混合構(gòu)成含0.001～10mM的NAD+及0.001～10mMNADH的藥物；然后向離體培養(yǎng)的惡性腫瘤細胞中加入步驟一所得的藥物并進行培養(yǎng)。本發(fā)明那個可用于殺死神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤細胞、神經(jīng)元腫瘤細胞、胃癌腫瘤細胞、腎癌腫瘤細胞或乳腺癌腫瘤細胞。
文檔編號A61P35/00GK102061285SQ20101055973
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者夏偉梁, 殷衛(wèi)海, 洪韻儀, 趙翠平, 陳賀愈, 韓瑾, 馬英鑫 申請人:上海交通大學(xué)