專(zhuān)利名稱(chēng)：提取羊胚胎提取物的方法及含有該提取物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物提取領(lǐng)域，特別地，涉及一種提取羊胚胎提取物的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種包括上述羊胚胎提取物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
羊胚胎中含有多種具有延緩衰老，增強(qiáng)人體抵抗能力的物質(zhì)如眾所周知的羊胎素。人們對(duì)羊胎素的作用研究最深入，羊胎素中具有生物活性的成分能提高人體組織細(xì)胞的分裂速度，活化人體細(xì)胞，加速老化細(xì)胞的分解，有效改善人體內(nèi)分泌，促使人體機(jī)能恢復(fù)最佳狀態(tài)從而延緩衰老，增加皮膚的彈性使其細(xì)潤(rùn)具有光澤。羊胎素包括蛋白質(zhì)、脂肪和糖類(lèi)以及各種酵素、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素等。按常用方法提取的羊胎素中的大分子蛋白質(zhì)易使得服用者增肥，不利于愛(ài)美女性長(zhǎng)期服用。而羊胎素的上述效果強(qiáng)與弱又取決于所提取羊胎素的生物活性高低?，F(xiàn)有的提取方法多為粉碎、離心、超濾，但離心時(shí)細(xì)胞液摩擦起熱，其中具有生物活性的成分多易受熱變性，因而所制得羊胎素的活性較低。其他方法還有液氮粉碎法(CN200910023809)等，這些專(zhuān)利的羊胎素提取率雖高但生物活性損失嚴(yán)重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種提取羊胚胎提取物的方法及含有該提取物的藥物組合物，以解決羊胚胎提取物生物活性低提取率低的技術(shù)問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種提取羊胚胎提取物的方法， 包括絞碎羊胚胎、冷凍、溶解、研磨以及離心步驟，然后將離心步驟得到的上清液過(guò)濾，獲得羊胚胎提取物，在絞碎羊胚胎與冷凍步驟之間，還包括將絞碎羊胚胎步驟得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步驟；離心步驟中的離心時(shí)溫度為-15 -10°C;上清液的過(guò)濾是指將上清液依次通過(guò)分子量為10萬(wàn)的超濾膜和分子量為1萬(wàn)的超濾膜。進(jìn)一步地，將羊胚胎碎片浸泡在水中的步驟中，水與羊胚胎碎片的質(zhì)量比
≥10 1進(jìn)一步地，冷凍、溶解和研磨步驟依次進(jìn)行為一循環(huán)，重復(fù)該循環(huán)3次，其中冷凍溫度為-30°C。進(jìn)一步地，研磨步驟是采用膠體磨研磨1 池。進(jìn)一步地，羊胚胎為懷孕11 13周的羊胚胎。進(jìn)一步地，羊胚胎為懷孕12周的羊胚胎。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包括上述一種含羊胚胎提取物的藥物組合物，藥物組合物由按上述方法提取的羊胚胎提取物和胸腺肽按質(zhì)量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2組成。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明提供的提取方法，在-10°C下離心提取上清液，能有效保持羊胚胎提取物的生物活性。之后依次采用分子量為10萬(wàn)分子量和1萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，在保留具有生物活性物質(zhì)的同時(shí)，除去易至肥胖的蛋白質(zhì)，使得該提取物只具有美容功效而不至增肥。除了上面所描述的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)之外，本發(fā)明還有其它的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。 下面將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。經(jīng)發(fā)明人反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，懷孕11 13周的羊胚胎中，對(duì)人體有益的物質(zhì)的含量達(dá)到峰值，按此方法提取的提取率和提取物的生物活性均較優(yōu)，優(yōu)選為懷孕12周的羊胚胎。 洗凈后采用常用食物絞碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行初步破碎，絞碎1 池，將羊胚胎絞碎至糊狀。并加入所處理羊胚胎重量10倍以上的蒸餾水浸泡，使細(xì)胞吸足水分，處于膨脹狀態(tài)，后續(xù)研磨時(shí)細(xì)胞能破碎均勻，充分保護(hù)其中活性物質(zhì)。優(yōu)選的加水量為所處理羊胚胎重量10倍。此時(shí)效果最優(yōu)。本文提到的蒸餾水為醫(yī)用級(jí)蒸餾水。置于-30°C下冷凍21 22h，羊胚胎細(xì)胞位置迅速固定，細(xì)胞破裂少細(xì)胞液流失少。21 2 后羊胚胎完全凍住。此時(shí)可在室溫下融解，后采用膠體磨進(jìn)行研磨。顯然的為了縮短等待融解的時(shí)間，并進(jìn)一步提供羊胚胎的破碎程度，此時(shí)也可將凍住的羊胚胎在常溫下破碎10 20min，此時(shí)的破碎能加速融解并進(jìn)一步絞碎羊胚胎以增強(qiáng)其流動(dòng)性，便于在膠體磨中研磨。用膠體磨研磨也是在常溫下進(jìn)行，羊胚胎進(jìn)一步融解，此時(shí)研磨對(duì)細(xì)胞的破碎效果優(yōu)于未經(jīng)速凍直接研磨的羊胚胎。優(yōu)選膠體磨研磨時(shí)間為1 池，此條件下效果最優(yōu)。為充分破碎細(xì)胞，以依次進(jìn)行的冷凍、溶解、破碎和研磨為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)上述循環(huán) 3次，重復(fù)3次后可達(dá)到鏡檢無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，此時(shí)活性物質(zhì)均已溶于蒸餾水中。為使活性物質(zhì)充分溶出，加入所處理羊胚胎重量1倍的蒸餾水離心，整個(gè)離心過(guò)程中溶液溫度為-15 -10°C下。在此條件下離心能防止由于液體升溫導(dǎo)致提取物中活性物質(zhì)失活。取離心后的上層清液采用10萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，進(jìn)行初步除雜。之后還需采用1萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，此時(shí)能將提取物中，大分子蛋白質(zhì)除去，防止將提取物制成保健品后，長(zhǎng)期服用產(chǎn)生增肥的作用。而分子量小于1萬(wàn)的活性物質(zhì)，具有抗衰老作用，可得到保留。所得提取物置于-10°C下保存，以抑制其中分解酶的活性。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物由羊胚胎提取物和胸腺肽組成， 其中羊胚胎提取物為按上述方法制得。胸腺肽則按常規(guī)方法制得或可為市售。顯然的，當(dāng)胸腺肽為的治療效果更優(yōu)，尤其是使用年齡小于6個(gè)月的乳牛進(jìn)行提取時(shí)。羊胚胎提取物和胸腺肽按質(zhì)量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2混合，其中1 1混合時(shí)效果最優(yōu)。羊胚胎提取物可促進(jìn)細(xì)胞分裂，活化衰老細(xì)胞，恢復(fù)衰退器官的活力，起到延緩衰老等美容功效。而胸腺肽具有調(diào)節(jié)、增強(qiáng)人體細(xì)胞免疫功能的作用，能促使被有絲分裂原激活的外周血中的T淋巴細(xì)胞成熟，增加T細(xì)胞在各種抗原或致有絲分裂原中的分泌，增加T 細(xì)胞上淋巴因子受體的水平。同時(shí)它通過(guò)對(duì)T4輔助細(xì)胞的激活作用來(lái)增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。通過(guò)兩者配合使用該藥物組合物的抗衰老、增強(qiáng)免疫、增強(qiáng)皮膚彈性的作用得到加強(qiáng)。該組合物為名為姬靈口服液的保健產(chǎn)品。該藥物組合物采用福林酚法進(jìn)行多肽含量的測(cè)定。實(shí)施例以下實(shí)施例中所用藥品及儀器均為市售。1)取懷孕12周的羊胚胎，絞碎1 池，加入羊胚胎10倍量的蒸餾水，浸泡Ih ；2)置于-30°C下21 22h，在常溫下破碎10 20min后用膠體磨研磨1 2h ；3)重復(fù)步驟2) 3次；4)加入羊胚胎1倍量的蒸餾水離心，離心時(shí)溫度為-10°C ；5)取上清液在10萬(wàn)分子量下超濾，再用1萬(wàn)分子量超濾，得到羊胚胎提取物1。經(jīng)常規(guī)HCPL(高效液相色譜)測(cè)定方法檢測(cè)，羊胚胎提取物1能量?jī)H為 8. 4kcal/100ml，其中含有占提取物總重量2%的羊細(xì)胞精華、3. 06%的蛋白質(zhì)(NX6. 25)、 0. 489%的各類(lèi)氨基酸、2%的礦物質(zhì)，且不含碳水化合物。該提取物能量低長(zhǎng)期服用不易長(zhǎng)胖。對(duì)比例對(duì)比例與實(shí)施例的區(qū)別為在絞碎羊胚胎與冷凍步驟之間未加水浸泡，羊胚胎研磨后在常溫下離心，且并未采用超濾膜進(jìn)行過(guò)濾。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施例相同。得到羊胚胎提取物2。羊胚胎提取物E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)一、試劑1、HanK，S液取氯化鈉80. 0克，氯化鉀4. 0克，磷酸氫二鈉(Na2HPO4. Iffl2O) 1. 2 克，磷酸二氫鉀(KH2PO4)O. 6克及葡萄糖10. 0克，加注射用水1000毫升溶解后，分裝至小瓶中，與115°C滅菌15分鐘后，置冰箱中保存。臨用前，加純化水稀釋10倍，用2. 8%的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 2 ；每1000毫升稀釋液加酚紅溶液[取酚紅1克，加氫氧化鈉液(0. lmol/L)28毫升研磨使溶解，再加純化水至100毫升]2毫升，即得。2、磷酸鹽緩沖液(PH7. 2)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4. 12H20) 19. 33克，磷酸二氫鉀 2. 85克，氯化鈉8. 5克，加純化水溶解并稀釋至1000毫升，即得。3、血液保養(yǎng)液取枸櫞酸鈉1. 33克，枸櫞酸0. 47克，葡萄糖3. 0克，加注射用水溶解并稀釋至100毫升，即得。4、淋巴細(xì)胞分離液(生化試劑，上海試劑二廠(chǎng))。5、20%甲醛固定液取甲醛20毫升，加磷酸鹽緩沖液(PH7. 2)稀釋至100毫升，即得。6、瑞氏染色液取瑞氏染粉0. 1克，加少量甘油在研缽中研磨，最后加甲醇至60毫升使溶解，搖勻，密封備用。7、肝素溶液取肝素適量，加純化水配成每1毫升中含300單位，每管加0. 1毫升。 50°C干燥(可抗凝血液2毫升)。8、綿羊紅血球取綿羊血用玻璃珠去纖維，加燈亮血液保養(yǎng)液，置冰箱內(nèi)可保存二周，臨用前吸取血球保養(yǎng)液中的綿羊紅血球，用適量Hank’ S液離心洗三次，每次離心 (3000轉(zhuǎn)/分)10分鐘，加Hank’ S液稀釋并計(jì)數(shù)，使每1毫升溶液中約含1 X IO8個(gè)紅細(xì)胞，
二、供試品溶液的制備分別取羊胚胎提取物1、羊胚胎提取物2和蒸餾水各1克， 加Hank’S液anl，即得。羊胚胎提取物1和羊胚胎提取物2的供試品為實(shí)驗(yàn)組。蒸餾水的供試品為空白對(duì)照組。三、測(cè)定法1、淋巴細(xì)胞的分離與懸液的制備取淋巴細(xì)胞分離液3毫升，置離心管中，然后加入肝素抗凝人血4毫升，再加入Hank’ S液2毫升，是保持有明心的界面，離心(2000轉(zhuǎn)/ 分)20分鐘，取出離心管，可見(jiàn)分為五層，棄去第一層上清液，吸取第二層白色淋巴細(xì)胞懸液(注意力求吸凈)，加Hank’ S液洗滌2-3次，每次離心(1500轉(zhuǎn)/分)5分鐘，棄去上清液，加Hank’ S液約10毫升，用吸管攪勻，置血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，最后以Hank’ S液稀釋成每 1毫升中含約1XIO6個(gè)淋巴細(xì)胞的溶液，備用。2、E-花環(huán)形成實(shí)驗(yàn)取小試管10支，其中5支各加Hank’ S液0. 1毫升作對(duì)照管，另5支各加供試品溶液0. 1毫升作測(cè)定管，每管各加淋巴細(xì)胞液0. 2毫升，用吸管攪勻，置37°C水浴中活化90 分鐘，離心(1000轉(zhuǎn)/分)5分鐘，棄去上清液，加新鮮配置的1 %綿羊紅血球懸液0. 2毫升， 搖勻，離心(500轉(zhuǎn)/分)5分鐘，放入冰箱過(guò)夜。次日取出，棄去上清液，每管加入固定液一滴，請(qǐng)輕搖勻，與4°C靜置15分鐘，混勻，取一小滴，涂片，待干后用瑞氏液染色，純化水洗干后，油鏡或高倍鏡檢計(jì)數(shù)，計(jì)算200 個(gè)淋巴細(xì)胞，凡淋巴細(xì)胞表面粘附3個(gè)以上綿羊紅血球者，即計(jì)數(shù)為玫瑰花結(jié)形成細(xì)胞，并計(jì)算形成玫瑰花結(jié)的淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分率，求出各組的平均值。用各實(shí)驗(yàn)組的該平均值分別減去對(duì)照空白組的該平均值。結(jié)果列于表1中。表1 E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種提取羊胚胎提取物的方法，包括絞碎羊胚胎、冷凍、融解、研磨以及離心步驟， 然后將所述離心步驟得到的上清液過(guò)濾，獲得羊胚胎提取物，其特征在于，在所述絞碎羊胚胎與所述冷凍步驟之間，還包括將所述絞碎羊胚胎步驟得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步驟；所述離心步驟中的離心時(shí)溫度為-15 -10°c ；所述上清液的過(guò)濾是指將上清液依次通過(guò)分子量為10萬(wàn)的超濾膜和分子量為1萬(wàn)的超濾膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將羊胚胎碎片浸泡在水中的步驟中， 所述水與羊胚胎碎片的質(zhì)量比> 10 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述冷凍、融解和研磨步驟順序進(jìn)行一次為一次循環(huán)，重復(fù)所述循環(huán)3次，其中所述冷凍溫度為-30°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述研磨步驟是采用膠體磨研磨1 池。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述羊胚胎為懷孕11 13周的羊胚胎。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述羊胚胎為懷孕12周的羊胚胎。
7.一種含羊胚胎提取物的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物由按權(quán)利要求 1 6中任一所述方法提取的羊胚胎提取物和胸腺肽按質(zhì)量比0. 8 1. 2 0. 8 1. 2組成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取羊胚胎提取物的方法及含有該提取物的藥物組合物，其中提取羊胚胎提取物的方法包括絞碎羊胚胎、冷凍、溶解、研磨以及離心步驟，然后將離心步驟得到的上清液過(guò)濾，獲得羊胚胎提取物，在絞碎羊胚胎與冷凍步驟之間，還包括將絞碎羊胚胎步驟得到的羊胚胎碎片浸泡在水中的步驟；離心步驟中的離心溫度控制在-15～-10℃的范圍；上清液的過(guò)濾是指將上清液依次通過(guò)分子量為10萬(wàn)的超濾膜和分子量為1萬(wàn)的超濾膜。本發(fā)明提供的羊胚胎中具有生物活性物質(zhì)的提取方法，在-10℃下離心提取上清液，能有效保持提取物的生物活性。之后依次采用分子量為10萬(wàn)分子量和1萬(wàn)分子量的超濾膜進(jìn)行過(guò)濾，在保留具有生物活性物質(zhì)的同時(shí)，除去易至肥胖的蛋白質(zhì)，使得該提取物只具有美容功效而不至增肥。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102274241SQ20111022856
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者周偉 申請(qǐng)人:周偉