專利名稱：不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物，制備它們的方法，及它們治療骨質(zhì)疏松癥、Paget’s癥、骨痛、各種高血鈣癥及與血鈣過高引起的有關(guān)疾病中的用途。
天然降鈣素能治療骨質(zhì)疏松癥，Paget’s癥、骨痛、各種高血鈣癥等。天然降鈣素都是由32個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，目前已知的天然降鈣素包括人、豬、牛、雞、鼠、魚等動(dòng)物的降鈣素。不同種屬的天然降鈣素其氨基酸殘基不同，但都包括由1，7位半胱氨酸形成的二硫鍵，C-端都是脯氨酰胺結(jié)構(gòu)。在天然降鈣素中，以魚類(鮭、鰻)的活性最高，鮭魚降鈣素(Salmon calcitonin，sCT)和鰻魚降鈣素(Eel calcitonin，eCT)的活性約是人降鈣素(Human calcitonin，hCT)的30倍(Epand R M，Caulfield M P.Calcitonin and parathyroid hormone receptors，InComprehensive Medicinal Chemistry，Emmett J T，Ed；PergamonOxford；Vol.31023-1045，1990.)。
sCT和eCT的氨基酸序列如下Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2(sCT)32Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-
Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2(eCT)32天然降鈣素中1，7位Cys形成的二硫鍵對(duì)人、鼠等的降鈣素是活性必須基團(tuán)，不含二硫鍵的hCT類似物基本沒有活性。但是二硫鍵對(duì)魚的降鈣素活性影響不大，例如用其它環(huán)取代sCT或eCT中的二硫環(huán)[Fujii，S，Yamamoto I，shimizu F，et al.Preparation of calcitonin derivatives andcalcium metabolism-improving agents.Eur Pat Apll EP 397，985(1990).]，以及用Cys(Acm)或Ala取代sCT或eCT中的1，7位Cys而形成的非環(huán)狀類似物[Orlowski R C，Epand R M，Stafford A R，et al.biologicallypotent analogues of salmon calcitonin which do not contain an N-terminaldisulfide bridged ring structure.Eur J Biochem，1987，162(2)399.]都保持活性。天然降鈣素的穩(wěn)定性差，其中在溶液中的不穩(wěn)定性與二硫鍵的不穩(wěn)定性有關(guān)且天然降鈣素的來源也很有限。因此尋找合成簡(jiǎn)單，成本低廉，穩(wěn)定性好并同時(shí)具有與天然降鈣素活性基本相同的降鈣素類似物，是十分必要的。
本發(fā)明的目的是尋找易人工合成且保持有天然降鈣活性的降鈣素類似物。
本發(fā)明者經(jīng)廣泛深入研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具下面通式(I)的新降鈣素類似物，其不僅合成簡(jiǎn)單，而且保持了與天然降鈣素基本相同的活性。本發(fā)明因此得以完成。
因此，本發(fā)明第一方面涉及的是新的不含二硫鍵的通式(I)sCT及eCT類似物。
AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-Y-Thr-Pro-NH2(I)
其中AA1，AA2可相同或不同且為選自Ala，Val，Leu，lle，Gly，Phe，Met，Trp的天然非極性氨基酸，條件是AA1和AA2不能同時(shí)為Ala；m，n＝0，1；X＝-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-；Y為選自Gly，Ala，D-Ala，Sar的氨基酸殘基。其中在通式(I)中，主要是用一些天然非極性氨基酸殘基，如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(lle)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)等取代天然sCT和eCT中1，7位的半胱氨酸(Cys)，形成不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚的降鈣素類似物。新的通式(I)類似物的結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有的含二硫鍵及非環(huán)狀類似物相比，結(jié)構(gòu)變化除了1，7位Cys殘基被取代外，30位的Gly殘基也可用Ala，D-Ala及Sar等取代，以改變C-端肽鍵的特性，有利于肽的酶穩(wěn)定性。有些通式(I)中類似物由于缺失某些氨基酸殘基(Ser2，Leu19，Gln20，Thr21，Tyr22)，其氨基酸序列可縮短。
本發(fā)明第二方面涉及的是通式(I)降鈣素類似物的制備方法。該方法按固相合成方法進(jìn)行。該方法包括采用固相合成方法以BHA或MBH作固相載體，氨基酸的α-氨基用Fmoc保護(hù)，首先將Fmoc-Pro與樹脂偶聯(lián)，然后通過DCC/HOBt復(fù)合縮合劑依次接肽，接肽完成后，先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合試劑脫除側(cè)鏈保護(hù)基，再用HF把肽從BHA或MBHA樹脂上切下。
sCT及eCT的類似物都采用固相法(SPPS)合成。文獻(xiàn)報(bào)道中的CT類似物的合成一般是采用對(duì)甲基二苯甲基氨基樹脂(MBHA)或二苯甲基氨基樹脂(BHA)為固相載體，氨基酸的α-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)的合成路線，肽合成完后，一次用無水HF脫除側(cè)鏈保護(hù)基及把肽從樹脂上切下[Orlowski R C，Seyler J K，Stahl G L，et al.Analogs ofcalcitonin.US Pat 4,604,238(1986).]本發(fā)明合成方法中固相載體采用的是MBHA或BHA，氨基酸的α-氨基用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作保護(hù)基，一些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)用對(duì)酸敏感的保護(hù)基作保護(hù)，例如絲氨酸(Ser)，蘇氨酸(Thr)和纈氨酸(Tyr)的側(cè)鏈羥基，以及谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的側(cè)鏈羧基都用叔丁基(But)酯保護(hù)；賴氨酸(Lys)的ε-氨基用叔丁氧羰基(Boc)保護(hù)，組氨酸(His)的咪唑基用三苯甲基(Trt)保護(hù)；精氨酸(Arg)的側(cè)鏈胍基用4-甲氧-2，3，6-三甲基-苯磺?；?Mtr)保護(hù)。
氨基酸的縮合反應(yīng)采用1-羥基苯并三氮唑(HOBt)活化酯方法完成，縮合是否完全通過茚三酮方法檢驗(yàn)。
接肽完成后，首先和TFA/三甲基溴硅烷(TMSBr)/苯甲硫醚(8∶1.5∶2，v/v/v)處理全保護(hù)肽以脫除側(cè)鏈保護(hù)基，再用無水氟化氫(HF)把肽從樹脂上切下。
從樹脂上切下的肽粗品經(jīng)冷凍干燥后，先用葡聚糖凝膠色譜柱(Sephadex G-25)脫鹽，再用HPLC進(jìn)一步純化。
本發(fā)明中的合成方法，特別是采用先脫除側(cè)鏈保護(hù)基再把肽從樹脂上切下的二步“脫保護(hù)/切除”方法，使合成的產(chǎn)物純度高，總產(chǎn)率提高很大。
本發(fā)明再一方面涉及的本發(fā)明通式(I)天然降鈣素類似物用于降低包括人等哺乳動(dòng)物的血鈣濃度，及用于治療與哺乳動(dòng)物中高血癥有關(guān)的癥狀或疾病，如骨質(zhì)疏松癥，Paget’s癥及骨痛等。本發(fā)明式(I)降鈣素在實(shí)驗(yàn)中顯示出在水溶液中良好的穩(wěn)定性及良好的降鈣活性。表1是三個(gè)肽在大鼠體內(nèi)測(cè)得的降鈣活性。
表1肽 降鈣活性(lU/mg) 降鈣活性95％可信度(lU/mg)sCT 4726 3418～6446[Val1，Ala7]sCT 4331 3114～5829[Val1，Ala7，Ala30]sCT 5053 4128～6191[Val1，Ala7，des19-22]sCT 3327 2454～4247在本說明書及權(quán)利要求書中，氨基酸及其它縮寫詞的縮寫如下說明Ser絲氨酸，Asn天門酰胺，Leu亮氨酸，Thr蘇氨酸Val纈氨酸，Gly甘氨酸，Lys賴氨酸，Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸，His組氨酸，Tyr酪氨酸，Pro脯氨酸Arg精氨酸，Ile異亮氨酸，Phe苯丙氨酸，Met蛋氨酸Try色氨酸，Sar氮甲基甘氨酸或N-甲基甘氨酸(文中除表明為D-氨基酸外，其它氨基酸的構(gòu)型都為L(zhǎng)-構(gòu)型)DCM二氯甲烷 DMFN，N-二甲基甲酰胺MeOH甲醇 TFA三氟乙酸 DIPEA二異丙基乙胺DCCN，N’-二環(huán)己基碳二亞胺 HoBt1-羥基苯駢三氮唑HPLC高效液相色譜 HF氟化氫 FAB-MS快原子轟擊質(zhì)譜下面的實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明但不意味著對(duì)本發(fā)明有任何限制。
實(shí)施例1[Val1，Ala7]sCT的固相合成A.Fmoc-Pro與MBHA樹脂的連接1.0g MBHA樹脂(0.55mmol/g)放入肽反應(yīng)器中，依次經(jīng)過下列處理1.洗DCM，12ml，2×1分鐘。
2. 5％DIPEA/DMF，10m，2×5分鐘。
3.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM，12ml，4×1分鐘。
4.加入556.7mg(1.65mmol)Fmoc-Pro，用8ml的DMF溶解，在0-5℃加入340.0mg(1.65mmol)DCC的4ml DCM溶液，在0-5℃反應(yīng)1小時(shí)后，在室溫振搖6小時(shí)。
5.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM/MeOH(1/1)，15ml，1分鐘；DCM，12ml，3×1分鐘。
6.加入2ml 5％DIPEA/DMF，1ml醋酐，8ml DCM，室溫反應(yīng)2小時(shí)7.洗同上述3。B.固相接肽縮合反應(yīng)A
1. 25％哌啶/DMF，8ml，2×15分鐘。
2.洗DMF，12ml，2×1分鐘；DCM，12nl，3×1分鐘。
3. 1.65mmol Fmoc保護(hù)氨基酸溶于8ml DMF，在0-5℃下加入223.0mg(1.65mmol)的HOBt，溶解后再加入340.0mg(1.65mmol)DCC溶于4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分鐘，再于室溫放置10分鐘后，加入反應(yīng)器中，在室溫振搖2小時(shí)。
4.洗DMF，12ml，1分鐘；DCM/MeOH(1/1)，12ml，1分鐘；DCM，12ml，3×1分鐘。
5.茚三酮檢測(cè)，若為陽性，繼續(xù)用縮合反應(yīng)B縮合一次。
縮合反應(yīng)B1. 0.8mmol Fmoc保護(hù)氨基酸溶于6ml DMF中，在0-5℃下加入108.0mg(0.8mmol)的HOBt，溶解后再加入165.0mg(0.8mmol)DCC溶于4ml DCM的溶液。以上混合溶液在0-5℃放置10分鐘，再于室溫放置10分鐘后，加入反應(yīng)器中，在室溫振搖2小時(shí)。
2.同縮合反應(yīng)A中4。
3.茚三酮檢測(cè)，若為陽性，繼續(xù)用縮合反應(yīng)B再縮合一次。
表2是合成[Val1，Ala7]sCT所需的氨基酸及縮合反應(yīng)類型表2氨基酸序號(hào)氨基酸 分子量 氨基酸用量 縮合mmol mg 反應(yīng)32 Fmoc-L-Pro-MBHA 0.55 1000.031，27，25 Fmoc-L-Thr(But) 397.51.65 655.9A30，28 Fmoc-L-Gly297.31.65 490.5A29 Fmoc-L-Ser(But) 383.41.65 632.6A26 Fmoc-L-Asn354.41.65 584.8A24 Fmoc-L-Arg(Mtr).lPE 608.71.65 1000.0 A23 Fmoc-L-Pro337.41.65 556.7A22 Fmoc-L-Tyr(But)459.31.65757.8A0.80367.4B21，6Fmoc-L-Thr(But)397.51.65655.9A0.80318.0B20，14 Fmoc-L-Gln 368.41.65607.9A0.80294.7B19，16，12，9，4 Fmoc-L-Leu 353.41.65583.1A0.80282.7B18，11 Fmoc-L-Lys(Boc)468.61.65773.2A0.80374.9B17 Fmoc-L-His(Trt)619.71.651022.5 A0.80495.8B15 Fmoc-L-Glu(OBut) 425.51.65702.1A0.80340.4B13，5，2 Fmoc-L-Ser(But)383.41.65632.6A0.80306.7B10 Fmoc-L-Gly 297.31.65490.5A0.80237.8B8，1 Fmoc-L-Val 339.41.65560.0A0.80271.5B7Fmoc-L-Ala 311.31.65513.6A0.80249.0B3Fmoc-L-Asn 354.41.65584.7A0.80283.5BC.側(cè)鏈保護(hù)基的脫除接肽完成后，首先用25％的哌啶DMF溶液脫除N-端Fmoc基團(tuán)，用DMF和DCM洗滌。在-5-0℃冷卻下加入冷至0℃的TFA/TMSBr/苯甲硫醚(8/1.5/2，v/v/v)混合溶液20-30ml，45分鐘后抽濾除去，依次用DCM，MeOH，DMF，DCM洗。D.肽從樹脂上的切下1.0g脫除側(cè)鏈保護(hù)基的樹脂，放入HF裂解器中，加入1ml苯甲醚，在-5-0℃下通入無水HF10-12ml，于0-5℃攪拌45分鐘后減壓抽去HF，用冷的無水乙醚洗。用30ml的20％醋酸分三次洗樹脂，再用水洗，合并醋酸與水的濾液，冷凍干燥。E.肽的純化鑒定100mg經(jīng)HF裂解下的粗肽，用5ml去離子水溶解，上Sephadex G-25柱(1.5×120cm)，用0.2N的醋酸洗脫。用紫外檢測(cè)，波長(zhǎng)214nm。收集流出組分，冷凍干燥。
以上純化的肽，再用反相HPLC方法純化分析鑒定[HPLC系統(tǒng)Waters 600E泵；C18柱(7u，8×250，大連物化所)；SP UV1000檢測(cè)儀，紫外波長(zhǎng)214nm；SP Data-Getintegrator記錄儀；流動(dòng)相A-0.1％TFA/H2O，B-70％CH3CN/H2O(0.1％TFA)，梯度B在20分鐘內(nèi)由0％升至60％，10分鐘內(nèi)再降至0％]。經(jīng)HPLC純化的肽，經(jīng)FAB-MS鑒定，分子離子峰為3398.5(M+1)，肽的理論分子量為3397.8。大鼠體內(nèi)降鈣活性測(cè)定藥品劑量取7.2和18mU/100g的兩個(gè)劑量組，皮下注射給藥。用2.2法隨機(jī)及交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組10只雄性大鼠，給藥前禁食17小時(shí)，給藥后1小時(shí)取血離心，取血清測(cè)定血鈣，比較供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的血鈣下降程度，計(jì)算生物效價(jià)和可信限。具體實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[Findlay DM，MichelangeliVP，Orlowski RC.biological activities and receptor interactions of des-leu16salmon and des-phe16human calcitonin，Endocrinology，1983；1121288.錢德明，沈根全，柯若倫。用大鼠血鈣法測(cè)定降鈣素生物效價(jià)的探討，藥物分析雜志，1994；4(3)30.]方法完成。結(jié)果見表1所示。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)為通式(I)的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物AA1-(Ser)m-Asn-Leu-Ser-Thr-AA2-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-1 7Gln-Glu-Leu-His-Lys-(Leu-Gln-Thr-Tyr)n-Pro-Arg-Thr-X-Y-Thr-Pro-NH2(I)30其中AA1，AA2為選自Ala，Val，Leu，lle，Gly，Phe，Met，Trp的天然非極性氨基酸，條件是AA1和AA2不能同時(shí)為Ala，m，n＝0，1；X＝-Asn-Thr-Gly-Ser-或-Asp-Val-Gly-Ala-；Y為選自Gl，Ala，D-Ala，Sar的氨基酸殘基
2.制備權(quán)利要求1要求的通式(I)降鈣素類似物的方法，包括采用固相合成方法，以BHA或MBH為固相載體，氨基酸的α-氨基用Fmoc保護(hù)，首先將Fmoc-Pro與樹脂偶聯(lián)，然后通過DCC/HOBt復(fù)合縮合劑依次接肽，接肽完成后，先用TFA/TMSBr/苯甲硫醚混合試劑脫除側(cè)鏈保護(hù)基，再用HF把肽從BHA或MBHA樹脂上切下。
3.權(quán)利要求1的降鈣素類似物用于降低血鈣濃度。
4.權(quán)利要求1的降鈣素類似物用于治療骨質(zhì)疏松癥，Paget’s癥，骨痛及各種高血鈣癥等。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)新的不含二硫鍵的鮭魚和鰻魚降鈣素類似物及其制備方法，其降低血鈣的作用以及用于治療骨質(zhì)疏松癥、Paget’s癥、骨痛及各種高血鈣癥等。
文檔編號(hào)A61K38/23GK1167114SQ97110848
公開日1997年12月10日 申請(qǐng)日期1997年4月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月30日
發(fā)明者楊彬, 丁振闿, 韓宗進(jìn), 董華進(jìn), 李必海, 馬秀英 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所