專利名稱：一種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系以及酚紅新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種無(wú)血清培養(yǎng)體系的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于ー種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系以及酚紅新用途。
背景技術(shù)：
隨著神經(jīng)生物學(xué)的進(jìn)展以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能及其機(jī)制研究的需求，已經(jīng)由經(jīng)典的大體(整體)動(dòng)物的研究，發(fā)展到多層次的包括離體組織(腦片)以及細(xì)胞(培養(yǎng)神經(jīng)元)立體研究模式。作為ー種相對(duì)簡(jiǎn)單的神經(jīng)元研究體系，應(yīng)用體外培養(yǎng)神經(jīng)元的研究模式已被廣泛應(yīng)用。但是，為了很好的研究神經(jīng)元的功能特性，體外神經(jīng)元培養(yǎng)中應(yīng)盡量保持其功能狀態(tài)的正常生理特征一一接近在整體狀態(tài)下的生理特征。整體動(dòng)物電生理研究海馬神經(jīng)元電 活動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元在正常靜息狀態(tài)下其動(dòng)作電位絕大多數(shù)以單個(gè)動(dòng)作電位的形式發(fā)放，或有少數(shù)的連續(xù)兩個(gè)動(dòng)作電位的發(fā)放。但在正常情況下，未發(fā)現(xiàn)其動(dòng)作電位呈現(xiàn)ー種成簇樣爆發(fā)式發(fā)放(bursting)，其被認(rèn)為與神經(jīng)元的病理狀態(tài)相關(guān)，如癲癇式大發(fā)放。因此，在體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中，應(yīng)通過(guò)完善其培養(yǎng)體系而使培養(yǎng)海馬神經(jīng)元具有自發(fā)單個(gè)動(dòng)作電位的發(fā)放，而不應(yīng)存在動(dòng)作電位的成簇樣發(fā)放。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用無(wú)血清培養(yǎng)方式，使用商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基進(jìn)行體外海馬神經(jīng)元培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)神經(jīng)元中有大量神經(jīng)元呈現(xiàn)類癲癇樣大發(fā)放的異常放電狀態(tài)一既成簇樣爆發(fā)式發(fā)放(bursting)。而這種異常動(dòng)作電位的發(fā)放對(duì)神經(jīng)元的功能及其胞內(nèi)生理環(huán)境都會(huì)帶來(lái)異樣改變，既非生理狀態(tài)。本發(fā)明進(jìn)一歩發(fā)現(xiàn)在含有酚紅的無(wú)血清培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的類癲癇樣大發(fā)放的異常放電狀態(tài)顯著減少或消失，而此種作用是通過(guò)酚紅的類雌激素特性，作用于培養(yǎng)神經(jīng)元的雌激素受體上實(shí)現(xiàn)的。體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元對(duì)其培養(yǎng)環(huán)境中的酸堿度也異常敏感，而酚紅作為ー種對(duì)酸堿度敏感的化合物，離體海馬神經(jīng)元培養(yǎng)體系中作為PH指示劑被廣泛的添加，以顯示神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境中的酸堿度變化。酚紅與雌激素具有相類似的組織結(jié)構(gòu)，在最近的研究中也已發(fā)現(xiàn)酚紅具有類雌激素樣活性。而雌激素作為ー種重要的性激素，不僅對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，其對(duì)成熟神經(jīng)元的電活動(dòng)也有影響，可以改變神經(jīng)元的興奮性。神經(jīng)元的電活動(dòng)是神經(jīng)元功能的重要指標(biāo)，當(dāng)神經(jīng)元出現(xiàn)異常放電,是其功能異常的表示。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN :101245335公開(kāi)了ー種無(wú)血清植物蛋白肽通用細(xì)胞培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基含有酚紅。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN =101418330公開(kāi)了適于NSO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及抗體生產(chǎn)的無(wú)蛋白培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基含有酚紅。但是關(guān)于培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系。本發(fā)明的再一目的是，提供一種酚紅新用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，所述的無(wú)血清培養(yǎng)體系中的酚紅大于21. 5微摩爾，小于等于30微摩爾。所述的神經(jīng)元為海馬神經(jīng)元。所述的酚紅為28-30微摩爾。所述的酚紅為28微摩爾。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
酚紅在制備預(yù)防、治療海馬神經(jīng)元異常放電性疾病藥物中的應(yīng)用。所述的疾病是癲癇病。所述的酚紅劑量為大于21. 5微摩爾，小于等于30微摩爾。所述的酚紅為28-30微摩爾。本發(fā)明是通過(guò)闡明酚紅在神經(jīng)元培養(yǎng)體系中除了其pH改變指示劑的功能外，還具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放功能的作用的特性，通過(guò)優(yōu)化酚紅在離體神經(jīng)元培養(yǎng)體系中的濃度，為離體神經(jīng)元培養(yǎng)提供最佳的培養(yǎng)環(huán)境，從而使培養(yǎng)神經(jīng)元能維持最佳的生理狀態(tài)與功能。本實(shí)驗(yàn)主要涉及酚紅的類雌激素樣活性作用，其在培養(yǎng)體系中通過(guò)模擬雌激素活性作用，從而影響培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的功能性電活動(dòng)，其不同的濃度與培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的異常電活動(dòng)直接相關(guān)。體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，其正常狀態(tài)下可以出現(xiàn)單個(gè)的動(dòng)作電位，但當(dāng)其出現(xiàn)PDS也即當(dāng)神經(jīng)元膜電位去極化達(dá)到IOmV以上且持續(xù)300ms以上，并有連續(xù)5個(gè)動(dòng)作電位的發(fā)放，在持續(xù)記錄10 — 20min的時(shí)間內(nèi)，有2個(gè)以上的PDS的出現(xiàn)，我們認(rèn)為此培養(yǎng)海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)ー種異常的癲癇樣放電。這種異常放電與正常生理狀態(tài)不同而與病理狀態(tài)(如癲癇狀態(tài)下)類似，因此是ー種異常狀態(tài)，而在離體神經(jīng)元培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)與避免。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在同樣的培養(yǎng)環(huán)境下，采用無(wú)血清培養(yǎng)模式，當(dāng)給予無(wú)酚紅與有酚紅的培養(yǎng)基進(jìn)行海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)時(shí)，無(wú)酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具有異常放電的海馬神經(jīng)元占大多數(shù)(>84%)，且其非PDS樣放電頻率也明顯增加?？紤]到酚紅具有類雌激素樣活性的作用，而雌激素本身對(duì)神經(jīng)元的電活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用，因此，我們認(rèn)為酚紅也可能具有調(diào)節(jié)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元電活動(dòng)的作用。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們給與不同濃度的酚紅與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)，然后使用膜片鉗電生理技術(shù)，記錄海馬神經(jīng)元電活動(dòng)情況。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們?cè)谂囵B(yǎng)基中分別加入10、30、60、100、200 ii M的酚紅后發(fā)現(xiàn)酚紅對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的PDS樣異常電活動(dòng)呈現(xiàn)ー種劑量相關(guān)性的U-形調(diào)節(jié)作用。在所應(yīng)用的酚紅劑量中，30 y M達(dá)到了最佳的對(duì)神經(jīng)元異常放電的抑制作用，且神經(jīng)元放電的頻率以及持續(xù)時(shí)間也較對(duì)照商業(yè)購(gòu)買(mǎi)含21. 5 ii M酚紅培養(yǎng)基的低。30 ii M酚紅對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電的抑制可以被雌激素受體拮抗劑所抑制說(shuō)明酚紅是通過(guò)作用與雌激素受體起作用的。進(jìn)ー步的數(shù)理計(jì)算得到酚紅對(duì)神經(jīng)元異常放電的抑制作用最佳濃度在28 PM，比本研究對(duì)照購(gòu)買(mǎi)的商業(yè)化培養(yǎng)基所含酚紅(21. 5 PM)要高。因此，本發(fā)明首先闡述了酚紅在培養(yǎng)基中，其不僅僅是作為ー種PH指示劑，且其不同的劑量濃度對(duì)神經(jīng)元的正常動(dòng)作電位的發(fā)放功能具有劑量相關(guān)的調(diào)節(jié)作用；其次，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基中所含的酚紅濃度并非是維持培養(yǎng)神經(jīng)元功能的最佳濃度，而28 y M的酚紅將對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元正常動(dòng)作電位的維持具有最佳作用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在干
I、第一次提出酚紅不僅僅是ー種細(xì)胞培養(yǎng)體系中的PH指示劑，其模擬雌激素樣作用可對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電起到抑制作用；
2、由于目前商業(yè)出售的含酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基中，由于未考慮酚紅的類雌激素作用而并非添加最佳酚紅濃度，本發(fā)明將通過(guò)改變其酚紅添加濃度從現(xiàn)有的無(wú)規(guī)則的(15或45 y M)至28 u M的酚紅，從而在不改變其作為pH指示劑的作用下，使其對(duì)維持體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元生理功能至最佳狀態(tài)。本發(fā)明的延伸作用是使酚紅添加濃度為28 y M的培養(yǎng)基應(yīng)用至所有的神經(jīng)元培養(yǎng)體系中，并進(jìn)一歩延伸到所有的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，因此極具商業(yè)價(jià)值。3、本發(fā)明對(duì)酚紅發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。4、本發(fā)明的酚紅安全無(wú)毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。5、酚紅對(duì)海馬神經(jīng)元異常放電的抑制作用是通過(guò)雌激素受體產(chǎn)生的。


圖I正常含酚紅培養(yǎng)基與無(wú)酚紅培養(yǎng)基對(duì)神經(jīng)元異常放電影響。圖2酚紅對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電劑量依賴性U-shape調(diào)節(jié)作用，其中圖中a為給與不同濃度的酚紅與海馬神經(jīng)元共同孵育(10,30,60,100,200 u M) 14天，記錄神經(jīng)元自發(fā)放電情況；圖中b為不同濃度的酚紅與海馬神經(jīng)元共同孵育，記錄神經(jīng)元自發(fā)放電次數(shù)；圖中c為通過(guò)數(shù)理模擬曲線統(tǒng)計(jì)得出酚紅對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元異常放電作用的IC50。圖3正常酚紅與最佳酚紅濃度對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電影響。圖4酚紅作用可被雌激素受體拮抗劑阻斷。圖5雌激素對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電劑量依賴性U-shape調(diào)節(jié)作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I
一、實(shí)驗(yàn)材料和方法
(一)實(shí)驗(yàn)材料和儀器設(shè)備
水合氯醛國(guó)藥集團(tuán)，上海
酌 紅(phenol red) :Sigma,美國(guó)
B27 :Invitrogen,美國(guó)
DMEM without phenol red: Gibco,美國(guó)
Neurobasa丄 with phenol red: Gibco, ^15
Neurobasa丄 without phenol red: Gibco,美國(guó)
GlutaMax Invitrogen ,美國(guó)
ICI 182780 : Sigma，美國(guó)
Axopatch 700B 放大器Axon,美國(guó)
Axon Digidata 1440A數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)Axon,美國(guó)
PClamp 10. 3數(shù)據(jù)采集分析軟件Axon,美國(guó)
(ニ)海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)
取孕17-19的SD大鼠，10%水合氯醛(0. 15ml/100g)麻醉母鼠后，V字型剪開(kāi)腹部，取出胚胎，迅速將取出的大鼠胚胎放入冰冷的解剖液里，并在冰上操作將胚胎海馬分離。然后將分離的海馬在37°C環(huán)境下用胰蛋白酶消化15-20分鐘，用含血清的培養(yǎng)基D12F終止酶反應(yīng)，D12F清洗酶溶液3-4次(IOOOrpm, Imin,小心吸取上清，勿接觸組織塊)，最后一次清洗時(shí)用移液管或Iml移液槍加入IOml左右D12F，并輕輕吹打至懸浮液中無(wú)組織塊，自然沉降
2-3min。小心吸取上清液至另ー干凈15ml離心管中(注意管底可剰余部分懸液，以防吸入大塊組織)，以D12F清洗兩遍(lOOOrpm，8min)，棄去上清，加入2ml D12F培養(yǎng)液重懸，小心吸打，避免傷害細(xì)胞。最后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，井根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求種植相應(yīng)密度的細(xì)胞細(xì)胞用于記錄其自發(fā)放電活動(dòng)。次日以及3天后，1/2換液。大約6天后，檢查膠質(zhì)細(xì)胞是否鋪滿玻片，若鋪滿則用含Ara-C培養(yǎng)基換液，48小時(shí)后用NB27換液去除Ara_C。此后，每隔3天1/2換液，每次換液需提前把NB27放進(jìn)培養(yǎng)箱孵育(約2小吋)，每次換液同時(shí)加入所需濃度的酚紅或雌激素。(三)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)不同濃度酚紅共同孵育14天后，膜片鉗記錄神經(jīng)元電活動(dòng)
培養(yǎng)細(xì)胞使用Leica公司的倒置相差顯微鏡，通過(guò)肉眼直接在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯 微操作。所有實(shí)驗(yàn)均采用Axonpatch 700B膜片鉗放大器，Digital 1440A數(shù)據(jù)采集卡采集數(shù)據(jù)，記錄電極使用Sutter公司的毛坯電極，由P97微電極拉制儀拉制而成，充灌好電極內(nèi)液后阻抗為2-6MQ。實(shí)驗(yàn)前先選取胞體清亮，折光性好的錐體形健康細(xì)胞。在電極入水之前，先給予一定的正壓，防止入水后電極尖端被堵，接近選定細(xì)胞后撤走正壓使電極與細(xì)胞形成高阻封接(>1 GQ )，同時(shí)給予-70 mV的鉗制電壓，利于細(xì)胞的封接，待高阻封接穩(wěn)定之后再次給予適當(dāng)?shù)呢?fù)壓，將細(xì)胞吸破，形成全細(xì)胞記錄狀態(tài)。記錄細(xì)胞自發(fā)電位時(shí)，在電流鉗模式下，將細(xì)胞膜電位鉗制在-70mV左右，連續(xù)記錄至少10分鐘以上為有效記錄數(shù)據(jù)。神經(jīng)元發(fā)生異常電活動(dòng)被定義為在10分鐘的記錄時(shí)間內(nèi)發(fā)生至少ニ個(gè)及以上的持續(xù)時(shí)間在300毫秒(ms)以上的、興奮性去極化電位(EPSP)達(dá)到IOmV以上的、且在此去極化電位上至少有5個(gè)動(dòng)作電位發(fā)放的電活動(dòng)(圖I)。實(shí)驗(yàn)后對(duì)記錄的神經(jīng)元中發(fā)生異常放電的比例，發(fā)生異常放電的神經(jīng)元中的異常放電的特性(頻率、時(shí)程等)進(jìn)行數(shù)理分析統(tǒng)計(jì)。ニ、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(一)酚紅對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元異常自發(fā)動(dòng)作電位的抑制作用(I)無(wú)酚紅與含酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)海馬神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)元自發(fā)動(dòng)作電位的影響體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下，分別使用含酚紅的培養(yǎng)基與不含酚紅的培養(yǎng)基(Neurobasal, Gibco)共同培養(yǎng),14天培養(yǎng)海馬神經(jīng)元成熟后,分別使用膜片鉗電生理檢測(cè)神經(jīng)元自發(fā)放電情況。研究結(jié)果顯示在無(wú)酚紅的培養(yǎng)模式下，培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元有異常放電的比例占大多數(shù)，達(dá)到所記錄神經(jīng)元的顯著的84% 16/19)，顯著高于含酚紅商業(yè)培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元比例21% (5/24) (p<0. 01)(見(jiàn)圖I)。(2)酚紅對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電呈劑量相關(guān)性U-shape調(diào)節(jié)作用
我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)了酚紅對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電具有調(diào)節(jié)作用，那么，酚紅的這種作用與其濃度是否相關(guān)，以及如何相關(guān)有待研究。在隨后的研究中，我們給與不同濃度的酚紅與海馬神經(jīng)元共同孵育(10、30、60、100、200iiM) 14天，記錄神經(jīng)元自發(fā)放電。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酚紅對(duì)于培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的異常放電呈現(xiàn)劑量依賴性的U-shape樣調(diào)節(jié)作用。30 ii M的酚紅濃度為達(dá)到最強(qiáng)抑制效率，而10以及60、100、200iiM的酚紅的抑制效率都低于30yM的酚紅(圖2)。通過(guò)數(shù)理模擬曲線統(tǒng)計(jì)得出酚紅對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元異常放電作用的IC50 (0-30 ii M間)為14uM,EC50 (30-200 y M間)為45 y M，而其計(jì)算獲得的最佳抑制濃度為28 u Mo(3)商業(yè)購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)基所含酚紅與無(wú)酚紅培養(yǎng)基添加30 ii M酚紅的比較
在本研究中商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基(Neurobasal，Gibco)，其所含酚紅濃度為21. 5 PM。我們認(rèn)為其所包含的酚紅只是作為ー種PH指示劑添加，而忽略了其對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞功能性上的作用。而本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，酚紅對(duì)于培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的異常放電具有劑量依賴性的調(diào)節(jié)作用，因此，商業(yè)化培養(yǎng)基在添加酚紅是未考慮該因素。那么其所添加的酚紅濃度未必是合適的，因此，其培養(yǎng)基中所包含的酚紅濃度可能需要調(diào)整。我們比較了 21.5UM與30yM濃度的作用結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，30uM的酚紅濃度更加適合維持體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元正常生理功能不僅30 y M的酚紅培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電比例較21. 5 y M酚紅培養(yǎng)的神經(jīng)元要低(P〈0. 01);且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其仍有異常放電的神經(jīng)元中，30 u M培養(yǎng)環(huán)境下異常放電神經(jīng)元(n=2)，其異常放電頻率(0. 008Hz)以及異常放電持續(xù)時(shí)間(0. 067±0. 227s)較21. 5M培養(yǎng) 環(huán)境下(n=5)的異常放電頻率(0. 031 ±0. 008Hz)及持續(xù)時(shí)間(I. 242±0. 353s)要顯著降低(圖3)。(ニ)機(jī)制研究
(I)雌激素受體拮抗劑ICI 182780阻斷酚紅對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元異常放電的抑制作用
為了進(jìn)一歩明確酚紅對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元異常放電的抑制作用機(jī)制是否是通過(guò)其類雌激素樣作用產(chǎn)生的，我們將30 ii M的酚紅與非特異性雌激素受體拮抗劑ICI 182780 (IOOnM)共同孵育，發(fā)現(xiàn)其對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電的抑制作用被阻斷。30 PM的酚紅培養(yǎng)條件下，神經(jīng)元異常放電比例為10%(2/21)，而與拮抗劑共同孵育后，其神經(jīng)元異常放電比例為80% (12/15) (P<0. 001)(見(jiàn)圖4)。因此我們認(rèn)為酚紅這種對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電的抑制作用是通過(guò)雌激素受體產(chǎn)生的。(2)雌激素對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電呈劑量依賴性U-shape調(diào)節(jié)作用
我們的進(jìn)一歩機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元異常放電也具有調(diào)節(jié)作用。在不同濃度的170-雌ニ醇雌激素(0. I, 0.3，lng/ml)與海馬神經(jīng)元共同孵育14天后，記錄神經(jīng)元自發(fā)放電。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素對(duì)培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的異常放電也具有劑量依賴性的U-shape樣調(diào)節(jié)作用(見(jiàn)圖5)，與酚紅作用相一致，進(jìn)ー步說(shuō)明酚紅是與雌激素的作用相同。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的無(wú)血清培養(yǎng)體系中的酚紅大于21. 5微摩爾，小于等于30微摩爾。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的神經(jīng)元為海馬神經(jīng)元。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的酚紅為28-30微摩爾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的酚紅為28微摩爾。
5.酚紅在制備預(yù)防、治療海馬神經(jīng)元異常放電性疾病藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疾病是癲癇病。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的酚紅劑量為大于21.5微摩爾，小于等于30微摩爾。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的酚紅為28-30微摩爾。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)神經(jīng)元的含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系，所述的無(wú)血清培養(yǎng)體系中的酚紅大于21.5微摩爾，小于等于30微摩爾。本發(fā)明還提供了酚紅在制備預(yù)防、治療海馬神經(jīng)元異常放電性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明闡明了培養(yǎng)海馬神經(jīng)元(及其任何類型培養(yǎng)神經(jīng)元)中，雌激素受體的激活對(duì)維持其正常生理功能是必需的；在含酚紅無(wú)血清培養(yǎng)體系中，酚紅的最佳濃度是28微摩爾(μM)，而非現(xiàn)有商業(yè)提供的無(wú)血清培養(yǎng)體系中無(wú)規(guī)則的15或45微摩爾(μM)。
文檔編號(hào)A61P25/08GK102757937SQ201210231048
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者劉旭, 汪昕, 王云 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院