專利名稱：多靶標(biāo)干擾核酸分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多靶標(biāo)干擾核酸分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默效應(yīng)，是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA識別有同源序列的信使RNA (messenger RNA,mRNA)， 對其特異性切割，從而阻斷其翻譯的過程。與傳統(tǒng)的抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸技術(shù)和核酶技術(shù)相比，小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默基因表達(dá)的效果要強大數(shù)十倍至數(shù)百倍，現(xiàn)已被證實在多種病毒感染性疾病和腫瘤的治療中具有極大的潛力，是理想的阻斷基因表達(dá)的治療手段。RNAi發(fā)揮基因沉默作用的機制是長雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，與Dicer酶結(jié)合并被切割。Dicer酶的切割產(chǎn)物通常是長度為20_2^ρ，且在每個鏈的3’末端有兩個核苷酸懸垂的siRNA。siRNA與RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合， RISC首先介導(dǎo)siRNA雙鏈的解旋并與siRNA雙鏈中的一條鏈，通常是反義鏈偶聯(lián)。裝載有 siRNA —條鏈的RISC以序列特異的方式尋找識別與之匹配的mRNA，之后由RISC的催化組分-Argonaute蛋白切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻譯，最終抑制轉(zhuǎn)錄該mRNA的基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)開辟了一個全新的治療領(lǐng)域。其中應(yīng)用siRNA治療老年黃斑變性，呼吸道合胞病毒以及急性腎衰等疾病已進(jìn)入臨床試驗階段。其他可能的臨床應(yīng)用主要集中在抗病毒治療方面，包括沉默HIV的宿主受體的表達(dá)，沉默甲型肝炎，乙型肝炎和丙型肝炎基因的表達(dá)，沉默流感基因表達(dá)以及抑制麻疹病毒的復(fù)制等。RNAi也有望用于神經(jīng)組織退化型疾病，如亨廷頓氏舞蹈病的治療。此外，RNAi通過沉默腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)的基因或在細(xì)胞分裂中起作用的基因為癌癥的治療提供了一個新方向。引發(fā)RNAi效應(yīng)的dsRNA可設(shè)計成能被Dicer剪切的長雙鏈形式，叫做Dicer底物， 或者是不需Dicer剪切可直接作為RISC底物的短siRNA形式。在哺乳動物細(xì)胞中，由于長 dsRNA引發(fā)非特異反應(yīng)，導(dǎo)致干擾素效應(yīng)。因此，普遍認(rèn)為應(yīng)用于哺乳動物時，干擾RNA雙鏈必須短于30bp以抑制干擾素效應(yīng)。但是，設(shè)計長雙鏈干擾RNA用于RNAi仍有實用價值。長干擾RNA雙鏈可帶有多個治療靶標(biāo)，靶向多個不同的mRNA或同一 mRNA的不同位點，增加基因沉默效果，擴大應(yīng)用范圍。以腫瘤的治療為例，由于腫瘤是一種多基因疾病，它的發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，因此，單一癌基因的抑制不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，單靶標(biāo)治療有其局限性。那么，研發(fā)多靶標(biāo)、無干擾素反應(yīng)的長干擾核酸雙鏈，同時抑制多個癌基因的表達(dá)，多層次、多途徑治療腫瘤，可能有效提高治療效果， 成為治療腫瘤的新策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所公開的組合物及其作用過程需要通過干擾核酸雙鏈實現(xiàn)，該干擾核酸的反義鏈靶向到兩個或多個mRNA、或靶向到兩個或多個微小RNA(microRNA，miRNA)、或靶向到兩個或多個mRNA或miRNA的子序列，并且該干擾核酸不引起體內(nèi)的干擾素反應(yīng)。在一個實施例中，該多靶標(biāo)干擾核酸由不連續(xù)的反義鏈和連續(xù)的正義鏈組成，其中反義鏈靶向兩個或多個不同基因的mRNA或同一基因mRNA的兩個或多個不同位點，且轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中不會引起長雙鏈核酸誘發(fā)的干擾素效應(yīng)。在另一實施例中，該多靶標(biāo)干擾核酸的正義鏈不連續(xù)而反義鏈連續(xù)，且反義鏈靶向兩個或多個不同基因的mRNA或同一基因mRNA的兩個或多個不同位點。轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中不會引發(fā)干擾素效應(yīng)。本發(fā)明提供了一種干擾核酸分子，該干擾核酸分子由含一個5’末端和一個3’末端部分的正義鏈與含一個5’末端和一個3’末端部分的反義鏈退火而成。其中，反義鏈至少含兩個部分，一個部分靶向第一個RNA，反義鏈的另一個部分靶向第二個RNA，或者反義鏈的一個部分靶向某一 RNA的第一個部分，反義鏈的另一個部分靶向同一 RNA的第二個部分。該干擾核酸在轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后不引發(fā)干擾素反應(yīng)。本發(fā)明還公開了一種由兩條或多條正義鏈與兩條或多條反義鏈組成的多靶標(biāo)干擾核酸分子。其中，反義鏈與正義鏈退火以產(chǎn)生干擾核酸分子，在反義鏈上至少有一個缺刻或一個核苷酸缺口，同時在正義鏈上至少有一個缺刻或一個核苷酸缺口，每條反義鏈靶向不同的mRNA或一個mRNA的不同位點，并且至少一條正義鏈靶向一個mRNA，且上述干擾核酸分子長度至少為30-80個核苷酸。這種不連續(xù)的干擾核酸分子結(jié)構(gòu)不會引起哺乳動物細(xì)胞的干擾素效應(yīng)。通常，干擾核酸分子由一條反義鏈和一條正義鏈組成，分子的總長度至少為30個核苷酸，且干擾核酸分子的任意一條鏈或兩條鏈上有一個或多個缺刻或缺口，將正義鏈或反義鏈分割成多段。長度在30個核苷酸之上的雙鏈RNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞質(zhì)后會引發(fā)干擾素反應(yīng)，但應(yīng)用這種分段的正義鏈或反義鏈構(gòu)成的長干擾核酸卻沒有激發(fā)哺乳動物細(xì)胞的干擾素反應(yīng)。本發(fā)明還提供了利用多靶標(biāo)干擾核酸分子下調(diào)或沉默多個目的基因表達(dá)的方法， 有望在抑制、緩解或減輕病情或防止某些疾病癥狀的復(fù)發(fā)方面比單靶標(biāo)SiRNA取得更顯著的治療效果。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，多靶標(biāo)干擾核酸分子能夠同時抑制多個靶基因的表達(dá)， 或者靶向一個基因的多個位點，基因沉默效果優(yōu)于單靶標(biāo)siRNA。此外，雖然該干擾核酸分子長度大于30bp，但由于結(jié)構(gòu)特殊，并未引起干擾素效應(yīng)，可應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明公開的多靶標(biāo)干擾核酸分子是一種新的siRNA的應(yīng)用形式，在對疾病的基因治療方面可能有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1是實時定量PCR檢測各實驗組Survivin基因的mRNA表達(dá)量柱形圖。圖2是實時定量PCR檢測各實驗組Bcl-2基因的mRNA表達(dá)量柱形圖。圖3是實時定量PCR檢測各實驗組干擾素相關(guān)基因OASl的mRNA表達(dá)量柱形圖。圖4是實時定量PCR檢測各實驗組干擾素相關(guān)基因IFNi3 1的mRNA表達(dá)量柱形圖。圖5是WST-8法檢測各實驗組膀胱癌TM細(xì)胞的生長曲線圖。圖6是轉(zhuǎn)染了不同干擾核酸分子后TM細(xì)胞生長的抑制率柱形圖。
具體實施例方式本發(fā)明中術(shù)語的定義應(yīng)該用來解釋包含沒有詳述的此領(lǐng)域中相關(guān)的術(shù)語，并非是對本發(fā)明進(jìn)行限制。本發(fā)明中術(shù)語干擾核酸是指有正義和反義鏈的核苷酸雙鏈，能夠在進(jìn)入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)后誘導(dǎo)靶RNA酶降解。一般情況下，每條鏈大部分是RNA核苷酸，但可以包含RNA類似物、RNA和RNA類似物、RNA和DNA、RNA類似物和DNA，或一條鏈與DNA互補且一條鏈?zhǔn)情L度與干擾核酸結(jié)構(gòu)相同的RNA，誘導(dǎo)同源靶RNA酶降解。本發(fā)明中術(shù)語“干擾核酸”包括小干擾核酸、能夠在體內(nèi)切割成小干擾核酸的發(fā)卡核酸。干擾核酸還包括能在細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄本形成干擾核酸分子或發(fā)卡干擾核酸的表達(dá)載體(也指干擾核酸表達(dá)載體)，或該轉(zhuǎn)錄本能夠在體內(nèi)產(chǎn)生小干擾核酸分子。該干擾核酸分子包括可形成發(fā)卡環(huán)或雙鏈干擾核酸的單鏈。干擾核酸是一種由互補的正義和反義鏈組成的雙鏈多聚核苷酸分子，該反義鏈包含一段或部分與一種調(diào)節(jié)表達(dá)的靶基因核苷酸分子互補的核苷酸序列。正義鏈或反義鏈帶有一個或多個缺刻或缺口。干擾核酸的末端結(jié)構(gòu)可以是平端或粘性末端(懸垂)，且該干擾核酸能夠沉默靶RNA。粘性末端結(jié)構(gòu)不局限于3’端懸垂，還包括能夠產(chǎn)生RNA干擾效應(yīng)的5’端懸垂結(jié)構(gòu)。而且，核苷酸的懸垂的數(shù)量不局限于2或3，可以是能夠誘導(dǎo)RNA干擾效應(yīng)的任意數(shù)量。本發(fā)明中的干擾核酸分子的長度是由從雙鏈的正義鏈起始5’端的第一個堿基開始計算至正義鏈3’端的最后一個堿基。miRNA是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的21_23個核苷酸長度的單鏈RNA分子。miRNA由從DNA 轉(zhuǎn)錄的基因編碼，但不翻譯成蛋白質(zhì)(非編碼RNA) ；miRNA形成過程是由稱做pri-miRNA原始轉(zhuǎn)錄本加工成pre-miRNA的短莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最終形成功能性的miRNA。成熟的miRNA分子部分互補到一個或多個mRNA分子，它們的主要功能是下調(diào)基因的表達(dá)。修飾的核苷酸可以在一條干擾核酸反義鏈、正義鏈或正、反義兩條鏈中。在本領(lǐng)域中有很多實施例說明在核苷酸中引入糖、堿基和磷酸修飾可以顯著增加核酸酶穩(wěn)定性和有效性。如，修飾寡核苷酸的核酸酶耐受基團(tuán)來增強穩(wěn)定性和/或增強生物學(xué)活性，如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-甲氧基、2’-氧-烯丙基、2’-氫的核苷酸喊基修飾(Usman禾口Cedergren，TIBS 17 :34，1992 ；Usman等，Nucleic Acids Symp. Ser. 31 163，1994 ；Burgin 等，Biochemistry 35 14090，1996)。核苷酸分子糖修飾(Perrault 等， Nature 344 :565-568,1990 ；Pieken 等，Science 253 :314-317,1991 ；Usman 禾口 Cedergren， Trends in Biochem. Sci. 17 :334-339,1992 ；BurIina 等，Bioorg. Med. Chem. 5 1999-2010， 1997)。雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過自身互補形成干擾核酸分子，可以由發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA或兩條獨立互補的干擾核酸鏈來退火形成。本發(fā)明中術(shù)語“多靶標(biāo)”是指干擾核酸分子的反義鏈靶向到兩個或多個mRNA、或靶向到兩個或多個微小RNA (microRNA, miRNA)、或靶向到兩個或多個mRNA或miRNA的子序列。 “單靶標(biāo)”是指干擾核酸分子的反義鏈靶向到一個mRNA、或靶向到一個微小RNA(microRNA， miRNA)、或一個mRNA或miRNA的子序列?！獥l核酸鏈上的缺刻是指將一條核酸鏈上兩個核苷酸間的磷酸二酯鍵斷開。
在一些具體實施例中，干擾核酸分子包括獨立的正義或反義鏈，該正義或反義鏈通過核苷酸或非核苷酸接頭共價連接，或者通過離子反應(yīng)、氫鍵結(jié)合、范德華力、疏水反應(yīng)或疊加反應(yīng)進(jìn)行非共價結(jié)合。干擾核酸分子可以由兩條獨立的寡核苷酸組合成雙鏈，其中一條鏈?zhǔn)钦x鏈，另一條是反義鏈，且正義鏈或反義鏈自身互補。(例如，每條鏈含有與另一條鏈上核苷酸互補的核苷酸序列；如形成雙鏈上或雙鏈結(jié)構(gòu)的反義鏈和正義鏈，雙鏈的長度至少為30個核苷酸)。反義鏈可以包含與靶核苷酸互補或部分互補的核苷酸序列，正義鏈可以包含與靶序列一致或部分一致的核苷酸序列?？蛇x擇地，干擾核酸分子可以由一條單個寡核苷酸鏈組成， 其中干擾核酸分子的正義或反義鏈由核苷酸或非核苷酸的接頭連接。干擾核酸分子可以包含一個核苷酸的、非核苷酸的、或核苷酸/非核苷酸混合的接頭，用來連接正義和反義鏈。在一些具體實施例中，一種核苷酸接頭的長度可以為3、 4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。一種非核苷酸接頭可以為一種脫堿基核苷酸、聚醚、多胺、 聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)、碳?xì)渚酆衔?、或其它多聚體復(fù)合物(如，聚乙二醇，如在其間有 2-100 個聚乙二醇單位)(Seela 和 Kaiser, Nucleic Acids Res. 18 :6353,1990，和 Nucleic Acids Res. 15 :3113,1987 ；Cload 禾口 Sch印artz，J. Am. Chem. Soc. 113 :6324,1991 ； Richardson禾口 Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 113 :5109,1991 ；Ma等，Nucleic Acids Res. 21 2585,1993,禾口 Biochemistry 32 :1751,1993 ；Durand φ, Nucleic Acids Res. 18 :6353, 1990 ；McCurdy 等，Nucleosides & Nucleotides 10 :287,1991 Jschke 等，Tetrahedron Lett. 34 :301,1993 ；Ono 等，Biochemistry 30 :9914,1991)。一種“非核苷酸接頭”是指能摻入到一條核苷酸鏈替換一個或多個核苷酸單位的一種基團(tuán)和復(fù)合物，包括糖和磷酸基團(tuán)替代物，且能保持堿基的酶活性。這種基團(tuán)或復(fù)合物可以是脫堿基的，可以不包含通常的識別核苷酸堿基，如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，如在糖環(huán)的Cl位上。術(shù)語“核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及形成單鏈或雙鏈的它們的聚合物。該術(shù)語中核苷酸包括熟知的核苷酸類似物或修飾的后鍵殘基或連接，可以是人工合成的、天然的和非天然的，含有與核苷酸類似的結(jié)合性質(zhì)和新陳代謝性質(zhì)。術(shù)語“RNA”是指一種至少包含一個核糖核苷酸殘基的分子。“核糖核苷酸”是指在 β -D呋喃核糖基團(tuán)的2’位上有一個羥基基團(tuán)的核苷酸。該術(shù)語包含雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA，如部分純化的RNA、完全純化的RNA、合成的RNA、重組體產(chǎn)生的RNA，可以通過添加、刪除、替換或改變一個或多個核苷酸來改變RNA，使其不同于天然的RNA。這些改變可以包括添加非核苷酸原料，如添加在干擾核酸的末端或中間，如RNA的一個或多個核苷酸。本發(fā)明的RNA分子的核苷酸也可以包括非標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化學(xué)合成的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些改變的RNA可以是類似物或天然RNA的類似物。本發(fā)明中術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”是指一種分子包含至少一個核糖核苷酸殘基。核糖核酸是一種在β-D呋喃核糖基團(tuán)的2’位上有一羥基基團(tuán)的核苷酸。這些術(shù)語包括雙鏈RNA、單鏈 RNA、分離的RNA如部分純化的RNA、完全純化的RNA、合成的RNA、重組產(chǎn)生的RNA，可以通過添加、刪除、替換或改變一個或多個核苷酸來改變RNA，使其不同于天然的RNA。這些改變可以包括添加非核苷酸原料，如添加在干擾核酸的末端或中間，如在RNA分子的一個或多個核苷酸包含非標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸，如非天然核苷酸或化學(xué)合成核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可以是類似物。
本發(fā)明中互補核苷酸堿基是指通過氫鍵互相連接一對核苷酸堿基。腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶配對或與RNA中尿嘧啶配對，鳥嘌呤與胞嘧啶配對?；ハ嚯s交(通過氫鍵結(jié)合)的互補片段或核苷酸鏈?！盎パa”是指一條核苷酸鏈與另一條核苷酸鏈可以通過Watson-Crick 法則或其它非常規(guī)結(jié)合方式形成氫鍵。干擾核酸分子的正義鏈上可以有一個末端帽基團(tuán)，如在正義鏈的3’端、5’端、或 3’端和5’端上有脫氧脫堿基基團(tuán)?！懊弊咏Y(jié)構(gòu)”是指化學(xué)修飾的，可以摻入到寡核苷酸任一末端。這些末端修飾可以保護(hù)核苷酸分子免受核酸外切酶降解，可以幫助在細(xì)胞中傳輸和定位。帽子結(jié)構(gòu)可以位于 5’ -末端(5’ -帽)或在3’ -端(3’ -帽)或同時存在于兩個末端。本發(fā)明中“發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)”是指一種線性的干擾核酸分子，其包含一條反義片段、由核苷酸或非核苷酸組成的一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)、及由核苷酸少于反義片段且與其互補的核苷酸正義片段組成，正、反義片段可以互補與莖環(huán)形成雙鏈。本發(fā)明中干擾核酸組合物可以和其它已知的治療成份一起注射來治療疾病。本發(fā)明的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合于相應(yīng)疾病的給藥、并且恰當(dāng)?shù)乇３指蓴_核酸分子的活性。比如，對于注射用給藥系統(tǒng)，劑型可以是凍干粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３指蓴_核酸分子的活性。本發(fā)明中的干擾核酸可以以任何形式給藥，如經(jīng)皮膚或局部注射。本發(fā)明中組合物的劑型可以是口服給藥的片劑、膠囊或酏劑，可以是直腸給藥的栓劑，可以是注射給藥的滅菌溶液、懸液，或是其它在本領(lǐng)域中知曉的劑型。下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進(jìn)行限制。實施例1構(gòu)建針對Survivin基因和Bcl_2基因的多靶標(biāo)干擾核酸分子Survivin和Bcl_2基因是在惡性腫瘤細(xì)胞中廣泛高表達(dá)的，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。研究發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的Survivin或Bcl-2基因，恢復(fù)其正常的凋亡通路可能是治療腫瘤的新策略。因此，選取Survivin和Bcl_2基因為多靶標(biāo)干擾核酸分子的靶基因，作為具體實施方式
進(jìn)行說明。靴向人源Survivin 基因 siRNA 為 si_S 正義鏈5，-GACUUGGCCCA⑶⑶UUCUdTdT-3，(SEQID 1)反義鏈5，-AGAAACACUGGGCCAAGUCdTdT-3，(SEQID :2)靶向人源Bcl-2基因的siRNA序列為si-Β 正義鏈5，-GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3，(SEQID :3)反義鏈5，-UUCAGGUACUCA⑶CAUCCdTdT-3，(SEQID4)用序列SEQ ID 1-2退火成雙鏈si_S，結(jié)構(gòu)如下(SEQID 1)5’ -GACUUGGCCCA⑶⑶UUCUdTdT-3’3， -dTdTCUGAACCGG⑶CACAAAGA-5，(SEQ ID 2)用序列SEQID :3_4退火成雙鏈si-Β，結(jié)構(gòu)如下
(SEQ ID 3)5’ -GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3’3’ -dTdTCCUACUGACUCAUGGACUU-5，(SEQ ID 4)實施例2一種干擾核酸分子包含一條正義鏈和兩條反義鏈，反義鏈的5’端靶向到Bcl-2基因的mRNA，3，端革巴向到Survivin基因的mRNA。序列如下正義鏈5，-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3，(SEQID 5)反義鏈AGAAACACUGGGCCAA⑶C(SEQ ID 6)UUCAGGUACUCA⑶CAUCC(SEQ ID 7)用序列SEQ ID :5_7退火成干擾核酸雙鏈Sub-IjnT (SEQ ID 5)5’ -GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3’3’ -CUGAACCGG⑶CACAAAGA CCUACUGACUCAUGGACUU-5，(SEQ ID 6)(SEQ ID 7)實施例3一種干擾核酸分子包含兩條正義鏈和一條反義鏈，正義鏈的5’端靶向到 Survivin基因的mRNA，3，端靶向到Bcl_2基因的mRNA。Sub-2結(jié)構(gòu)如下正義鏈GACUUGGCCCA⑶⑶UUCU(SEQID 8)GGAUGACUGAGUACCUGAA(SEQ ID 9)反義鏈5，-UUCAGGUACUCA⑶CAUCCAGUAGAAACACUGGGCCAA⑶C-3，(SEQ ID 10)用序列SEQ ID 8-10退火成干擾核酸雙鏈Sub_2，如下(SEQ ID 8)(SEQ ID 9)5' -GACUUGGCCCAGUGUUUCU GGAUGACUGAGUACCUGAA-3‘3’ -CUGAACCGG⑶CACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5，(SEQ ID 10)實施例4一種干擾核酸分子含一條正義鏈和一條反義鏈。正義鏈5，-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3，(SEQID 11)反義鏈5，-UUCAGGUACUCA⑶CAUCCAGUAGAAACACUGGGCCAA⑶C-3，(SEQID 12)用序列SEQ ID :11-12退火成干擾核酸雙鏈SubUnT (SEQ ID 11)5 ’ -GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3 ’3’ -CUGAACCGG⑶CACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5，(SEQ ID 12)實施例5
對干擾核酸分子進(jìn)行2’ -甲氧基修飾，在保持干擾核酸分子活性的同時提高其穩(wěn)定性。修飾后的結(jié)構(gòu)如下所示，其中加粗標(biāo)記并下劃線標(biāo)記的為2’ -甲氧修飾堿基。干擾核酸分子si-S-m結(jié)構(gòu)如下(SEQ ID 13)5' -GACUUGGCCCAGUGUUUCUdTdT-3‘3' -dTdTCUGAACCGGGUCACAAAGA-5‘(SEQ ID 14)干擾核酸分子si-B-m結(jié)構(gòu)如下(SEQ ID 15)5' -GGAUGACUGAGUACCUGAAdTdT-3‘3' -dTdTCCUACUGACUCAUGGACUU-5‘(SEQ ID 16)干擾核酸分子Sub-4結(jié)構(gòu)如下(SEQ ID 17)5' -GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3'3' -CUGAACCGGGUCACAAAG CCUACUGACUCAUGGACUU-5‘(SEQ ID: 18)(SEQ ID :19)干擾核酸分子Sub-5結(jié)構(gòu)如下(SEQ ID 20)(SEQ ID 21)5' -GACUUGGCCCAGUGUUUCU GGAUGACUGAGUACCUGAA-3‘3，-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACU-5，(SEQ ID 22)干擾核酸分子Sub-6結(jié)構(gòu)如下(SEQ ID 23)5，-GACUUGGCCCAGUGUUUCUACUGGAUGACUGAGUACCUGAA-3，3，-CUGAACCGGGUCACAAAGAUGACCUACUGACUCAUGGACUU-5，(SEQ ID 24)實施例6干擾核酸分子的轉(zhuǎn)染所有干擾核酸分子由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成，退火后的干擾核酸分子純度大于95%，用無核酸酶水溶解后可直接用于轉(zhuǎn)染。同時用與哺乳動物基因無同源性的 siRNA作為陰性對照，序列為正義鏈5，-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶dTdT-3，(SEQID :25)反義鏈5，-AC⑶GACACGUUCGGAGAAdTdT-3，(SEQID :26)人膀胱癌細(xì)胞系TM用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的T24細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天鋪6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)整每孔的細(xì)胞數(shù)， 使第二天細(xì)胞匯合度達(dá)到30% -40%。轉(zhuǎn)染設(shè)置12組，分別為
權(quán)利要求
1.一種多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，由正義鏈和反義鏈退火形成，每條鏈的長度至少為30個核苷酸，其正義鏈或反義鏈的至少一個部分，分別靶向不同基因的RNA或同一基因的RNA的不同位點，該多靶標(biāo)干擾核酸分子轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后不會引起干擾素效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，由一條正義核苷酸鏈和至少兩條反義鏈退火形成，其中反義鏈之間上存在核苷酸缺刻或長度為1-20個核苷酸的核苷酸缺口。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，由至少兩條正義核苷酸鏈和一條反義鏈退火形成，其中正義鏈上存在核苷酸缺刻或長度為1-20個核苷酸的核苷酸缺口。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，正義鏈有至少一個缺刻或核苷酸缺口，反義鏈有至少一個缺刻或核苷酸缺口，所述的核苷酸缺口的長度為1-20個核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，含有至少一個核糖環(huán)2’ 位羥基的取代修飾或核糖環(huán)結(jié)構(gòu)修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，所述的RNA是信使RNA或微小RNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，含有0-2個核苷酸的3’突出端。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，正義鏈和反義鏈通過發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸在末端相連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多靶標(biāo)干擾核酸分子，其特征在于，正義鏈的5’末端與反義鏈的3’末端通過發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸相連接或是正義鏈的3’末端與反義鏈的5’末端通過發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸相連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多靶標(biāo)干擾核酸分子及其應(yīng)用。該干擾核酸分子由一條反義鏈和一條正義鏈組成，雙鏈的總長度至少為30個核苷酸，且在正義鏈上或反義鏈上或正、反義鏈兩條鏈上存在核苷酸缺刻或缺口。該干擾核酸的任意一條鏈可以靶向至少兩個靶RNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，并且該干擾核酸不引起干擾素反應(yīng)。
文檔編號A61P35/00GK102191246SQ201010521988
公開日2011年9月21日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者唐小軍, 孫云成, 彭薇, 朱遠(yuǎn)源, 王晉康, 陸毅祥 申請人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司