專利名稱：柳杉醇在制備抗腫瘤血管異常新生藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤和抗血管新生化合物領(lǐng)域，特別涉及柳杉醇在制備抗腫瘤及抑制血管異常新生藥物中的新應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來癌癥的發(fā)病率和死亡率急劇 上升，已成為威脅我國居民健康和生命的第一殺手。目前治療癌癥的主要手段有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療，其中手術(shù)治療很難除掉所有癌細(xì)胞，放射治療對部分腫瘤細(xì)胞不敏感以及副作用較大，化學(xué)治療對全身所有細(xì)胞都有毒害影響，所以這些方法在腫瘤治療運(yùn)用方面受到了很大的限制。近年來，在藥物研究領(lǐng)域致力于尋找一類對腫瘤細(xì)胞有特異性殺傷作用且副作用較小的藥物。因此，從中藥材中分離制備得到新的抗腫瘤藥物成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。云南鼠尾草(5為唇形科鼠尾草屬植物,近年來被廣泛用作丹參(5心的替代物，其主要成分與丹參類似?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，云南鼠尾草的提取物具有明顯的抗腫瘤作用，目前主要報道了丹參酮類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖有抑制作用，對于鼠尾草中其他化學(xué)成分在抗腫瘤血管異常新生方面的作用鮮有報道。柳杉醇(sugiol)為松香烷型二萜，分子式C2tlH28O2，分子量300，CAS: 511-05-7，曾經(jīng)從柳杉中被成功分離得到，為已知化合物，但是對于其抗腫瘤血管新生的藥理活性的研究沒有相關(guān)報道。近年來，隨著對癌癥、視網(wǎng)膜病變以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)理的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血管新生是一個引發(fā)此類疾病的關(guān)鍵生理步驟，所以血管新生抑制劑的研究也成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)，目前，比較常見的血管新生抑制劑主要為化學(xué)藥，如地非三唑、普利等；也有部分是來自于生物來源，如肽類、外源色素上皮衍生因子等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種柳杉醇的新醫(yī)藥用途，即柳杉醇在制備抗腫瘤血管異常新生藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中所述柳杉醇分子式C2tlH28O2，分子量300，CAS: 511-05-7，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
OH. J6J12 1 /
Ah ￥#P_I SUgd
本發(fā)明中所述柳杉醇作為抗腫瘤血管新生藥物的主要活性成分或與其他活性成分配合使用制成藥物，作為血管新生抑制劑來治療癌癥。所述藥物包括制藥領(lǐng)域常用的各種劑型，可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋齊 、粘合劑、賦形劑、吸收促進(jìn)劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、色素和甜味劑等，制成膠囊齊 、丸齊 、粉劑、片齊 、粒劑、口服液和注射液等多種形式。本發(fā)明中使用的柳杉醇是從中藥材云南鼠尾草中分離得到柳杉醇單體，也可以從其它植物來源或者通過合成方法制備得到柳杉醇。
本發(fā)明中以MTT法進(jìn)行抗腫瘤作用的篩選，結(jié)果顯示經(jīng)柳杉醇處理的人肝癌細(xì)胞(H印G-2)，在加藥濃度為O. 5、I. 0,2. 5,5. O、10. Oug/mL時與不加藥對照組比較，細(xì)胞增殖活性有明顯下降，說明柳杉醇能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。以雞胚尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑制血管新生的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度(5. O、10. O、15. Oug/mL)柳杉醇處理的雞胚尿囊膜與不加藥對照組比較，其血管新生受到明顯的抑制，說明柳杉醇有明顯抑制血管新生的作用。以上實(shí)驗(yàn)證明柳杉醇是有效的抗腫瘤劑和抗血管異常新生藥物，療效明確，安全性高，適于實(shí)際推廣利用。


圖I為本發(fā)明從云南鼠尾草中分離柳杉醇的工藝流程示意圖。圖2為本發(fā)明柳杉醇作用于腫瘤細(xì)胞(HepG-2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖(不同濃度柳衫醇對腫瘤細(xì)胞(HepG-2)作用后MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果)；
圖3本發(fā)明柳杉醇作用于腫瘤細(xì)胞(HepG-2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖(不同濃度柳衫醇對HepG-2細(xì)胞株增殖影響的抑制率結(jié)果)；
圖4是本發(fā)明柳衫醇對雞胚尿囊膜血管新生抑制作用結(jié)果示意圖(馬斯里酸作用于雞胚尿囊膜，經(jīng)IPP圖像處理軟件處理后抑制血管生長的實(shí)驗(yàn)結(jié)果)，圖中a生理鹽水組，b地塞米松組，c柳杉醇5 ug/mL, d柳杉醇10 ug/mL, e柳杉醇15 ug/mL ；
圖5是本發(fā)明柳衫醇對雞胚尿囊膜血管新生抑制作用結(jié)果示意圖(根據(jù)IPP圖像處理軟件計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的血管面積，然后給出各組血管面積的直觀柱狀圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但在本發(fā)明的的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例，實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件。實(shí)施例I :柳杉醇的制備(下述實(shí)施例中使用的柳杉醇是采用如下方法制備得到的)
云南鼠尾草3. 2kg用8倍質(zhì)量的丙酮超聲提取5次，獲得粗浸膏154g ;用160g層析硅膠(80-100目)拌樣，以3. Ikg 100-200目層析硅膠濕法裝柱，加入樣品，依次用純石油醚、石油醚-乙酸乙酯混合液(石油醚乙酸乙酯為9:1，8:2，7:3，I: I)洗脫，收集各部分洗脫液，減壓濃縮，對石油醚乙酸乙酯=7:3的濃縮液進(jìn)行分離，分離方法為正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯混合液(15 :1)進(jìn)行洗脫，得到柳杉醇10mg，經(jīng)過檢測得到的IH-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)與楊立新在《甘西鼠尾草中化學(xué)成分研究》一文中所述柳衫醇(sugiol)的IH-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)吻合，所以鑒定該化合物為柳杉醇。(見圖I)
1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)如下
1H NMR (400 MHz, DMSO-^
δ 0.86 (3Η, s, Me-18), 0.92 (3H, s, Me-19), I. 12 (3H, s, Me-20), I. 13(6H, d, J = 6.4 Hz, Me-16 and Me-17), I. 18 -2.48 (6H, m, H_l, H_2 and H_3)，I. 71 (1H, m, H-5), 2.48 (2H, m, H_6)，3. 13 (1H, sept, J = 6.4 Hz, H—15), 6. 78(1H, s, H-II), 7.64 (1H, s, H—14), 10.27 (1H, s, OH-12) 13C NMR (100 MHz, DMSO-Or6)
δ 37. 51 (C-I)，18. 52 (C_2)，40.88 (C_3)，32. 91 (C_4)，49.14 (C_5)，35.55(C-6), 196.64 (C_7)，122.60 (C_8)，155.91 (C_9)，39.09 (C-IO), 109.36(C-Il)，160.15(C-12), 132.57 (C-13), 125.05 (C-14), 26.10(015)，22.25 (C-16),22.42 (C-17), 32. 34 (C-18), 21. 18 (q, C-19), 23.07(020)。實(shí)施例2 :柳杉醇體外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)
取對數(shù)期的H印G-2細(xì)胞，按每孔3000個細(xì)胞的密度將對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)24h后，將柳杉醇配制成為不同濃度給藥組(O. 5,1. 0,2. 5,5. OUOug/mL)和空白對照組，每5孔為一個實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)72h，加入MTT，繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入150 μ LDMSO,震蕩Ih,于酶標(biāo)儀490nm處測吸光度A值。(見圖2、3)
結(jié)果顯示如圖2顯示當(dāng)柳杉醇濃度為5. Oug/mL和10ug/mL時MTT實(shí)驗(yàn)的吸光度明顯下降，說明腫瘤細(xì)胞增殖明顯下降；根據(jù)抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，計(jì)算出抑制率，如圖3顯示，在柳杉醇濃度為5. Oug/mL和10ug/mL時柳杉醇對于腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制作用。實(shí)施例3 :柳杉醇體內(nèi)抗血管新生作用實(shí)驗(yàn)
1、購買三天內(nèi)生產(chǎn)的新鮮種蛋，用84消毒液或是新潔爾滅對種蛋進(jìn)行表面擦拭消毒，之后將種蛋放入恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度37. 8°C，保持一定濕度(60%)，在此條件下孵育7天；
2、開窗與給藥
2. I空白對照溶液，陽性對照溶液和柳杉醇溶液的制備⑴空白對照溶液制備用空白生理鹽水作對照；⑵陽性對照溶液制備用5 mg/mL地塞米松磷酸鈉注射液作為陽性對照；⑶柳杉醇溶液制備準(zhǔn)確稱取柳杉醇I mg用無水乙醇配置成lmg/mL的母液備用,利用上述母液分別用無水乙醇稀釋配置成5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 15 μ g/mL的柳杉醇乙醇溶液冷藏備用；
2.2開窗與給藥具體操作如下(1)用75%乙醇消毒液對雞胚大頭端表面進(jìn)行消毒處理，⑵用扁角鑷子依次去除蛋殼、殼膜，暴露氣室膜，⑶用注射器和彎角鑷子分離氣室膜與尿囊膜，暴露尿囊膜組織，⑷將藥物通過載藥片給到尿囊膜上血管相對稀疏的區(qū)域；
給藥后，用透明膠帶封窗，在溫度37. 8°C，濕度(60%)的條件下培養(yǎng)48小時；
3、標(biāo)本制作與圖像采集
3.I標(biāo)本制作揭開封口透明膠帶，向給藥窗口中滴加2mL固定液(甲醇丙酮1:1)，固定IOmin后，待血管固定完全后，剝離氣室周圍的蛋殼，使給藥區(qū)域的尿囊膜充分暴露，用手術(shù)剪剪下以載體為中心的約2. 5X2. 5cm2范圍內(nèi)的尿囊膜組織，平鋪于裝有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，使其充分展開，然后將其轉(zhuǎn)移至載玻片上；
3.2圖像采集以白紙為背景，在自然光線條件下用數(shù)碼照相機(jī)進(jìn)行拍照，原位拍攝以藥物載體(載藥片)為中心的雞胚尿囊膜照片；
4、數(shù)據(jù)處理將采集的尿囊膜照片用軟件進(jìn)行圖像處理計(jì)算血管面積，之后采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，圖4為經(jīng)IPP軟件處理后增強(qiáng)對比度的照片，從圖中明顯看出，當(dāng)柳杉醇的給藥濃度為10. O、15. O ug/mL時，血管生長明顯受到抑制；圖5顯示了經(jīng)面積計(jì)算后血管面積的柱狀圖，從圖中可以看出當(dāng)給藥濃度為10.0、15.0 ug/mL，血管面積明顯下降。
權(quán)利要求
1.柳杉醇在制備抗腫瘤血管異常新生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種柳杉醇在抗腫瘤血管新生藥物中的應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)證明柳杉醇能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，對雞胚尿囊膜的新生血管有較為明顯的抑制作用，因此可以用于制備抗腫瘤血管異常新生的藥物。
文檔編號A61P35/00GK102697758SQ20121019174
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者何靜, 向誠, 莊文婷, 張林東, 戴偉鋒, 朱路平, 李寶才, 李鵬, 角仕云 申請人:昆明理工大學(xué)