專利名稱：木犀草素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木犀草素，具體涉及一種木犀草素的新用途。
背景技術(shù)：
脂肪肝現(xiàn)已成為我國(guó)發(fā)病率上升最快的慢性疾病。近年來(lái)查出脂肪肝的比例逐年上升，人群中發(fā)病率為5%，并且還有年輕化的趨勢(shì)。專家指出，40%以上肥胖人都患有脂肪肝，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、酗酒、糖尿病是致病主要因素，其他疾病也可導(dǎo)致脂肪肝，比如結(jié)核病、嚴(yán)重貧血、肺心病等；另外，某些藥物或毒物也可致脂肪肝。脂肪肝的危害很多，主要包括(1) 形成肝纖維化、肝硬化。肝細(xì)胞中脂滴增多，使肝細(xì)胞脂肪變性，長(zhǎng)期的肝細(xì)胞變性會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞再生障礙和壞死，進(jìn)而形成肝纖維化、肝硬化。(2)誘發(fā)或加重高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化。脂肪肝的病情進(jìn)展研究表明，酒精性脂肪肝患者多合并高血壓、冠心病，容易導(dǎo)致心肌梗死。(3)腦病脂肪肝綜合征。一些發(fā)生脂肪肝的肥胖者常常表現(xiàn)為惡性肥胖，這類病人極易并發(fā)致命性心腦血管疾病。(4)誘發(fā)或加重糖尿病。據(jù)調(diào)查，糖尿病患者中合并脂肪肝的約50%，脂肪肝患者中合并糖尿病的為30% 40%。(5)誘發(fā)肝癌。脂肪肝與原發(fā)性肝癌的發(fā)生雖無(wú)直接關(guān)系，但是脂肪肝的病因，如飲酒、營(yíng)養(yǎng)不良、藥物作用及有毒物質(zhì)損害等，可誘發(fā)肝癌。因此，脂肪肝也可增加肝癌的發(fā)病幾率。脂肪肝屬于肝臟代謝障礙性疾病，故是可逆的，經(jīng)合理治療后完全可以恢復(fù)正常。 現(xiàn)除飲食、運(yùn)動(dòng)療法外，多使用藥物治療，主要的治療藥物包括(1)保肝類藥物。保肝治療是大多數(shù)脂肪肝患者所不可缺少的治療措施，一經(jīng)確診脂肪肝，在病因治療及飲食療法的同時(shí)都應(yīng)輔以保肝藥物，以利于肝功能的盡快恢復(fù)。常用的保肝藥有肝太樂(lè)、維生素C、肌苷等。(2)降脂類藥物。脂肪肝患者因脂肪代謝障礙，體內(nèi)甘油三酯及膽固醇均有不同程度升高，且常伴有高脂血癥。故不可避免地需要降脂藥物，如多烯康、絞股蘭總甙、降脂靈、煙酸肌醇酯和蛋氨酸等。也可以服一些祛脂中草藥。(3)其它輔助藥物。脂肪肝患者常伴有維生素缺乏，故還應(yīng)服用維生素C、維生素B12、葉酸等，維生素C可以促進(jìn)膽固醇的分解、轉(zhuǎn)化，能加強(qiáng)肝臟去除膽固醇的作用。核黃素、吡哆酸等也有去脂作用。當(dāng)患者伴有消化道不適癥狀如惡心、食欲不振、腹脹、便秘或稀便時(shí)，可以給予對(duì)癥治療，口服酵母片等相應(yīng)的對(duì)癥藥物。目前，臨床常用降脂類藥物主要包括(1)他汀類。三甲基戊二酰輔酶A (HMG -CoA)還原酶抑制劑，即膽固醇生物合成酶抑制劑(他汀類藥物)，是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成限速酶，即HMG - CoA還原酶的抑制劑，為目前臨床上應(yīng)用最廣泛的一類調(diào)脂藥物。由于這類藥物的英文名稱均含有“statin”，故常簡(jiǎn)稱為他汀類。近年來(lái)，他汀類藥物常被被發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的毒副作用。2001年曾發(fā)生轟動(dòng)一時(shí)的“拜斯亭”事件。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局與2001 年8月9日發(fā)出緊急通知，禁止使用西立伐他汀鈉(拜斯亭)。據(jù)悉，他汀類藥上市以來(lái)，全世界僅有600萬(wàn)人用過(guò)它；而拜斯亭作為他汀類藥之一，因毒副作用過(guò)大導(dǎo)致30多個(gè)美國(guó)人失去生命。最近一段時(shí)期，國(guó)外媒體紛紛報(bào)道他汀類藥在降脂的同時(shí)，也帶來(lái)了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用。(2)貝特類。貝特類藥物的主要適應(yīng)癥為高甘油三酯血癥或以甘油三酯升高為主的混合型高脂血癥。目前臨床應(yīng)用的貝特類藥物，主要有環(huán)丙貝特、苯扎貝特、非諾貝特及吉非貝齊。據(jù)臨床實(shí)踐，這些藥物可有效降低甘油三酯22% 43%，而降低TC僅為6% 15%，且有不同程度升高高密度脂蛋白的作用。該藥的不良反應(yīng)為胃腸反應(yīng)、惡心、腹瀉，有報(bào)道長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致肝損害。(3)煙酸類。煙酸類藥物屬B族維生素，當(dāng)用量超過(guò)其作為維生素作用的劑量時(shí)，可有明顯的降脂作用。該類藥物的適用范圍較廣，可用于除純合子型家族性高膽固醇血癥，及I型高脂蛋白血癥以外的任何類型高脂血癥。但是，該藥的速釋制劑不良反應(yīng)大，一般不單獨(dú)應(yīng)用。(4)膽酸螯合劑。這類藥物也稱為膽酸隔置劑。有考來(lái)烯胺(Cholestyramine)，常用藥物有降膽寧。該藥常見(jiàn)的不良反應(yīng)為胃腸反應(yīng)、惡心、便秘或腹瀉，腸梗阻或頭痛等。(5)膽固醇吸收抑制劑。此類藥物主要通過(guò)抑制腸道內(nèi)飲食和膽汁中膽固醇的吸收，來(lái)達(dá)到降低血脂的目的。目前，該類藥物上市很少。木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中。具有多種藥理活性，如消炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病、治療“肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥”，SARS，肝炎等。但在治療脂肪肝疾病中，沒(méi)有任何研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種木犀草素的新用途，以實(shí)現(xiàn)使其在制備治療脂肪肝藥物中有廣泛的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 一種木犀草素的新用途，為在制備用于治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。一種用于治療脂肪肝的藥物，有效成分為木犀草素。木犀草素，化學(xué)名3’，4’，5，7-四羥黃酮，別名黃色黃素、黃示靈， CasNo 491-70-3，化學(xué)式=C15H10O6,分子量286. 23。物理性狀黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn) 3^-330°C。微溶于水，具弱酸性，可溶于堿性溶液中，正常條件下穩(wěn)定。木犀草素多以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高，具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。研究表明，木犀草素抑制巨噬細(xì)胞磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活性，能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、TNF-a。木犀草素還能提高 IFN- γ，降低特異性Ig-E，減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。另外，木犀草素除了抗炎、抗過(guò)敏作用以外，還具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性。本發(fā)明，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的增加， 減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來(lái)源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途。有益效果與現(xiàn)有的用于治療脂肪肝藥物相比，本發(fā)明的木犀草素類治療脂肪肝藥物具有的突出優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來(lái)源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途；具有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效


圖1是小鼠給藥干預(yù)8周后的血脂含量圖2是小鼠給藥干預(yù)8周后的肝臟中的甘油三酯含量圖； 圖3是各組小鼠的隨機(jī)血糖含量圖； 圖4是各組小鼠禁食1 后的糖耐量結(jié)果圖； 圖5是給藥干預(yù)8周后各組小鼠肝臟的特征圖6是給藥干預(yù)8周后各組小鼠肝臟的超聲影像圖(A)、肝臟中的脂質(zhì)圖(B)、肝臟中糖原圖(C)和脂肪組織圖(D);
圖7是通過(guò)western blot方法檢測(cè)脂肪酸合成的限速酶的表達(dá)結(jié)果圖； 圖8是木犀草素對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2和小鼠原代肝細(xì)胞的脂質(zhì)合成中的影響結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
(1)木犀草素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，非酒精性脂肪性肝自發(fā)性動(dòng)物模型db/db 小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物所。(2)實(shí)驗(yàn)組db/db小鼠雄性，6周齡，體重^ 33g/只；分組共18只，隨機(jī)分成 3組，每組6只。同窩陰性小鼠(C57BL/KsJ)雄性，6周齡，體重18 22g/只；分組共6只， 作為對(duì)照組。(3)給藥處理腹腔注射給藥，20mg/kg/只或100mg/kg/只，每?jī)商旖o藥一次，持續(xù)給藥6、周。(4)血樣的采集眼眥取血，置于肝素鈉抗凝的干燥0. 5ml EP管中，3000r/min，離心5min，每只小鼠每次取血清20ul，用于小鼠血脂的檢測(cè)。結(jié)果血脂含量如圖1所示，甘油三酯含量如圖2所示。db/db小鼠作為一個(gè)自發(fā)肥胖的動(dòng)物模型，血液中的膽固醇和甘油三酯是顯著性增加的。在db/db小鼠連續(xù)給藥干預(yù)后，進(jìn)行的血脂的常規(guī)檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)木犀草素可以減少血液中膽固醇和甘油三酯的增加，同時(shí)也阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來(lái)源。(5)血糖的測(cè)定通過(guò)尾靜脈微創(chuàng)采血，采用雅培安妥血糖儀進(jìn)行小鼠血糖的檢測(cè)。測(cè)量隨機(jī)血糖結(jié)果如圖3所示。由于db/db小鼠是自發(fā)高血糖模型，過(guò)度攝取含糖量較高的食物也會(huì)導(dǎo)致肥胖。通過(guò)檢測(cè)木犀草素對(duì)db/db小鼠血糖的作用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明木犀草素可以增加葡萄糖的攝取，而這部分?jǐn)z入體內(nèi)的葡萄糖以糖原的形式貯存在肝臟內(nèi)， 并沒(méi)有大量的轉(zhuǎn)化為脂肪，而對(duì)照組小鼠結(jié)果相反。(6)腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)腹腔注射2g/kg葡萄糖的方法，分別監(jiān)測(cè)注射后 0、15、30、60和120min時(shí)的小鼠血糖的變化情況。糖耐量結(jié)果如圖4所示。在持續(xù)給藥過(guò)程中，通過(guò)小動(dòng)物B超儀也多次觀測(cè)活體內(nèi)脂肪肝的發(fā)展情況，同時(shí)在給藥8周時(shí)，取出小鼠的肝臟和脂肪進(jìn)行了切片檢測(cè)和肝臟蛋白western檢測(cè)。(7)小鼠肝臟的B型超聲成像選用VEV02100小動(dòng)物超聲儀進(jìn)行活體脂肪肝的實(shí)時(shí)診斷與監(jiān)測(cè)；
(8)肝臟的油紅0和蘇木素的復(fù)合染色先用D-hanks將樣本細(xì)胞或者組織切片沖洗充分，然后加入油紅稀釋染色1(Γ15分鐘，接下來(lái)用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質(zhì)清
5晰，然后蒸餾水沖，最后再用蘇木素對(duì)細(xì)胞核部分進(jìn)行復(fù)染，并于100倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機(jī)選取5 10視野進(jìn)行拍照觀察以考察脂質(zhì)積累的效果。(9)肝臟的糖原顏色肝臟標(biāo)本切片，以過(guò)碘酸-Schiff氏法(PAS)行肝糖原染色， 鏡下觀察切片，以每組樣本隨機(jī)選取5 10視野進(jìn)行拍照觀察以考察肝臟中糖原的含量。(10)脂肪組織的蘇木素-伊紅(HE)染色將脂肪組織切片至于60°C烘箱4 ，95% 酒精固定，蘇木素染色15min后，進(jìn)行鹽酸酒精分化，室溫返藍(lán)lOmin，伊紅染色5min，脫水， 封片。(Il)Western bolt 將取出的新鮮肝臟標(biāo)本，放人液氮中，轉(zhuǎn)至_80°C保存。用組織裂解法提取蛋白后-20°C保存，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)量蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用 39 g/L濃縮膠、100 g/L分離膠，上樣量50 μ g，蛋白Marker 5 μ L，電壓60 V待蛋白跑出濃縮膠后調(diào)至120 V，電泳結(jié)束后取出凝膠，用Quantity One軟件分析光密度值。在持續(xù)給藥過(guò)程中，通過(guò)小動(dòng)物B超儀多次觀測(cè)活體內(nèi)脂肪肝的發(fā)展情況，同時(shí)在給藥8周時(shí)，取出小鼠的肝臟和脂肪進(jìn)行了切片檢測(cè)和肝臟蛋白western檢測(cè)。給藥干預(yù)8周后各組小鼠肝臟的特征圖如圖5所示，給藥干預(yù)8周后各組小鼠肝臟各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)如圖6所示，其中A圖為超聲影像，B圖為肝臟中的脂質(zhì)，C圖為肝臟中糖原，D圖為脂肪組織；通過(guò)western blot方法檢測(cè)小鼠肝臟中脂肪合成相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖7所示；各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木犀草素可以減少db/db小鼠肝臟中的脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)和脂肪堆積，顯著性的改善自發(fā)性的脂肪肝。實(shí)施例2
原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將C57BL/KsJ小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉處理，從小鼠的門靜脈插管并且間斷下腔靜脈后，以2ml/min流速灌入Kreb溶液，待肝臟內(nèi)的血液沖洗干凈后，繼續(xù)以anl/min流速灌入膠原酶IV 30ml。待肝臟充分消化后，將組織塊剪碎，加入DMEM完全培養(yǎng)液50ml終止消化并且充分混勻，以200目篩子過(guò)濾。以50G/min 離心5min，濃縮肝細(xì)胞。為了在細(xì)胞水平觀察到較為明顯的脂肪積累，預(yù)先采用了肝臟X受體激動(dòng)劑 T0901317對(duì)H印G2細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行處理，在處理4 后，進(jìn)行了蘇木素-油紅染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，激動(dòng)劑T1317可以激活肝臟X受體的活性，上調(diào)下游的脂肪酸合成相關(guān)基因，從而使細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的含量增加。但在觀察過(guò)程中， 經(jīng)過(guò)木犀草素和激動(dòng)劑T1317共同處理的細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量明顯少于T1317處理組。說(shuō)明了木犀草素可以減少肝臟細(xì)胞中的脂質(zhì)合成。與現(xiàn)有的預(yù)防與治療脂肪肝的藥物相比，天然化合物木犀草素具有明顯的優(yōu)勢(shì)， 藥效明顯、毒副作用小。
權(quán)利要求
1.木犀草素在制備用于治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
2.一種用于治療脂肪肝的藥物，其特征在于有效成分為木犀草素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種木犀草素的新用途，該新用途為在制備用于治療脂肪肝藥物中的應(yīng)用。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來(lái)源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途；具有很好的實(shí)用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102552238SQ20111043087
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者吳越, 孫玉潔, 朱云霞, 韓曉, 高璐 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)