專利名稱：一種提高畜禽免疫功能的甘草次酸納米脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法，及其提高畜禽免疫功能的應(yīng)用，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘草是一味最常用的補(bǔ)氣藥，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥等功效，在多種疾病防治中起到重要作用。甘草次酸作為甘草的主要有效成分，主要從甘草的根部或根莖提取而得，屬五環(huán)三萜皂苷類化合物?，F(xiàn)代研究表明甘草次酸具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、腎上腺皮質(zhì)激素樣作用等多種藥理作用。但由于甘草次酸難溶于水，常規(guī)的給藥方式，如口服、皮下注射、靜脈注射等，甘草次酸幾乎不能被吸收，生物利用度非常低，這樣大大降低了甘草次酸的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，甘草次酸會(huì)產(chǎn)生鈉潴留、鉀流失、高血壓等不良副作用，而且這些副作用可能存在劑量依賴關(guān)系。因而，研究甘草次酸新劑型，提高其生物利用度，減小其不良副作用就變得非常必要。脂質(zhì)體是由類脂質(zhì)制備的具有復(fù)層或單層單位膜結(jié)構(gòu)的小囊，其結(jié)構(gòu)類似生物膜，在體內(nèi)能生物降解。由于脂質(zhì)體成份為磷脂和膽固醇，也是生物細(xì)胞膜的主要成分，屬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，具有良好的生物相容性和可降解性，無毒、無免疫原性。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和生物細(xì)胞相似，易被細(xì)胞吸附、融合、脂交換、內(nèi)吞而被細(xì)胞攝取；且具有一定的彈性和變形性，比相同粒徑的其他類型的納米粒容易進(jìn)入病灶組織。因此，脂質(zhì)體已成為現(xiàn)代藥物載體研究的內(nèi)容之一。同時(shí)脂質(zhì)體還可用作免疫佐劑，早在1974年由Allison等首次報(bào)道脂質(zhì)體能增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對疫苗的增效作用可達(dá)數(shù)十倍甚至更高。脂質(zhì)體具有靶向釋藥、 緩釋、無免疫原性、降低藥物毒副作用等優(yōu)勢。脂質(zhì)體是微米級(jí)類脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，大小于I οομπι之間。如果在脂質(zhì)體的類脂質(zhì)雙分子層中加入適當(dāng)表面活性劑，則可形成納米脂質(zhì)體。納米脂質(zhì)體除粒徑小于普通脂質(zhì)體外，還具有高度的自身變形性，更易于提高其生物利用度。如將甘草次酸包封于脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體不僅可以避免甘草次酸的不良副作用，而且可以有效維持甘草次酸在機(jī)體內(nèi)的有效濃度，提高了其生物利用度。因而脂質(zhì)體可以作為甘草次酸的一種優(yōu)良載體。本發(fā)明首次將甘草次酸制備成納米脂質(zhì)體，并將其和動(dòng)物疫苗一起應(yīng)用，建立了甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法，優(yōu)化了制備條件，發(fā)現(xiàn)甘草次酸納米脂質(zhì)體能顯著提高甘草次酸的免疫增強(qiáng)作用，提高其生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對甘草次酸水溶性低、不易被吸收、易產(chǎn)生不良反應(yīng)，生物利用度低等問題，提供一種甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法，達(dá)到顯著提高甘草次酸免疫增強(qiáng)作用目的，并應(yīng)用于畜禽臨床。技術(shù)方案
用薄膜分散法及響應(yīng)面法設(shè)計(jì)甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法。經(jīng)優(yōu)化后甘草次酸納米脂質(zhì)體最佳制備方法為:稱取大豆磷脂150mg、膽固醇60mg、吐溫-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振搖使之充分溶解。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，后加入磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗脫至薄膜完全溶解，經(jīng)水浴超聲20min，形成納米脂質(zhì)體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質(zhì)體置于-20°C條件下凍結(jié)，之后置于31°C水浴中融化，如此反復(fù)操作兩次。按此方法制備的甘草次酸納米脂質(zhì)體，平均包封率為83.46%、粒徑在150nm以下。將甘草次酸納米脂質(zhì)體和疫苗一起應(yīng)用于雞，能顯著提高其細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能，對提高畜禽免疫功能，防制疾病具有重要應(yīng)用價(jià)值。有益效果動(dòng)物疫病主要靠疫苗來預(yù)防，但是很多疫苗存在免疫原性較弱等缺點(diǎn)，需要免疫增強(qiáng)劑輔助才能產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)有的常用免疫增強(qiáng)劑如油佐劑、鋁膠佐劑等常存在刺激性強(qiáng)、有殘留等缺點(diǎn)。由于中藥具有綠色安全的特點(diǎn)，從中藥中開發(fā)免疫增強(qiáng)劑已成為熱點(diǎn)。甘草次酸是甘草的主要藥效成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、腎上腺皮質(zhì)激素樣等多種藥理作用。但由于甘草次酸難溶于水，常規(guī)的給藥方式，如口服、皮下注射、靜脈注射等，甘草次酸幾乎不能被吸收，生物利用度非常低，這樣大大降低了甘草次酸的臨床應(yīng)用價(jià)值。利用脂質(zhì)體包封甘草次酸，不僅可以有效維持甘草次酸在機(jī)體內(nèi)的有效濃度，提高了其生物利用度，而且可以避免甘草次酸的不良副作用。本發(fā)明采用卵磷脂、膽固醇及表面活性劑吐溫-80將甘草次酸制備成納米脂質(zhì)體，包封率較高、粒徑小，不僅便于藥物的吸收，而且可以使藥物緩慢地的釋放，有效地延長了藥效，能顯著提高動(dòng)物細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能，對抵抗疫病有重要意義。本發(fā)明作為一種新型中獸藥，沒有副作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下:1.甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備國內(nèi)外未見報(bào)道，本發(fā)明提供了一種甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法及其優(yōu)化的條件，填補(bǔ)了國內(nèi)外研究的空白。2.甘草次酸納米脂質(zhì)體的免疫增強(qiáng)活性未見報(bào)道。通過本發(fā)明的實(shí)施，證明甘草次酸的免疫增強(qiáng)作用弱，通過制備成納米脂質(zhì)體后能夠顯著提高其免疫增強(qiáng)活性，表現(xiàn)為明顯提高抗體效價(jià)、淋巴細(xì)胞增殖、IgG和IgM含量、淋巴細(xì)胞亞群⑶4+和⑶8+比率，與甘草次酸比，在免疫后期效果更好，具有較強(qiáng)的緩釋作用，從而增強(qiáng)動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，甘草次酸納米脂質(zhì)體可以作為研制新型免疫增強(qiáng)劑的材料，為研制新型免疫增強(qiáng)劑提供了材料和不范。
具體實(shí)施例方式1.甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散法制備甘草次酸脂質(zhì)體。精密稱取大豆磷脂、膽固醇、吐溫-80和甘草次酸，加入IOmL氯仿振搖使之充分溶 解。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，后加入磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.4)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗脫至薄膜完全溶解，經(jīng)水浴超聲20min，形成納米脂質(zhì)體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質(zhì)體置于_20°C條件下凍結(jié)，之后置于水浴中融化，如此反復(fù)操作兩次，以提高包封率。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出對脂質(zhì)體包封率有較顯著影響的三個(gè)因素:脂藥比(大豆磷脂與甘草次酸質(zhì)量比，A)、膜材比(大豆磷脂與膽固醇質(zhì)量比，B)和水浴溫度(°C)。再根據(jù)脂藥比、膜材比和水浴溫度3個(gè)單因素試驗(yàn)所確定的水平范圍，采用Design-Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，選用BBD模型，以脂質(zhì)體的包封率為響應(yīng)值，做3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))二次回歸正交組合試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表I。由表I可見，包封率從44.32%到81.00%變化。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得出Y與影響因素Xi之間關(guān)系的擬合方程式如下:Y = 80.33-7.83x^5.25χ2+0.76χ3_1.32χ1χ2-7.29χ1χ3+3.06χ2χ3_9.δΙχ^-6.46χ2_12.40χ32表IBox-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種甘草次酸納米脂質(zhì)體的制備方法，采用薄膜分散法及響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化制備甘草次酸納米脂質(zhì)。
(1)采用薄膜分散法制備甘草次酸納米脂質(zhì)體。精密稱取大豆磷脂150mg、膽固醇60mg、吐溫-80 75mg和甘草次酸16.7mg,加入IOmL氯仿振搖使之充分溶解。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)除去氯仿，使溶液在瓶壁上形成一層均勻的薄膜，后加入磷酸緩沖溶液(PBS，pH7.4)，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗脫至薄膜完全溶解，經(jīng)水浴超聲20min，形成納米脂質(zhì)體，再將其過孔徑為0.22 μ m的微孔濾膜。將脂質(zhì)體置于-20°c條件下凍結(jié)，之后置于31°C水浴中融化，反復(fù)2次。
(2)按照上述方法制備甘草次酸納米脂質(zhì)體的條件為:脂藥比為9.0: 1，膜材比為2.5: 1，水浴溫度為31°〇。
(3)在最佳條件下制備的甘草次酸納米脂質(zhì)體，包封率平均值為83.46±0.55%。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的甘草次酸納米脂質(zhì)體能夠顯著提高動(dòng)物體液免疫和細(xì)胞免疫功能，具有較好 免疫增強(qiáng)功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高畜禽免疫功能的甘草次酸納米脂質(zhì)體及其制備方法，屬于中獸藥制備技術(shù)及免疫應(yīng)用領(lǐng)域。用薄膜分散法制備甘草次酸納米脂質(zhì)體，以包封率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法研究了脂藥比、膜材比和水浴溫度3個(gè)因素并對其進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳制備條件為脂藥比為9.0∶1，膜材比為2.5∶1，水浴溫度為31℃，所得甘草次酸納米脂質(zhì)體的包封率高，免疫增強(qiáng)活性強(qiáng)。本發(fā)明甘草次酸納米脂質(zhì)體顯著提高了甘草次酸的免疫增強(qiáng)活性。
文檔編號(hào)A61P37/04GK103181895SQ20111044837
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王德云, 趙曉娟, 胡元亮, 劉家國, 范云鵬, 袁菊 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)