專利名稱：抗壞血酸基-磷?；?膽固醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-抗壞血酸新衍生物的合成和用途，該新衍生物穩(wěn)定、易于結(jié)合到化妝品用賦形劑并且可生物可逆性酶解為其組成成分。典型的衍生物包括3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇和3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇及其鹽。
已知了L-抗壞血酸在食品中作為抗氧劑的用途。例如，Steinhart在農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志(1993年，第41卷，第2257-2277頁)中的抗壞血酸在Fe3+/抗壞血酸/O2體系中對(duì)L-色氨酸的前抗氧化及抗氧化作用中描述了L-抗壞血酸作為抗氧劑的用途，其通過除去自由基以及自身進(jìn)行迅速氧化而在食品中發(fā)揮作用。
類似地，局部制劑中的游離L-抗壞血酸表現(xiàn)出弱穩(wěn)定性并且由于部分氧化和非氧化降解而易于分解。降解后的抗壞血酸失去活性同時(shí)使宿主產(chǎn)品由于表現(xiàn)出褐色(不能為市售化妝品所接受)而失去美感。
盡管認(rèn)為膽固醇是非健康的，尤其是在服用形式中，但是與皮膚屏障修復(fù)用L-抗壞血酸無關(guān)的膽固醇的益處是已知的。例如，Menon在J.Invest.Dermatol.(1992年，第98卷，第209-219頁)中的Structural Basis for theBarrier Abnormality Following Inhibition of HMG CoA Reductase inMurine Epidermis中描述了當(dāng)通過下調(diào)HMG CoA還原酶而抑制膽固醇合成時(shí)皮膚屏障修復(fù)機(jī)制表現(xiàn)出不足。
根據(jù)目前的方法將L-抗壞血酸和膽固醇機(jī)械混合而得的產(chǎn)品也不穩(wěn)定，這由于L-抗壞血酸的不穩(wěn)定性占主要作用。例如，美國專利4939128第3欄21-22行描述了與膽甾烷基結(jié)合的抗壞血酸。明顯缺少膽固醇以及特殊指明膽甾烷基反映了在公開此前將L-抗壞血酸和膽固醇結(jié)合是不實(shí)際的或者是所期望的。
已試圖將抗壞血酸和甘草次酸基團(tuán)結(jié)合起來，如歐洲申請(qǐng)92104149.7中描述；以及美國專利3151127中指出的將抗壞血酸與生育酚結(jié)合。美國專利4564686和5306713也公開了具有下列結(jié)構(gòu)的用作抗氧劑的生育酚抗壞血酸基磷酸酯。
Sakamoto在IFSCC，Yokohama(1993年，第B206卷，823-864頁)的Measurement Method of Efficacy of Antidandruff Cosmetics andDevelopment of the New Active Commercial Product中描述了將生育酚偶合到L-抗壞血酸中的用途。偶合的生育酚是一種保存抗壞血酸基的抗氧化劑，但是將抗壞血酸基-生育酚用于皮膚治療卻有疑問，因?yàn)樯硬幌竽懝檀家粯訛槠つw的天然底物。
現(xiàn)有技術(shù)需要一種共價(jià)并且是生物可逆性將膽固醇結(jié)合到L-抗壞血酸上的方法。該偶合的分子應(yīng)穩(wěn)定，這樣即使由于皮膚中天然產(chǎn)生的酸性磷脂酶去偶后仍可保持全部功能活性。這可提供L-抗壞血酸的有益特性，包括增加膠原的產(chǎn)生和使皮膚光亮，以及釋放出膽固醇而帶來的改善的皮膚彈性、抵抗力、色調(diào)及保溫等益處。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種共價(jià)并且生物可逆性將膽固醇結(jié)合到L-抗壞血酸上以使所得分子穩(wěn)定的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有多種皮膚保養(yǎng)益處的穩(wěn)定組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種L-抗壞血酸衍生物，該衍生物穩(wěn)定并且易于包含在化妝品賦形劑中以及可生物可逆性酶解成游離抗壞血酸和無害膽固醇組分。
本發(fā)明的另一目的是提供延長保質(zhì)期的穩(wěn)定化妝品組合物。
這些目的將隨以下的公開而明朗。
本發(fā)明包括一種將L-抗壞血酸分子通過生物可逆性磷酸酯鍵在抗壞血酸基的2或3位以及膽固醇的3’位偶合到膽固醇分子上。所得組合物也為本發(fā)明的一部分。代表性的化合物包括3’-(L-抗壞血酸基-2-磷酰基)-膽固醇(通式I)的官能或結(jié)構(gòu)同系物，例如3’-(L-抗壞血酸基-3-磷酰基)-膽固醇(通式II)。兩個(gè)通式如下所示。
式I
式II
將膽固醇于-10℃溶于含有1.0當(dāng)量三乙胺(作為堿)的無水乙醚(用4A分子篩干燥)中制備結(jié)合的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇(通式I)。加入磷酰氯(1.0當(dāng)量)而得膽固醇膦酸二氯化物。膽固醇膦酸二氯化物的熔點(diǎn)為121-122℃，紅外(KBr球)分析表明P＝O吸收在1298波長，P-O-P吸收在1019波長，沒有羥基吸收。然后將膽固醇膦酸二氯化物在室溫下與5，6-異亞丙基-L-抗壞血酸于含有1.0當(dāng)量三乙胺的四氫呋喃中反應(yīng)3小時(shí)。該反應(yīng)得到5，6-異亞丙基-2-膦酸二氯化物L(fēng)-抗壞血酸及其異構(gòu)體5，6-異亞丙基-3-膦酸二氯化物L(fēng)-抗壞血酸的混合物。
將該異構(gòu)體混合物在THF水溶液中水解并于室溫下與Amberlyst-15(一種強(qiáng)酸性磺酸離子交換樹脂)攪拌數(shù)小時(shí)。然后除去THF和水，用乙酸乙酯提取終產(chǎn)物3’(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇并用KOH中和。將所得溶液凍干而得一鉀鹽形式。
這種新方法可共價(jià)并生物可逆性將膽固醇與抗壞血酸偶合而得穩(wěn)定的抗壞血酸，同時(shí)增加了抗壞血酸和膽固醇的生物利用度。在本發(fā)明的抗壞血酸基-磷?；?膽固醇化合物中，偶合的抗壞血酸可抵抗降解。膽固醇作為賦形劑并有利于極性抗壞血酸從皮膚的非極性外保護(hù)層(例如角質(zhì)層)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)增加了抗壞血酸局部應(yīng)用的生物利用度。
存在于皮膚中的磷脂酶等天然酶可逐步裂解膽固醇和抗壞血酸之間的磷脂鍵，其可使游離L-抗壞血酸和膽固醇持續(xù)釋放到角質(zhì)層中。釋放出的膽固醇是一種皮膚的天然底物。局部應(yīng)用膽固醇可改善彈性、色調(diào)，并且可抵御干燥。本發(fā)明的局部制劑包括3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇或者3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇。此外，也可將這些化合物的銨鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽或鈉鹽結(jié)合到化妝品用賦形劑中。根據(jù)本發(fā)明，有機(jī)胺的鹽(例如乙醇胺)也可提供益處。
適當(dāng)?shù)馁x形劑包括常規(guī)的洗液、面霜或凝膠。洗液可以包括約0.1至約20.0％的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇或3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇，約0.5至約6.0％的甘油，約2.0至約8.0％的丙二醇二辛酸鹽/二癸酸鹽，約1.8至約4.0％的Peg40硬脂酸鹽，約1.0至約2.5％的Steareth-2，約0.25至約0.7％的黃原膠，約0.25至約0.7％的羥乙基纖維素，約0.15至約0.2％的EDTA二鈉和約0.20至約0.25％的尼泊金甲酯，所有的范圍都以重量百分?jǐn)?shù)表示。
面霜可以包括約0.1至約20.0％的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇或3’-(L-抗壞血酸基-3-磷酰基)-膽固醇，約0.5至約4.0％的甘油，約2.0至約6.0％的丙二醇二辛酸鹽/二癸酸鹽，約1.8至約3.0％的Steareth-20，約0.8至約2.0％的Steareth-2，約0.25至約0.6的黃原膠，約0.25至約0.6％的羥乙基纖維素，約1.0至約2.5％的鯨蠟醇、約0.9至約3.5％的EDTA二鈉和單硬脂酸甘油酯和約0.15至約0.2％的EDTA二鈉。
凝膠可以含有約0.1至約20.0％的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇或3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇，約0.15至約0.2％的EDTA二鈉，約2.0至約6.0％的丙二醇，約0.4至約1.5％的羥乙基纖維素和約0.20至約0.25％的尼泊金甲酯。
可以用足量的氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、乙醇胺、二乙醇胺或脲將這些制劑的pH值調(diào)節(jié)至生理可接受的水平。
本發(fā)明的化合物可以如下合成(i)將膽固醇與鹵代磷酸試劑反應(yīng)，(ii)將所得產(chǎn)物與5，6-羥基保護(hù)的L-抗壞血酸偶合，(iii)用水水解產(chǎn)物，(iv)用酸性數(shù)值脫去保護(hù)基以及(v)將產(chǎn)物用冷凍干燥和重結(jié)晶的方法純化。該衍生物在溶液中穩(wěn)定，具有抗氧化作用并且可刺激成纖維細(xì)胞中膠原的產(chǎn)生。
實(shí)施例1磷酸二酯酸及其一鉀鹽的制備用如下方法合成膽固醇磷酸二氯化物。反應(yīng)選擇250毫升兩頸19/22ST圓底燒瓶。其包含一個(gè)橡膠塞(帶有氮入口針)、攪拌棒和19/22至24/40ST的膨脹接管(含有24/40ST 125毫升的帶側(cè)臂的滴液漏斗)。將此裝置烘干并在氮?dú)饬飨吕鋮s。將4.64克(12毫摩爾)Sigma 99+&膽固醇、75毫升乙醚(經(jīng)活化4A分子篩干燥)和1.214克(12毫摩爾，1.672毫升)無水(用KOH干燥)三乙胺裝入滴液漏斗。
將28毫升無水乙醚和1.84克(12毫摩爾，1.118毫升)磷酰氯裝入燒瓶中并在冰/甲醇(-10℃)浴中冷卻。經(jīng)20-30分鐘滴加入含有膽固醇三乙胺的乙醚。將溶液升溫至室溫并攪拌2.5小時(shí)。
用布氏漏斗濾除沉淀下來的固體，充分?jǐn)嚢柘掠盟礈?次。經(jīng)布氏漏斗導(dǎo)入空氣直至濾液中所有的乙醚都蒸發(fā)。經(jīng)另一個(gè)布氏漏斗濾除固體沉淀物，將膽固醇磷酸二氯化物在真空干燥器中用五氧化二磷干燥。本實(shí)驗(yàn)得到3.90克(65％)首批固體，熔點(diǎn)121-122℃及1.74克(29％)第二批產(chǎn)物，熔點(diǎn)117-118℃。IR分析(KBr小球)表明(C-H)吸收在2947波長，(＝C-H)吸收在2878波長，(C＝C)吸收在1466波長，(P＝O)吸收在1298波長并且(P-O-P)吸收在1019波長。
按照下述方法合成抗壞血酸膽固醇磷酸二酯氯化物。
本實(shí)驗(yàn)選擇配有攪拌棒、橡膠塞、氮入口針和50毫升滴液漏斗的50毫升三頸19/22ST圓底燒瓶。將此裝置烘干并在氮?dú)饬飨吕鋮s。將503毫克(1毫摩爾)膽固醇磷酸二氯化物(熔點(diǎn)122℃)和15毫升無水THF裝入滴液漏斗；于冰/甲醇浴(-10℃)中將混合物冷卻。在冷卻后的混合物中加入216毫克(1毫摩爾)Sigma 5，6-異亞丙基-L-抗壞血酸、15毫升無水THF和0.14毫升(101毫克，1毫摩爾)無水(KOH)三乙胺。加完后，將混合物升溫至室溫并攪拌3小時(shí)。
TLC(25％甲醇/甲苯)分析表明反應(yīng)完全。其也表明產(chǎn)物是2-O和3-O區(qū)位異構(gòu)體的混合物。用凹槽紙濾除沉淀下來的鹽酸三乙胺。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去THF而得0.66克(97％)抗壞血酸膽固醇磷酸二酯氯化物的粗晶體。
如下制備抗壞血酸膽固醇磷酸二酯酸。將粗抗壞血酸膽固醇磷酸二酯氯化物(6.76克，9.9毫摩爾)的60毫升THF溶液與30毫升水和20克濕潤Amberlyst-15(已在水中漂洗過三次)合并。室溫下將所得混合物劇烈攪拌55小時(shí)。用凹槽紙濾除Amberlyst-15，用20毫升1∶1THF/水將其漂洗一次。用氮?dú)饬鞒ゴ蟛糠諸HF而得53毫升濃厚渾濁水懸浮液。
將53毫升THF加到此懸浮液中而得106毫升近澄清的粗磷酸二酯酸的1∶1THF/水溶液。將此1∶1THF/水溶液加到C-18反相硅膠(472克)柱上而純化磷酸二酯酸，用1∶1THF/水洗脫。用氮?dú)饬鞒吻錞HF而得215毫升純化的磷酸二酯酸的水懸浮液。計(jì)劃總產(chǎn)率為1.74克(28％)；實(shí)際分離產(chǎn)率為1.84克(30％)。反相HPLC分析表明為90％純度。
抗壞血酸膽固醇磷酸二酯二酸一鉀鹽是通過首先用一當(dāng)量標(biāo)準(zhǔn)化氫氧化鉀溶液處理1％的二酸水溶液然后冷凍干燥制備而得的。將該磷酸二酯二酸(579毫克，0.927毫摩爾)溶于57.9毫升水中，用9.44毫升0.0986N氫氧化鉀溶液(0.1931毫摩爾)處理。然后將中和后的溶液冷凍干燥而澄清水，得到603毫克(98％)一鉀鹽的蓬松白色固體。實(shí)施例2通過反相C-18色譜法純化按照Evans的色譜學(xué)(1980年，第13卷，第5-10頁)制備1千克反相C-18硅膠。用1∶1THF/水(90∶1填充比)將磷酸二酯酸純化至90％的水平，然后用氮?dú)饬鞒HF并通過冷凍干燥除去水。用反相薄層色譜研究其它溶劑系統(tǒng)可以(i)改善純度水平，(ii)識(shí)別一種可通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去的有效分離介質(zhì)并且(iii)可使用低的填充比。由于反相C-18硅膠是可再利用的，因此該方法可使純化達(dá)1000克。
適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)包括THF/甲醇、THF/乙醇、THF/異丙醇、二惡烷/甲醇、二惡烷/乙醇、二惡烷/異丙醇、乙醚/甲醇、乙醚/乙醇、乙醚/異丙醇、乙酸乙酯/甲醇、乙酸乙酯/乙醇、乙酸乙酯/異丙醇、二氯甲烷/乙醇、二氯甲烷/甲醇、二氯甲烷/異丙醇、DME/甲醇、DME/乙醇和DME/異丙醇。
與膽固醇結(jié)合可使極性抗壞血酸轉(zhuǎn)化為非極性親酯性抗壞血酸基，其易于通過角質(zhì)層吸收。一旦通過角質(zhì)層，所吸收的化合物即可影響下面的成纖維細(xì)胞。生物可逆后的抗壞血酸和膽固醇的益處前面已解釋過。但是，出乎意料的是，結(jié)合后的化合物本身可刺激膠原的合成，其可增強(qiáng)皮膚的完整性和彈性。其它細(xì)節(jié)如實(shí)施例3所述。實(shí)施例3成纖維細(xì)胞研究本實(shí)施例總結(jié)了一項(xiàng)研究，其中闡明了3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇刺激人皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的能力。用不同劑量的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇進(jìn)行本領(lǐng)域認(rèn)同的[3H]-脯氨酸結(jié)合試驗(yàn)。Juva.的分析生化(1966，第15卷，第77-83頁)；Booth的生化生物物理文集(1981，第675卷，第117-122頁)。
將成纖維細(xì)胞與0μg/ml、11.3μg/ml、22.5μg/ml、45μg/ml、的3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇培養(yǎng)共48小時(shí)。第一個(gè)24小時(shí)后，將[3H]-脯氨酸加到培養(yǎng)基中。第二個(gè)24小時(shí)后，收集細(xì)胞并準(zhǔn)備用于膠原生物合成試驗(yàn)。
加入蛋白酶防止膠原和其它蛋白質(zhì)的降解。將細(xì)胞層刮到含有0.4MNaCl和0.01M Tris(pH7.5)的溶液中。超聲處理提取物以破碎細(xì)胞膜。將各個(gè)含有細(xì)胞的溶液(每個(gè)1毫升)在去離子水(更換數(shù)次)中滲析過夜。滲析除去滲裕物并在6N鹽酸中于120℃水解過夜。本試驗(yàn)用2M氯胺-T進(jìn)行氧化。將樣品進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)分析，其代表新合成的[3H]-羥基脯氨酸-新膠原合成的指標(biāo)。
發(fā)現(xiàn)3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇可通過人皮膚成纖維細(xì)胞以劑量依賴的方式增加新膠原的產(chǎn)生，如下表所示。-脯氨酸的結(jié)合
3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇的濃度(μg/ml)根據(jù)本公開文本可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修飾和更改。這些更改和添加應(yīng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)如下權(quán)利要求書所述。
權(quán)利要求
1.一種局部制劑，含有適當(dāng)局部賦形劑和一種選自3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇、3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇及其鹽的化合物。
2.權(quán)利要求1的局部制劑，其中所述鹽選自銨鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈉鹽和有機(jī)胺鹽。
3.權(quán)利要求1的局部制劑，其中所述賦形劑選自洗液、面霜和凝膠。
4.一種局部制劑，其包括(a)約0.1至約20.0％選自3’-(L-抗壞血酸基-2-磷酰基)-膽固醇和3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇的化合物；(b)約0.5至約6.0％的甘油；(c)約2.0至約8.0％的丙二醇二辛酸鹽/二癸酸鹽；(d)約1.8至約4.0％的Peg40硬脂酸；(e)約1.0至約2.5％的Steareth-2；(f)約0.25至約0.7％的黃原膠；(g)約0.25至約0.7％的羥乙基纖維素；(h)約0.15至約0.2％的EDTA二鈉；以及(i)約0.20至約0.25％的尼泊金甲酯。
5.權(quán)利要求4的局部制劑，其中所述制劑的pH值可以用足量的選自氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、乙醇胺、二乙醇胺或脲調(diào)節(jié)至生理可接受的水平。
6.一種局部制劑，其包括(a)約0.1至約20.0％選自3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇和3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇的化合物；(b)約0.5至約4.0％的甘油；(c)約2.0至約6.0％的丙二醇二辛酸鹽/二癸酸鹽；(d)約1.8至約3.0％的Steareth-20；(e)約0.8至約2.0％的Steareth-2；(f)約0.25至約0.6％的黃原膠；(g)約0.25至約0.6％的羥乙基纖維素；(h)約1.0至約約2.5％的鯨蠟醇；(I)約0.9至約3.5％的單硬脂酸甘油酯；以及(j)約0.15至約0.2％的EDTA二鈉。
7.權(quán)利要求6的局部制劑，其中所述制劑的pH值可以用足量的選自氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、乙醇胺、二乙醇胺或脲調(diào)節(jié)至生理可接受的水平。
8.一種局部制劑，其包括(a)約0.1至約20.0％選自3’-(L-抗壞血酸基-2-磷?；?-膽固醇和3’-(L-抗壞血酸基-3-磷?；?-膽固醇的化合物；(b)約0.15至約0.2％的EDTA二鈉；(c)約2.0至約6.0％的丙二醇；(d)約0.4至約1.5％的羥乙基纖維素；(h)；以及(e)約0.20至約0.25％的尼泊金甲酯。
9.權(quán)利要求8的局部制劑，其中所述制劑的pH值可以用足量的選自氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉和乙醇胺調(diào)節(jié)至生理可接受的水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及L－抗壞血酸新衍生物,該新衍生物穩(wěn)定、易于結(jié)合到化妝品用賦形劑并且可以在皮膚內(nèi)生物可逆性酶解為游離抗壞血酸和無害膽固醇成分。典型的實(shí)例為通式Ⅰ所示的3’－(L－抗壞血酸基－2－磷?；?－膽固醇。
文檔編號(hào)A61K31/34GK1176602SQ96190509
公開日1998年3月18日 申請(qǐng)日期1996年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月14日
發(fā)明者德米特里·普特徹林特塞弗 申請(qǐng)人:埃馮產(chǎn)品公司