專利名稱：一種激活魚類脂代謝調控基因表達的誘導劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術應用領域，具體涉及一種激活魚類脂代謝調控基因表達 的誘導劑及其應用。
背景技術：
xLM, it ^ M W ±1 M ^ # 舌 ^ #(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)是一類能被內源性脂肪酸以及外源性過氧化物酶體增殖物(peroxisome proliferator, PP)作為配體激活的核轉錄因子，屬II型核受體超家族成員。PPAR還因能 被內源性脂肪酸及其代謝產物激活而稱為脂肪酸受體(fatty acid receptor)。在多種動 物體內都存在三類PPARs受體，即PPAR α，PPAR β亦稱PPAR δ及PPAR γ，這三種亞型均有 特異性，能產生不同的生物學作用。PPAR能夠調控許多參與細胞內外脂類代謝的目的基因 表達，尤其是編碼β氧化過程中一些重要酶類的基因，另外PPAR也參與脂肪細胞的分化， 可能對細胞的生長、分化甚至凋亡有重要影響。PPARs是脂肪細胞分化及脂類代謝的重要調 節(jié)因子，在調控能量代謝方面起中樞作用，能夠控制脂肪酸吸收、脂肪沉積和脂肪形成，是 穩(wěn)定脂類代謝內環(huán)境和胰島素抵抗的主要調節(jié)因子。因此，對PPARs功能和作用機制的研 究引起了許多研究者的興趣。人工配合飼料在養(yǎng)魚業(yè)中的應用已經非常廣泛。池塘養(yǎng)魚業(yè)中，由于長期應用配 合飼料飼養(yǎng)家魚，常常會引起魚類的脂肪肝和脂肥傾向，影響魚類的生長和魚肉的鮮味。 隨著社會的發(fā)展，人們對畜禽產品的組成和風味的要求越來越高，科學、合理地調控畜禽機 體脂肪沉積成為動物育種和生產領域的重要課題。PPARs起脂肪感受器的作用，局部改變 基因表達以調節(jié)脂類代謝。同時調控脂肪細胞分化，對脂肪細胞均具有轉錄激活作用，其中 PPARy具有最強的促進脂肪細胞分化的能力。根據(jù)PPARs的這些生物學功能，尋求更高親 和力與特異性的激活劑或拮抗劑，在醫(yī)學上用于治療肥胖、高血脂癥、II型糖尿病等代謝性 疾??；在畜牧生產中提高畜禽瘦肉率和降低禽類腹脂沉積以改善肉質等均具有重要意義。迄今為止，PPAR基因三種亞型已在靈長類、嚙齒類、兩棲類、鳥類和一些魚類中被 鑒定和克隆，但有關魚類PPAR的研究遠沒有哺乳類動物多。目前已知PPAR三種亞型有一 些共同的配體，如ΡΡ、多不飽和脂肪酸、胰島素、非甾體類抗炎藥。PPARa配體包括長鏈不 飽和脂肪酸、支鏈、聚合和氧化型脂肪酸、二十烷類化合物、白三烯Β4、貝特類降脂藥物和 Wy-14563等多種。多聚不飽和脂肪酸、前列腺素和視黃酸是PPARi^的天然配基。PPARy 的配體包括某些前列腺素、前列腺素樣分子等，花生四烯酸經環(huán)氧合酶、脂氧合酶作用后的 代謝產物，如15-脫氧前列腺素J2、脂肪酸衍生物為PPAR γ的天然配體。目前尚未見有將 氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素J2用于調節(jié)草魚體內脂類代謝平衡 的相關研究報道。HWtenophaiyngodon iWh)是我國主要養(yǎng)殖對象，可以有效利用廉價的植 物蛋白源提供水產品，但是草魚在養(yǎng)殖過程中體脂含量增加及脂肪肝的發(fā)生表現(xiàn)較為突 出。在集約化養(yǎng)殖條件下，由于大量攝入人工配合飼料及缺少運動，草魚體內脂肪沉積，生長緩慢，體型異常，降低了魚肉品質和風味，同時也增加了養(yǎng)殖成本。經解剖檢查，體腔內脂 肪大部分沉積在腸道周圍、腸系膜上或肝臟表層，嚴重者肝臟失去血色，呈乳黃色或灰 黃色。因此在魚類飼料中添加降脂因子，降低其體組織脂肪的蓄積成為近幾年水產動物營 養(yǎng)學的研究熱點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的魚類養(yǎng)殖中存在的魚體內脂肪沉積、生長緩慢、體 型異常等缺點，提供一種可維持魚類營養(yǎng)代謝平衡，減少魚類脂肪沉積，改善魚肉品質的誘 導劑。本發(fā)明另一目的在于提供上述誘導劑的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)
一種激活魚類脂代謝調控基因表達的誘導劑，包括氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫 氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明將氯貝丁酯(Clofibrate)，2-溴軟脂酸(2-bromopalmitate)，15-脫 氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)作為誘導劑 對草魚進行活體注射，注射微量(mg/kg級)，激活草魚脂類代謝調控基因，特別是過氧化物 酶體增殖體激活受體(PPAR)基因表達，以維持養(yǎng)殖魚營養(yǎng)代謝平衡。首先本發(fā)明人研究了魚體內PPAR對于脂肪代謝影響
過氧化物酶體增殖物激活受體是作為配體激活的核轉錄因子，是脂肪細胞分化及脂類 代謝的重要調節(jié)因子，在調控能量代謝方面起中樞作用，能夠控制脂肪酸吸收、脂肪沉積和 脂肪形成，是穩(wěn)定脂類代謝內環(huán)境的主要調節(jié)因子。PPAR能夠調控許多參與細胞內外脂類 代謝的目的基因表達，尤其是編碼β氧化過程中一些重要酶類的基因，另外PPAR也參與脂 肪細胞的分化，可能對細胞的生長、分化甚至凋亡有重要影響。PPAR的3種亞型在不同組織 中的表達各不相同，雖然在大多數(shù)組織細胞中PPARa、PPARii和PPARy是共同表達的，但 表達水平卻相差懸殊。PPARa主要表達于心、肝、腎近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪等代謝活 躍的組織。PPARii在多種組織、細胞表達，其中腦、脂肪細胞及皮膚最高，而PPARy主要存 在于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，在脂肪、腸和乳腺等組織中有較高表達。本發(fā)明人利用熒光定量PCR方法，以β-肌動蛋白為外參照，研究草魚不同組織 PPAR基因的表達水平。研究結果顯示，PPARa在肝臟中大量表達，其次是腦，在肌肉和心臟 中有微量表達；PPARii在心臟、肝臟和肌肉中表達最多，在腦、脾臟和脂質中有微量表達； PPARy表達相對較弱，只在肝臟中有較多表達，而在腦，肌肉和脂質中微弱表達。與哺乳動 物PPAR基因表達分布不同，魚類PPAR基因主要在肝臟組織中大量表達，這可能是因為魚類 缺乏皮下脂肪層，其主要脂肪蓄積部位是腹腔腸系膜脂肪組織、肝臟及肌肉。由于肝臟是 動物脂肪酸β -氧化代謝的重要部位，因而它是魚類隨營養(yǎng)狀況而改變脂肪蓄積的主要調 節(jié)性貯脂器官(PPARa的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；PPARβ的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示；PPAR γ的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示)。接著分析了 PPAR三種亞型的配體，它們有一些共同的配體，如PP、多不飽和脂肪酸、胰 島素、非留體類抗炎藥。PPARα配體包括長鏈不飽和脂肪酸、支鏈、聚合和氧化型脂肪 酸、二十烷類化合物、白三烯Β4、貝特類降脂藥物和Wy-14563等多種。通過激活PPARa調 節(jié)與脂肪酸β氧化有關的下游基因，如脂酰CoA氧化酶、肉堿棕櫚酰轉移酶I的表達，進而 加速脂肪酸的分解以達到降血脂的目的。脂肪酸也可以激活PPARa，加速脂肪酸的分解。 多聚不飽和脂肪酸、前列腺素和視黃酸是PPARii的天然配基。PPAR γ的配體包括某些前列 腺素、前列腺素樣分子等，花生四烯酸經環(huán)氧合酶、脂氧合酶作用后的代謝產物，如15-脫 氧前列腺素j2、脂肪酸衍生物為PPARy的天然配體。因此，本發(fā)明選擇氯貝丁酯(Clofibrate)，2_溴軟脂酸(2-bromo palmitate), 15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素 J2 (15-deoxy- Δ 12，14- prostaglandin J2, 15d_J2)分別 作為PPAR三種亞型的誘導劑，誘導激活草魚脂類代謝調控基因——過氧化物酶體增殖體激 活受體(PPAR)表達。經過具體的實驗摸索發(fā)現(xiàn)，注射Clofibrate 25-67 mg/kg魚體重(優(yōu)選50 mg/kg 體重)，2-bromo palmitate 35_58mg/kg 魚體重(優(yōu)選 42 mg/kg 體重)，15d_J2 0.95-1.05 mg/kg魚體重(優(yōu)選1 mg/kg體重)時，注射微量(mg/kg級)，激活過氧化物酶體增殖體激活 受體(PPAR)基因表達，作為調節(jié)草魚體內脂類代謝平衡的基因表達誘導劑經濟合算。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1.本發(fā)明提供了一種激活魚類脂代謝調控基因表達的誘導劑，注射微量(mg/kg級)， 能夠激活草魚脂類代謝調控基因——過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)基因表達，以維 持養(yǎng)殖魚脂肪代謝平衡；
2.草魚是我國特有的草食性養(yǎng)殖魚類，但人工飼料喂養(yǎng)草魚一段時間后，常常發(fā)生脂 肪過量蓄積，影響飼料的增肉效果，降低其營養(yǎng)價值。根據(jù)本發(fā)明提供的三種PPAR激活劑 對魚體腹腔注射，可調節(jié)草魚體內脂類代謝平衡，在魚類養(yǎng)殖上為減少脂肪沉積、改善肉品 質提供重要的參考價值，有助于揭示草食性魚類對營養(yǎng)物的利用及其機制。


圖1草魚PPARa基因cDNA部分序列及推導的氨基酸序列，氨基酸序列用單字母 符號于核苷酸序列下對應表示出來；
圖2草魚PPARii基因cDNA部分序列及推導的氨基酸序列，氨基酸序列用單字母符號 于核苷酸序列下對應表示出來；
圖3草魚PPARy基因cDNA部分序列加3’端序列及推導的氨基酸序列。氨基酸序列 用單字母符號于核苷酸序列下對應表示出來；翻譯終止密碼子用星號(*)表示出來；下劃 線表示PolyA加尾信號；
圖4為草魚肝臟、腦、脾臟、肌肉、脂肪和心臟PPARs基因組成型表達水平，PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖5為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖6為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，腸系膜脂肪PPARs/ beta-actinmRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARa /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖7為三種濃度Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖8為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARa /beta-actin mRNA，2 為 PPAR β /beta-actin mRNA, 3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖9為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖10為三種濃度2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α/beta-actin mRNA, 2 為 PPAR β/ beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖11為三種濃度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草魚24小時后， 肝臟 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPARα/beta-actin mRNA，2 為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖12為三種濃度15-deoXy-A 12，14- prostaglandin J2腹腔注射草魚M小時后，腸 系膜脂肪PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為PPARα/beta-actin mRNA，2為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖13為三種濃度15-deoxy-A12, 14- prostaglandin J2腹腔注射草魚24小時后， 肌肉 PPARs/ beta-actin mRNA 比例柱狀圖；其中，1 為 PPAR α /beta-actin mRNA, 2 為 PPAR^ /beta-actin mRNA,3 為 PPARy/beta-actin mRNA ；
圖14為PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖15為PBS和50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖16為PBS禾口 50mg/kg Clofibrate腹腔注射草魚24小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射50mg/kg Clofibrate ；
圖17為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肝臟PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
圖18為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，腸系膜脂肪 PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate ；
圖19為PBS和125umol/kg 2-bromo palmitate腹腔注射草魚M小時后，肌肉PPARs/ beta-actin mRNA比例柱狀圖；其中，1為腹腔注射PBS，2為腹腔注射125umol/kg 2-bromo palmitate；
權利要求
1.一種激活魚類脂代謝調控基因表達的誘導劑，其特征在于所述誘導劑為氯貝丁酯、 2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ 12，14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。
2.權利要求1所述誘導劑的應用，其特征在于所述誘導劑對魚類進行活體注射或飼料 添加，用于激活魚類脂代謝調控基因表達。
3.根據(jù)權利要求2所述誘導劑的應用，其特征在于所述氯貝丁酯的加入量為25-67 mg/kg魚體重。
4.根據(jù)權利要求3所述誘導劑的應用，其特征在于所述氯貝丁酯的加入量為50mg/kg魚體重。
5.根據(jù)權利要求2所述誘導劑的應用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為 35-58mg/kg 魚體重。
6.根據(jù)權利要求5所述誘導劑的應用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為42mg/ kg魚體重。
7.根據(jù)權利要求2所述誘導劑的應用，其特征在于所述15-脫氧-Δ12，14-前列腺素 J2的加入量為0. 95-1. 05 mg/kg魚體重。
8.根據(jù)權利要求7所述誘導劑的應用，其特征在于所述2-溴軟脂酸的加入量為Img/ kg魚體重。
9.根據(jù)權利要求2所述誘導劑的應用，其特征在于所述激活魚類脂代謝調控基因為過 氧化物酶體增殖體激活受體基因。
10.根據(jù)權利要求2所述誘導劑的應用，其特征在于所述魚類為草魚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種激活魚類脂代謝調控基因表達的誘導劑及其應用。本發(fā)明誘導劑為氯貝丁酯、2-溴軟脂酸、15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明誘導劑可以激活魚類體細胞脂類代謝調控基因——過氧化物酶體增殖體激活受體基因的表達，因此本發(fā)明誘導劑可用于魚類養(yǎng)殖中，維持魚類養(yǎng)殖中的營養(yǎng)代謝平衡，減少魚類脂肪沉積、改善肉品質。
文檔編號A61K31/20GK102125544SQ201010593480
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者何珊, 姚煜, 梁旭方, 鄒奕, 郁穎, 陳亮, 陳小佳 申請人:暨南大學