專利名稱：膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法
CN 102526277 A膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法
技術領域
本發(fā)明屬于天然藥物分離純化技術領域，特別涉及一種膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法。
技術背景
膽木，又名藥烏檀，山熊膽、熊膽樹、細葉黃棵木、黃羊木等。為茜草科烏檀屬喬木烏檀(Nauclea Officinalis Pierre ex Pitard)干燥的莖、枝、樹皮和根。膽木性味苦、寒，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。我國廣西、廣東和海南民間常用于感冒發(fā)熱、肺炎、腸炎、痢疾、濕疹、皮疹、膿瘍等病的治療。目前有“膽木注射液”、“膽木浸膏片”、“膽木浸膏膠囊”和“膽木浸膏糖漿”四種中藥制劑，臨床應用于清熱解毒，用于急性扁桃腺炎，急性咽喉炎，急性結膜炎及上呼吸道感染。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，膽木中主要含有40多種吲哚類生物堿，多數(shù)生物堿水溶性較差、也含有少數(shù)幾種水溶性較好的生物堿糖苷，另外含有少量五環(huán)三萜、留醇等有生物活性的化學成分，研究和報道中最多的是生物堿類成分。文獻研究表明膽木的主要活性成分是其中的生物堿類成分。據(jù)現(xiàn)有的各項資料， 膽木藥材現(xiàn)有的分離純化方法主要有1、膽木浸膏的制備將膽木鮮的莖皮切片，粉碎成粗粉，加水1(Γ20倍，加熱水煮3次， 第一次池，第二次1. 5h、第三次lh，合并水煮液后，過濾，減壓濃縮至相對密度為1. 2(Tl. 23 (60°C)的濃縮液，噴霧干燥得到膽木干浸膏，主要用于制備膽木浸膏片。
2、膽木提取物溶液的制備將膽木鮮的莖皮切片，粉碎成粗粉，加水煎煮三次，第一次2 h，第二次1.5 h，第三次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1. 1纊1. 19 (60 °C)的清膏，加石膏粉適量，混勻，7(T80°C減壓干燥，粉碎成50目粉，加乙醇使含醇量達80%，攪拌提取三次，冷藏，靜置Mh，取上清液，回收乙醇，加蒸餾水至相對密度為 1.02 1.03 (60°C)，冷至室溫，用10%鹽酸溶液調(diào)pH值至2.0 3.0，冷藏，靜置M h，濾過， 濾液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7. (Γ7. 2，冷藏，靜置M h，濾過，得到膽木提取物溶液，用于膽木注射液的制備。
現(xiàn)有提取純化技術工藝主要存在以下不足(1)使用水作為提取介質(zhì)，雖然經(jīng)濟但提取有效成分的效率低，使得膽木藥材中的有效成分難以有效浸出，這對于生長周期長、 野生資源日益減少的膽木藥材來說沒有得到有效的利用；另外長時間的水煮和較高溫度的濃縮會造成部分穩(wěn)定性較差的有效成分發(fā)生結構變化或破壞，造成不應有的損失。(2)膽木提取物溶液的制備，因膽木莖皮用水煮，含有一定量膠質(zhì)，處理時步驟多，周期長，物耗、 能耗和工時均較高，收率也不夠理想。由于步驟多，反復的高溫和堿性條件下的存放必然造成某些穩(wěn)定性差的活性物質(zhì)的變化和損失。(3)試驗表明醇濃度相對較高的水溶液制備的膽木提取物具有更高的抗菌活性，目前，膽木藥材主要用于膽木浸膏片和膽木注射液的生產(chǎn)，在中國大陸南方數(shù)省區(qū)有一定的市場，對上呼吸道感染引發(fā)的感冒、炎癥等疾病有良好的治療效果，由于膽木藥材的短缺，市場情況是供不應求，隨著技術的進步和市場需求的擴大，原有的制備工藝中的一些不足之處亟待改進。(4)采用醇的酸性水溶液提取不僅可以提取出水溶性較好的生物堿糖苷還可得到一些水溶性較差的生物堿，即得到膽木總生物堿
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法。該方法以弱酸性的醇水為提取介質(zhì)，采用常溫浸泡提取和真空減壓控溫濃縮，得到了較高收率的膽木總堿提取物，降低了能耗和工時。
本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)一種膽木莖皮中總生物堿的分離純化方法，包括如下步驟(1)用醇的酸性水溶液滲濾提取將膽木莖皮粉碎成粗粉后，用醇(質(zhì)量百分比濃度35 75%)的酸性水溶液(質(zhì)量百分比濃度1 3%)浸泡提取，第一遍滲濾液直接濃縮，第二遍以后的滲濾液視浸出物濃度反復使用于新的藥材粉，循環(huán)浸泡提取至膽木莖皮粉中的生物堿浸提干凈為止(采用薄層層析法以異長春花苷內(nèi)酰胺在365nm紫外光燈下的顯色斑點為標準)。
(2)總生物堿濃縮液制備于60°C以下減壓回收醇至水溶液無醇味后，加氨水中和至pH6. 5^7. 0，繼續(xù)濃縮至密度1. 16^1. 17，4°C放置過夜，過濾得到總生物堿濃縮液。
(3)總生物堿干粉或干浸膏的制備將(1)中得到的提取液回收醇至水溶液無醇味后，加氨水中和至PH6. 5 7.0，繼續(xù)濃縮至密度1. 16^1. 17噴霧干燥或真空濃縮后再真空干燥得到總生物堿干粉或干浸膏。
(4)總生物堿含量的測定異長春花苷內(nèi)酰胺是膽木莖皮和葉中的主要生物堿，且在2001 !!!處有顯著吸收， 故選擇異長春花苷內(nèi)酰胺為對照可測定膽木提取物中總生物堿的相對含量。精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺1. OOmg置IOOml量瓶中加甲醇溶解后稀釋至刻度，精密量取0. 1、0.2、0.4、 0. 6,0. 8,1. Oml用甲醇分別稀釋到anl，用紫外可見分光光度計測定206nm處的吸光度值， 制作標準曲線。取上述總生物堿濃縮液、總生物堿干粉或浸膏適量，用甲醇溶解稀釋至合適濃度，測定該甲醇液在206nm處的吸光度值，將該吸光度值與標準曲線對照即可確定濃縮液、干粉或浸膏中總生物堿的含量。
為了更好地實現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟(1)中膽木莖皮粉是30 60目的膽木莖皮粉。
所述步驟(1)中所用的酸可以是鹽酸、醋酸和硫酸水溶液等。
所述步驟(1)中所用的醇可以是甲醇、乙醇等。
所述步驟(1)中所用的薄層層析條件為，用GF254熒光硅膠為載體，制備薄層層析板，以氯仿甲醇乙酸乙酯(9 1 3)為展開劑，在365nm紫外光燈下顯色觀察。
所述步驟(2)中中和提取液中的酸可以用氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液等。
所述步驟(2)中所述的冷藏放置的溫度可以是壙10°C。
所述步驟(3)中中和提取液中的酸可以用氨水、氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液等。4
所述步驟(3)中真空干燥的溫度在5(T60°C。
所述步驟(4)用分光光度計測定異長春花苷內(nèi)酰胺和總生物堿含量的波長范圍是 203 210nm。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明通過醇的酸性水溶液浸泡提取，真空濃縮，大大降低了提取溫度和濃縮溫度，減少了提取物的受熱時間，節(jié)約了能耗；提高了生物堿活性成分的浸出效率、浸出比例和浸出量；避免或減少了穩(wěn)定性差的生物堿的破壞或變質(zhì)，能有效獲得膽木總生物堿提取物或總堿干粉。
(2)減少了膽木總生物堿濃縮液的制備工序，減少了總生物堿的損失。
(3)試驗表明一定濃度的醇水溶液提取膽木中生物堿的效果好于單純水煮提取， 用醇的酸性水溶液提取效果則更好。
(4)通過高效液相色譜與薄層色譜分析對比，該法與原有的水煮法比較相同的提取液量、提取時間和提取次數(shù)下，醇的酸性水溶液得到的總生物堿的濃度提高了 1/3 (紫外可見分光光度法定量測定)，活性生物堿的類型增加了超過1倍(薄層色譜定性檢測)，原水提取法得到的提取物僅能檢出4飛個生物堿成分，醇的酸性水溶液提取物能檢出l(Tll個生物堿成分。
(5)提出了簡便的測定膽木提取物中總生物堿的測定方法，選定了總生物堿測定的波長范圍。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1(1)用醇的酸性水溶液提取將5kg膽木莖皮粉碎成30 60目的膽木莖皮粉，投入提取罐中，加入10倍膽木莖皮粉質(zhì)量的含量75% (質(zhì)量百分比濃度)乙醇的3% (質(zhì)量百分比濃度)鹽酸水溶液，室溫浸泡提取2小時，放出浸出液，同法反復浸泡至異長春花苷內(nèi)酰胺檢出很少時止，過濾提取液后，合并真空濃縮至幾無醇味，用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到6. 5^7. 0，再繼續(xù)濃縮至密度為1. 16^1. 17，冷藏過夜后過濾，即得到膽木總生物堿濃縮液6. 5升。將該濃縮液真空濃縮干燥即可得到膽木總堿粉420克。
(2)總堿粉中膽木總生物堿含量的測定精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺l.OOmg置IOOml量瓶中加甲醇溶解后稀釋至刻度，精密量取0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml用甲醇分別稀釋到aiil，用紫外可見分光光度計測定 206nm處的吸光度值，制作標準曲線。取上述總生物堿干粉0. 100g，用70%甲醇水溶解稀釋至100ml，過濾后取0. Iml用甲醇稀釋到anl，測定該甲醇液在206nm處的最大吸光度值，將該吸光度值與標準曲線對照，計算出膽木總堿干粉中總生物堿的含量為2. 68%。
實施例2(1)用醇的酸性水溶液提取將3kg膽木莖皮粉碎成30 60目的膽木莖皮粉，投入提取罐中，加入10倍膽木莖皮粉質(zhì)量的含量60% (質(zhì)量百分比濃度)乙醇的3% (質(zhì)量百分比濃度)冰醋酸水溶液，室溫浸泡提取2小時，放出浸出液，同法反復浸泡至異長春花苷內(nèi)酰胺檢出很少時止，過濾提取液后，合并真空濃縮至幾無醇味，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液的PH到6. 5^7. 0，再繼續(xù)濃縮至密度為 1. 16^1. 17，冷藏過夜后過濾，即得到膽木總生物堿濃縮液3. 6升。將該濃縮液真空濃縮干燥即可得到膽木總堿粉252克。
(2)總堿粉中膽木總生物堿含量的測定精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺l.OOmg置IOOml量瓶中加甲醇溶解后稀釋至刻度，精密量取0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml用甲醇分別稀釋到aiil，用紫外可見分光光度計測定 206nm處的吸光度值，制作標準曲線。取上述總生物堿干粉0. 100g，用70%甲醇水溶解稀釋至100ml，過濾后取0. Iml用甲醇稀釋到anl，測定該甲醇液在204nm處的最大吸光度值，將該吸光度值與標準曲線對照，計算出膽木總堿干粉中總生物堿的含量為2. 83%。
實施例3(1)用醇的酸性水溶液提取將3kg膽木莖皮粉碎成30 60目的膽木莖皮粉，投入提取罐中，加入10倍膽木莖皮粉質(zhì)量的含量45% (質(zhì)量百分比濃度)乙醇的3% (質(zhì)量百分比濃度)硫酸水溶液，室溫浸泡提取2小時，放出浸出液，同法反復浸泡至異長春花苷內(nèi)酰胺檢出很少時止，過濾提取液后，合并真空濃縮至幾無醇味，用10%氫氧化鉀調(diào)節(jié)溶液的pH到6. 5^7. 0，再繼續(xù)濃縮至密度為1. 16^1. 17，冷藏過夜后過濾，即得到膽木總生物堿濃縮液3. 5升。將該濃縮液真空濃縮干燥即可得到膽木總堿粉2 克。
(2)總堿粉中膽木總生物堿含量的測定精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺l.OOmg置IOOml量瓶中加甲醇溶解后稀釋至刻度，精密量取0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml用甲醇分別稀釋到aiil，用紫外可見分光光度計測定 206nm處的吸光度值，制作標準曲線。取上述總生物堿干粉0. 100g，用70%甲醇水溶解稀釋至100ml，過濾后取0. Iml用甲醇稀釋到anl，測定該甲醇液在203nm處的最大吸光度值，將該吸光度值與標準曲線對照，計算出膽木總堿干粉中總生物堿的含量為2. 54%0
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
所述的石墨粉為納米級顆粒，直徑為40nm、純度大于等于99. 5%、密度為2^0kg/3m ο
所述的碳纖維直徑為5 μ m、長徑比為10 :1、密度為1780kg/m3。
權利要求
1.膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)用醇的酸性水溶液滲濾提取將膽木莖皮和葉粉碎成粗粉后，用醇的酸性水溶液浸泡提取，其中醇的質(zhì)量百分比濃度35 75%，酸性水溶液的質(zhì)量百分比濃度1 3%，第一遍滲濾液直接濃縮，第二遍以后的滲濾液視浸出物濃度反復使用于新的藥材粉，循環(huán)浸泡提取至膽木莖皮和葉粉中的生物堿浸提取干凈為止，采用薄層層析法以異長春花苷內(nèi)酰胺在365nm紫外光燈下的顯色斑點為標準；(2)總生物堿濃縮液制備于5(T60°C真空減壓回收醇至水溶液無醇味后，加堿水中和至pH6. 5 7. 0，繼續(xù)濃縮至密度1. 16^1. 17，4°C放置過夜，過濾得到總生物堿濃縮液；(3)總生物堿干粉或干浸膏的制備將(1)中得到的提取液回收醇至水溶液無醇味后，加堿水中和至PH6. 5 7.0，繼續(xù)濃縮至密度1. 16^1. 17噴霧干燥或真空濃縮后再真空干燥得到總生物堿干粉或干浸膏；(4)總生物堿含量的測定精密稱取異長春花苷內(nèi)酰胺1. OOmg置IOOml量瓶中加甲醇溶解后稀釋至刻度，精密量取0. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. Oml用甲醇分別稀釋到aiil，用紫外可見分光光度計測定 206nm處的吸光度值，制作標準曲線；取上述總生物堿濃縮液Iml加入IOOml容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，取總生物堿干粉或浸膏0. 2g于IOOml容量瓶中用甲醇溶解稀釋至刻度， 測定該甲醇液在206nm處的吸光度值，將該吸光度值與標準曲線對照即可確定濃縮液、干粉或浸膏中總生物堿的含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述步驟 (1)中膽木莖皮和葉粉是30 60目的膽木莖皮粉。
3.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述步驟(1)中醇的酸性水溶液，其中醇是甲醇或乙醇；其中的酸是鹽酸、醋酸或硫酸。
4.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述步驟(2)中提取液的濃縮采用真空減壓濃縮的方法，濃縮時的溫度范圍為5(T60°C；用于中和酸的堿水是濃氨水、氫氧化鈉或氫氧化。
5.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中濃縮液應減壓濃縮至濃縮液的密度為1.16^1. 17，真空干燥的溫度為5(T60°C。
6.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述膽木濃縮液、膽木總堿干粉中總生物堿的含量測定采用異長春花苷內(nèi)酰胺為標準品做標準曲線作為對照。
7.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述步驟 (1)中所用的薄層層析條件為，用GF254熒光硅膠或硅膠G為載體，制備薄層層析板，以氯仿 甲醇乙酸乙酯等于9 :1 :3為展開劑，在365nm紫外光燈下顯色觀察。
8.根據(jù)權利要求1所述的膽木莖皮和葉中生物堿的提取方法，其特征在于所述總生物堿含量測定中所用的紫外吸收波長范圍是203 210nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及膽木莖皮和葉中總生物堿的提取方法。該方法步驟為(1)用醇的酸性水溶液滲濾提取，(2)總生物堿濃縮液制備，(3)總生物堿干粉或干浸膏的制備，(4)總生物堿含量的測定。本發(fā)明的有益效果(1)降低了提取溫度和濃縮溫度，減少了提取物的受熱時間，節(jié)約了能耗；提高了生物堿活性成分的浸出效率、浸出比例和浸出量；避免或減少了穩(wěn)定性差的生物堿的破壞或變質(zhì)，能有效獲得膽木總生物堿提取物或總堿干粉。(2)減少了制備工序，減少了總生物堿的損失。(3)醇的酸性水溶液得到的總生物堿的濃度提高了1/3，活性生物堿的類型增加了超過1倍。(4)提出了簡便的測定膽木提取物中總生物堿的測定方法，選定了總生物堿測定的波長范圍。
文檔編號A61P11/04GK102526277SQ20121002734
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月8日 優(yōu)先權日2012年1月30日
發(fā)明者李爭光, 李秀峰, 蒲含林, 賴潛 申請人:海南制藥廠有限公司