專利名稱：一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶制劑，具體提供了一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥，所含的有效成份為蛇毒類凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活劑(FXA)，特別是對該藥物中FXA的分離純化工藝以及復(fù)合制劑處方進(jìn)行了優(yōu)選。
背景技術(shù)：
1934年Macfarlane等發(fā)現(xiàn)蝰蛇蛇毒具有十分顯著的使血液凝固作用，當(dāng)它稀釋1000倍時(shí)還能在17秒鐘使血友病病人的血液凝固(參見The Lancet，Drs.Macfarlane&BarnettHaemostatic Possibilities ofSnake-venom，Nov，3，1934，985-987)。國外早期一些地區(qū)將其用作外用止血藥(參見The Lancet，Clinical and Labboratory Notes，F(xiàn)eb.22，1936，428)，當(dāng)時(shí)使用的是未經(jīng)分離純化的全毒，如Stypven(Wellcome UK)，該產(chǎn)品多用作診斷試劑(參見BloodReviews7，176-189，1993)。
1963年奧地利學(xué)者Von Klobusitzky首次從巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)毒液中分離出多種凝血成份，發(fā)現(xiàn)它們在凝血的不同水平起作用。第一個(gè)分離純化的凝血成份是Batroxobin，它是一種絲氨酸蛋白水解酶(Thrombin-LikeEnzyme——類凝血酶)，也就是所說的巴曲酶(Stocker，K.，&Egberg，n.，1973，Thromb.Diath.Haemorrh.1，361；Stocker，K.，&Barlow，G.H.，1976，MethodEnzymol.45，214；Holleman，W.H.，&Weiss，L.J.，1976，J.Biol.Chem.251.1663)。Batroxobin酶切哺乳動(dòng)物的血漿纖維蛋白原中纖維蛋白肽A，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，因此在體外能引起血漿纖維蛋白的凝聚，起凝血作用(Funk，C.，等，1975，J.Br.J.Haematol.21，43)。但在體內(nèi)它不激活凝血因子V和凝血因子VIII(Niewiarowski等，1977，Trombin Res.10.863；Niewiarowski等，1979，iochemistry，21，3437；Kirby等，1979，Biochemistry，18，3564)，所以由其水解產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊的側(cè)鏈不能交聯(lián)，易被纖維蛋白溶酶降解，導(dǎo)致體內(nèi)纖維蛋白原濃度降低而表現(xiàn)出抗凝效應(yīng)，從而影響動(dòng)物的出血—凝血過程。Bothrops atrox蛇毒中還含有一種止血成份，即凝血因子X激活劑(FXA)(Nahas等，1964，Thromb.Diath.Haemorrh.12，355；Nahas等，1979，Thromb.Haemorrh，41，314；Hofmann等，1983，Biochemistry，65，201)。它是經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析，凝膠過濾柱層析等純化方法得到的活性成份，其分子量為75000，還原SDS-PAGE電泳證實(shí)，它是由分子量為59000的重鏈和分子量為15000的輕鏈聚合體通過二硫鍵所組成(Hofmann等，1987Biochemistry，26，780)。FXA能將凝血因子X轉(zhuǎn)化為具有酰胺活性和凝血活性Xa或中間物。FXA激活凝血因子X時(shí)被Ca2+離子激活，F(xiàn)XA對合成底物TAME、S-2238、S2337沒有水解活性。當(dāng)將FXA和來源于Vipera russelli(或Daboia russelli)的RVV-X相比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者均能特異地激活凝血因子X，在凝血因子X的重鏈的Arg52-Ile53鍵切斷，釋放出52個(gè)殘基的活性肽Xa。與RVV-X不同的是，F(xiàn)XA還有另外兩個(gè)酶切位點(diǎn)一個(gè)是在重鏈的N末端，產(chǎn)生因子Xμ，另一個(gè)在因子Xaα的末端，產(chǎn)生的因子Xaγ。
國外進(jìn)口的Reptilase(中文商品名立止血)或Hemocoagulase(參見Handb Exp.Pharm.52Snake Venom and Blood Coagulation 1991，Reprinted by SigmaChemical Company)是由從巴西矛頭蝮蛇(Bothrops atrox)中提取的類凝血酶(巴曲酶)制成的止血藥物制劑。
國內(nèi)有立止血仿制品—巴曲亭，也是從巴西矛頭蝮蛇中提取的類凝血酶(巴曲酶)成份制成的酶類止血藥。
國內(nèi)也有將凝血因子X活化酶用作診斷的蝰蛇蛇毒試劑盒，用來診斷血漿中凝血因子X是否缺乏。2000年4月5日公開的中國專利，申請專利號是CN1249338A，題目一種高效提取凝血因子X活化酶的方法。純化后的RVV-X主要用于腫瘤遷移機(jī)理等科研領(lǐng)域的研究。
另一相關(guān)專利是2004年8月18日公開的中國專利，其申請專利號是CN1520880A，題目一種止血藥。首次將來源于Vipera russelli(或Daboiarusselli)RVV-X作為止血藥的主要成份，并將蛇毒類凝血酶作為協(xié)同劑。眾所周知，RVV-X是金屬蛋白酶，其分子量為92880D，由分子量57600D的重鏈和分子量分別為16400D、19400D兩條輕鏈通過二硫鍵組成。它是凝血研究外源激活劑最好的例子。
事實(shí)上，作為大分子量蛋白藥物，對人體很容易引起不良的免疫應(yīng)答反應(yīng)，如發(fā)熱反應(yīng)，產(chǎn)生抗體，形成份子量較大免疫復(fù)合物，對腎小球造成一定損傷，從而限制了其使用劑量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥，該止血藥可以在保證療效的同時(shí)，盡量降低蛋白酶的用量，從而減少了發(fā)生不良免疫應(yīng)答反應(yīng)幾率。
本發(fā)明提供了一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述藥物的主活性成份為純度大于97％的類凝血酶和凝血因子X激活劑，類凝血酶和凝血因子X激活劑的活性比例范圍為1∶1～1000∶1。較佳的活性比例范圍是20∶1～500∶1。
本發(fā)明原于蛇毒的復(fù)方止血藥中，所述的類凝血酶是巴西矛頭蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中含有的類凝血酶，或者是通過基因工程獲得的重組巴西矛頭蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的類凝血酶。
本發(fā)明原于蛇毒的復(fù)方止血藥中，所述的凝血因子X激活劑是巴西矛頭蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活劑FXA、或基因工程重組FXA；或者是來源于蝮蛇Vipera russelli或Daboia russelli的凝血因子X成份，或其基因工程重組產(chǎn)物。
本發(fā)明原于蛇毒的復(fù)方止血藥中，最佳的選擇為，類凝血酶是巴西矛頭蝮蛇的類凝血酶——巴曲酶，凝血因子X激活劑是巴西矛頭蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活劑FXA，其中還可以含有氨基酸成份作為蛋白酶保護(hù)劑，氨基酸首選為甘氨酸，可以以甘露醇為賦形劑，其中類凝血酶+凝血因子X激活劑∶甘氨酸∶甘露醇的量為20～0.1∶1～0.01∶0.02～0.06單位∶克∶克。
本發(fā)明原于蛇毒的復(fù)方止血藥中，其凝血因子X激活劑的分離純化方法是采用DEAE-Fast Flow系列陰離子交換樹脂和Sephacryl系列分子篩柱分離實(shí)現(xiàn)的。它的活力鑒定及檢測是通過所謂的生色底物法實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比主要有以下不同。首先是主要藥效成份來源不同?？紤]到凝血因子X激活劑的分子量較大，不適合作為藥物的主要藥效成份，所以本發(fā)明所闡述的止血藥是從巴西矛頭蝮蛇蛇毒中提取的類凝血酶或基因工程重組巴曲酶作為止血藥的主要成份，其藥效顯著，已經(jīng)臨床應(yīng)用，而凝血因子X激活劑作為協(xié)同劑是從巴西矛頭蝮蛇蛇毒中提取的或通過基因工程獲得。其次是兩者的配比完全不同，而且止血活性比前者更強(qiáng)。再次，兩者的應(yīng)用劑量不同，由于止血活性比前者更強(qiáng)，因此，所用劑量較前者低，但止血效果卻優(yōu)于前者。最后是制劑配方不同，本止血藥的制劑配方含有蛋白酶保護(hù)劑甘氨酸和賦形劑甘露醇。
具體實(shí)施例方式1、凝血因子X激活劑的分離純化方法稱取巴西矛頭蝮蛇蛇毒溶于10mM Tris-HCl，pH7.5(含50mM NaCl)，并透析，離心，取上清上陰離子交換柱DEAE-cellulose層析，用上述緩沖液0.05-0.3M NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰?；钚苑逯苯由系接孟嗤彌_液(含75mMNaCl)平衡的Sephadex G-150層析柱層析，并收集活性峰，然后再上DEAE-cellulose柱層析。收集活性峰，凍干，于-20℃條件下保存。產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)，其分子量為75000D，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)，它是由分子量為59000D的重鏈和分子量為14000-15000D的輕鏈通過二硫鍵結(jié)合組成的。與文獻(xiàn)報(bào)道一致(Hofmann等，1987 Biochemistry，26，780)。
2、凝血因子X激活劑的鑒別方法(生色底物法)凝血因子X激活劑能作用于凝血因子X，后者釋放的Xa可作于S-2222或S-2337等生色底物產(chǎn)生p-nitroaniline，通過在405nm波長下檢測吸光度值的變化，來實(shí)現(xiàn)對凝血因子X激活劑的鑒別及活力測定。
3、凝血因子X激活劑的單位定義在如下體系中，于405nm波長處檢測光吸收值并記錄10分鐘內(nèi)光吸收值的變化。
體系①緩沖液1(50mmol/L Tris-HCL pH＝7.5，150mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2，(含1mmol/L Benzamidine hydrochioride)——100μl；②0.5unit/ml的FX——50μl；③待測樣品——50μl；充分混合后于37℃保溫10分鐘；④緩沖液2(200mmol/L Tris-HCL pH＝8.3，150mmol/L NaCl，10mmol/LEGTA)——250μl；充分混勻；⑤2.5mmol/ml S-2337——50μl；迅速混均后測定10分鐘內(nèi)光吸收值的變化。
定義在上述體系下光吸收值變化為0.02±0.005的凝血因子X激活劑的活力為1單位。
同時(shí)，凝血因子X激活劑也可采用體外凝血試驗(yàn)方法進(jìn)行活力檢測。
4、體外凝血試驗(yàn)采用同類產(chǎn)品活性的測定方法進(jìn)行體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為取人—枸櫞酸抗凝血漿0.2ml，加入直徑1cm的試管中，置37℃水浴中保溫3分鐘，加入37℃預(yù)熱的樣品溶液0.2ml，立即混勻計(jì)時(shí)，于40秒開始，檢查血漿凝固情況，記錄初凝時(shí)間，同時(shí)測定3管，3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄60±20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0.2ml人—枸櫞酸抗凝血漿在60秒凝固的酶量，定義為一個(gè)單位。
5、體內(nèi)促凝活性檢驗(yàn)體內(nèi)凝血試驗(yàn)采用小鼠斷尾法。將凝血因子X激活劑和類凝血酶分別配制成適當(dāng)濃度的溶液作為供試品溶液。
取健康小鼠，隨機(jī)分為7組，每組5只，按表中劑量小鼠尾靜脈注射0.5ml，并于注射后15分鐘時(shí)，用剪刀在距小鼠尾尖0.3cm處剪斷，血液自行流出后立即計(jì)時(shí)，到血液凝固停止計(jì)時(shí)。以出血時(shí)間縮短作為判斷止血效果的指標(biāo)。同時(shí)用生理鹽水作為陰性對照。
6、制劑處方篩選本發(fā)明還提供了具有穩(wěn)定作用的止血藥物的制劑處方，該藥物含有類凝血酶、FXA、賦形劑—甘露醇、和蛋白酶保護(hù)劑—甘氨酸。
實(shí)施例1凝血因子X激活劑(FXA)體外凝血試驗(yàn)采用同類產(chǎn)品活性的測定方法進(jìn)行體外凝血試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)方法為取人—枸櫞酸抗凝血漿0.2ml，加入直徑1cm的試管中，置37℃水浴中保溫3分鐘，加入37℃預(yù)熱的樣品溶液0.2ml，立即混勻計(jì)時(shí)，于40秒開始，檢查血漿凝固情況，記錄初凝時(shí)間，同時(shí)測定3管，3管初凝時(shí)間誤差應(yīng)小于20秒。若初凝時(shí)間小于40秒，則適當(dāng)稀釋供試品溶液，記錄60±20秒內(nèi)凝固的供試品溶液濃度，在上述條件下，能使0.2ml人—枸櫞酸抗凝血漿在60秒凝固的酶量，定義為一個(gè)單位。計(jì)算效價(jià)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。
表1凝血因子X激活劑(FXA)體外凝血試驗(yàn)結(jié)果


本試驗(yàn)確定本品的活力為500u/ml。
表2類凝血酶(巴曲酶)體外凝血試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)確定本品的活力為1000u/ml實(shí)施例2類凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活劑協(xié)同體外凝血試驗(yàn)用濃度為500u/ml的類凝血酶(巴曲酶)和濃度為500u/ml凝血因子X激活劑按下表所需配比進(jìn)行配制供試品溶液，保證終溶液的活力理論值為500u/ml。陽性對照1為1單位的類凝血酶(巴曲酶)，陽性對照2為1單位的凝血因子X激活劑，陰性對照為生理鹽水。
表3類凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活劑協(xié)同體外凝血試驗(yàn)結(jié)果


實(shí)施例3類凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活劑單獨(dú)以及協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)按照臨床研究指導(dǎo)原則，體內(nèi)凝血試驗(yàn)采用小鼠斷尾法。結(jié)合類凝血酶(巴曲酶)臨床用量情況我們選擇20～0.1單位/60kg這一范圍分別對類凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活劑選擇四個(gè)點(diǎn)作小鼠的體內(nèi)凝血試驗(yàn)，小鼠按人的用藥劑量作相應(yīng)的調(diào)整，依照相關(guān)的比例調(diào)整后的用藥劑量為8～0.04u/kg。
具體方法如下取凝血因子X激活劑和類凝血酶(巴曲酶)分別配置適當(dāng)濃度的溶液作為供試品溶液。
取健康小鼠，隨機(jī)分為7組，每組5只，按表中劑量小鼠尾靜脈注射0.5ml，并于注射后15分鐘時(shí)，用剪刀在距小鼠尾尖0.3cm處剪斷，血液自行流出后立即計(jì)時(shí)，到血液凝固停止計(jì)時(shí)。以出血時(shí)間縮短作為判斷止血效果的指標(biāo)。同時(shí)用生理鹽水作為陰性對照，用立止血陽性作為陽性對照。結(jié)果見下表注“-”為縮短出血時(shí)間，“+”為延長出血時(shí)間。
表3類凝血酶(巴曲酶)體內(nèi)凝血試驗(yàn)結(jié)果


表4凝血因子X激活劑體內(nèi)凝血試驗(yàn)結(jié)果

以臨床常規(guī)用量1u為基礎(chǔ)，取凝血因子X激活劑和類凝血酶(巴曲酶)分別配置適當(dāng)濃度的溶液作為供試品溶液。進(jìn)行協(xié)同體內(nèi)止血的試驗(yàn)。陽性對照品為立止血，陰性對照為生理鹽水。其結(jié)果見下表表7類凝血酶(巴曲酶)(A)和凝血因子X激活劑(B)協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)結(jié)果(劑量為0.4u/kg)


試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)類凝血酶和凝血因子X激活劑被制成組合給藥制劑時(shí)，類凝血酶的止血作用得到了協(xié)同，止血作用得到明顯提高?？梢悦黠@地看出類凝血酶與凝血因子X激活劑的止血作用應(yīng)用劑量范圍比為1∶1～1000∶1，其中最優(yōu)應(yīng)用劑量范圍活性比為20∶1～500∶1。同立止血相比，其止血作用更明顯。
實(shí)施例4白眉蝮蛇類凝血酶和凝血因子X激活劑協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)按實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。結(jié)果見表8表8白眉蝮蛇類凝血酶(A)和凝血因子X激活劑(B)體內(nèi)協(xié)同止血試驗(yàn)結(jié)果(劑量為0.4u/kg)

試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉蝮蛇類凝血酶和凝血因子X激活劑同樣在20∶1～500∶1范圍內(nèi)具有協(xié)同止血作用。
實(shí)施例5白眉蝮蛇類凝血酶和凝血因子RVV-X協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)按實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。結(jié)果見表9。
表9白眉蝮蛇類凝血酶(A)和凝血因子RVV-X(B)協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)結(jié)果(劑量為0.4u/kg)

試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉蝮蛇類凝血酶和凝血因子RVV-X也同樣在20∶1～500∶1范圍內(nèi)具有協(xié)同止血作用。
實(shí)施例6尖吻蝮蛇類凝血酶和凝血因子X激活劑體內(nèi)止血試驗(yàn)按實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。結(jié)果見表10。
表10尖吻蝮蛇類凝血酶(A)和凝血因子X激活劑(B)體內(nèi)止血試驗(yàn)(劑量為0.4u/kg)


試驗(yàn)結(jié)果表明，尖吻蝮蛇類凝血酶和凝血因子X激活劑同樣在20∶1～500∶1范圍內(nèi)具有協(xié)同止血作用。
實(shí)施例7尖吻蝮蛇類凝血酶和凝血因子RVV-X協(xié)同體內(nèi)止血試驗(yàn)按實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。結(jié)果見表9見表9 尖吻蝮蛇類凝血酶(A)和凝血因子RVV-X(B)體內(nèi)止血試驗(yàn)(劑量為0.4u/kg)

試驗(yàn)結(jié)果表明，白眉蝮蛇類凝血酶和凝血因子RVV-X同樣在20∶1～500∶1范圍內(nèi)具有協(xié)同止血作用。
實(shí)施例8穩(wěn)定止血藥制劑處方試驗(yàn)按照下表進(jìn)行配比試驗(yàn)。
表11處方試驗(yàn)篩選結(jié)果


從表中數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)加入甘氨酸后制劑的酶活性比沒加入的要穩(wěn)定，其中處方2的活性變化最小，即處方2最穩(wěn)定，從而確定以甘氨酸為穩(wěn)定劑，并且其含量優(yōu)選為8mg/ml。
權(quán)利要求
1.一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述藥物的主活性成份為純度大于97％的類凝血酶和凝血因子X激活劑，類凝血酶和凝血因子X激活劑的活性比例范圍為1∶1～1000∶1。
2.按照權(quán)利要求1所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于類凝血酶和凝血因子X激活劑的優(yōu)選活性比例范圍為20∶1～500∶1。
3.按照權(quán)利要求1所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述的類凝血酶是巴西矛頭蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中含有的類凝血酶，或者是通過基因工程獲得的重組巴西矛頭蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的類凝血酶。
4.按照權(quán)利要求1所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述的凝血因子X激活劑是巴西矛頭蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活劑FXA、或基因工程重組FXA；或者是來源于蝮蛇Vipera russelli或Daboia russelli的凝血因子X激活劑成份，或其基因工程重組產(chǎn)物。
5.按照權(quán)利要求1所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述的類凝血酶是巴西矛頭蝮蛇的類凝血酶——巴曲酶，凝血因子X激活劑是巴西矛頭蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活劑FXA，其中還含有氨基酸成份。
6.按照權(quán)利要求5所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述氨基酸為甘氨酸。
7.按照權(quán)利要求6所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于以甘露醇為賦形劑。
8.按照權(quán)利要求7所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于類凝血酶+凝血因子X激活劑∶甘氨酸∶甘露醇的量為20～0.1∶1～0.01∶0.02～0.06單位克∶克。
9.按照權(quán)利要求1所述原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于其凝血因子X激活劑的分離純化方法是采用DEAE-Fast Flow系列陰離子交換樹脂和Sephacryl系列分子篩柱分離實(shí)現(xiàn)的。它的活力鑒定及檢測是通過所謂的生色底物法實(shí)現(xiàn)的。
10.權(quán)利要求1所述藥物在制備止血性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種原于蛇毒的復(fù)方止血藥，其特征在于所述藥物的主活性成份為純度大于97％的類凝血酶和凝血因子X激活劑，類凝血酶和凝血因子X激活劑的活性比例范圍為1∶1～1000∶1。本發(fā)明止血藥可以在保證療效的同時(shí)，盡量降低蛋白酶的用量，從而減少了發(fā)生不良免疫應(yīng)答反應(yīng)幾率。
文檔編號A61K38/57GK1810258SQ20051004733
公開日2006年8月2日 申請日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者薛百忠, 薛雁, 王宏英, 徐梅, 蘇珊, 沈文彧 申請人:沈陽守正生物技術(shù)有限公司