專利名稱：IL-1Ra的新用途及其腫瘤治療藥物組合藥盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及IL-IRa的新用途及其腫瘤治療藥物組
合藥盒。
背景技術：
近年來，隨著醫(yī)學的進步，現(xiàn)代人類的平均壽命增長至80歲，腫瘤的發(fā)病率明顯增高。腫瘤與心腦血管病成為人類健康的兩大殺手，腫瘤的高發(fā)病率和高致死率成為威脅人類健康的重要因素。隨著對腫瘤發(fā)病機制的研究，人們對腫瘤有了進一步的認識。研究表明，腫瘤細胞為生長失控的異常細胞，會由腫瘤原發(fā)部位遷移至其它部位，如果不能夠控制腫瘤的這種擴散作用，腫瘤將侵犯人體的重要器官，引起器官衰竭，最終導致死亡。目前臨床上治療腫瘤的常用方法有外科手術切除腫瘤、放射治療、化學治療和中醫(yī)治療等。鑒于腫瘤是一種全身性的疾病，單純依靠切除腫瘤的治療效果往往不夠理想。據有關資料表明，腫瘤病人確診時，僅有三分之一左右的病人適宜通過手術而治愈。絕大多數(shù)病人確診時已處于癌癥中晚期，需要輔以放射治療和(或)化學藥物治療，因此放化療是當前惡性腫瘤治療和預防復發(fā)的重要手段。但是放化療“敵我不分”，對細胞缺乏選擇性，在殺死腫瘤細胞的同時，同樣殺傷正常細胞，因而放化療雖然是腫瘤治療的重要方法，但仍具有嚴重的毒副作用[4]。放射治療和(或)化學藥物治療的主要副作用是免疫功能抑制和骨髓造血抑制，大部分化療藥物，如環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、5-氮雜胞苷(5-azacytidine or5-azacitidine,5-Aza)等化療藥物會引起胸腺免疫器官的急性損傷以及外周免疫功能的下降，這直接限制了化療的應用，并且化療后病人處于免疫功能缺失的狀態(tài)下，導致感染幾率增加。若病人在化療后無法恢復正常水平的免疫功能，那么病人罹患各種免疫性疾病、 病毒與細菌的感染、以及癌癥復發(fā)的幾率會大大增加。胸腺為機體的重要免疫器官，是T細胞發(fā)育的場所。胸腺T祖細胞來源于骨髓， 其表面標志為⑶3TD4TD8_(triple negative, TN)，具有分化為T細胞、樹突狀細胞或自然殺傷細胞的能力，它在胸腺中經歷了從皮質到髓質的復雜分化過程。TN細胞在胸腺中與微環(huán)境復雜的細胞組分相作用，獲取⑶3分子，成為⑶4TD8_雙陰性(double-negative, DN)細胞。TN細胞與DN細胞都屬于早期的pre-T細胞。隨后，DN細胞在依次經過DN I(CD44+CD25)、DN II (CD44+CD25+)、DN III (CD44XD25+)、DN IV(CD44XD25-)四個階段發(fā)育為CD4、CD8雙陽性細胞(CD4+CD8+double-positive，DP)。皮質中的DP細胞經過T細胞受體(T-cell antigen receptor)基因重排，完成陽性選擇(positive selection, PS)和陰性選擇(negative selection, NS)，發(fā)育為 CD4 單陽性或 CD8 單陽性(single-positive， SP)naive T細胞，被輸送到外周，作為輔助T細胞或殺傷性T細胞發(fā)揮免疫功能?！鞍准毎樗?1 受體拮抗劑”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-lRa)，與 IL-Ia ,IL-I β三者共同屬于IL-I家族成員。IL-IRa是IL_1 a、IL-1 β共同的拮抗劑，它可競爭性的抑制IL-I與其受體IL-IRI結合，阻滯在多個組織和器官中表達IL-I的生物活性。IL-IRa臨床上用于類風濕性關節(jié)炎、敗血癥等疾病。人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物學作用沒有種屬特異性。不同細胞產生的IL-IRa分子量的差異主要由糖基化程度不同所致。已證實，糖基化對IL-IRa生物學活性無影響(R Daig,G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut2000(46) :350-358)。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于解決腫瘤放射治療和/或化學治療過程中免疫功能抑制副作用問題。為此，本發(fā)明公開了一種如下(a)或(b)的蛋白在制備用于治療或保護放療和 (或)化療藥物導致的胸腺急性損傷、胸腺淋巴細胞損傷和(或)外周T淋巴細胞減少的藥物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有放療和(或)化療藥物導致的胸腺急性損傷、胸腺淋巴細胞損傷和(或)外周T淋巴細胞減少活性的蛋白。在一些實施例中，所述胸腺淋巴細胞為胸腺T細胞，胸腺T細胞可為DN T細胞、 DP T細胞、⑶4 SP T細胞或⑶8 SP T細胞。所述外周T淋巴細胞為⑶4+CD45RA+T細胞和 CD8+CD45RA+T 細胞。在一實施例中，所述(b)的蛋白為氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述的蛋白。在一些實施方式中，所述化療藥物可選自烷化劑類藥物、抗代謝類藥物、抗生素類藥物、植物類藥物、激素類藥物、金屬絡合物、或蛋白藥物，其中優(yōu)選為抗代謝類藥物。另一方面，本發(fā)明公開了一種藥物組合物，其含有作為活性成分的上述蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方式中，所述藥物組合物的制劑為腸外給藥制劑，所述腸外給藥制劑可為注射劑或注射用無菌粉末。另一方面，本發(fā)明公開了一種腫瘤治療藥物組合藥盒，其包括腫瘤化療藥物制劑和本發(fā)明所述藥物組合物的制劑。另一方面，本發(fā)明公開了上述蛋白作為活性成分可治療或預防放療或/和化療藥物導致的胸腺急性損傷和/或免疫功能抑制副作用的方法，該方法包括給予個體有效劑量的上述蛋白。另一方面，本發(fā)明還公開了一種治療腫瘤的方法，該方法包括在放療或/和化療藥物前，給予個體有效劑量的上述蛋白。本發(fā)明所述蛋白的新用途可有效地降低治療或預防放療或/和化療藥物導致的胸腺急性損傷和/或免疫功能抑制副作用，將可能為今后臨床腫瘤的治療提供新的選擇。


圖1 胸腺中T細胞的發(fā)育過程示意圖；圖2 重組人白細胞介素-1受體拮抗劑(recombinant human interleukin-1 receptorantagonist, rHuIL-lRa)對5_Aza化療導致的胸腺損傷的保護作用；圖3 :5-Aza化療后不同時間小鼠胸腺的H&E染色圖(低倍鏡)；
圖4 :5-Aza化療后第7天小鼠胸腺切片H&E染色圖(高倍鏡)；圖5 :rHuIL-lRa對5_Aza化療導致的胸腺指數(shù)損傷的保護作用；圖6 :rHuIL-lRa對5_Aza化療導致的胸腺細胞總數(shù)損傷的保護作用；圖7 胸腺細胞增殖的檢測；
具體實施例方式在本文，術語所述“白細胞介素-1受體拮抗劑”(interleukin-1 receptor antagonist，IL-IRa)，與 IL-Ia、IL-I β 三者共同屬于 IL-1 家族成員。IL-IRa 是 IL-1 a、 IL-I β共同的拮抗劑，能拮抗IL-I與其受體interleukin-1 receptor I(IL-IRI)的結合， 并抑制IL-I的生物學活性。人成熟形式的IL-IRa(hIL-IRa)的氨基酸序列如SEQ IDN0. 1 所述，人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物學作用沒有種屬特異性。不同細胞產生的IL-IRa分子量的差異主要由糖基化程度不同所致。已證實，糖基化對IL-IRa生物學活性無影響(R Daig, G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut 2000 (46) :350-358)。本發(fā)明的所述蛋白質優(yōu)選該物質是hIL-IRa蛋白質及其突變體；其功能性活性片段或其類似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ ID NO. 1描述的氨基酸序列的蛋白質的載體例如DNA載體(質?；虿《?。功能性活性片段或類似物可通過添加、插入、 修飾、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多個氨基酸殘基而形成。術語“類似物”也包括嵌合蛋白質、融合蛋白、抗獨特型抗體、上述化合物的前體和其它功能等效物或模擬物。也包括模擬IL-IRa結合蛋白活性的合成體。術語“突變體”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述hIL_lRa的突變體。相比于天然的IL-IRa蛋白，該突變體與它們野生型相比，具有增強的活性和/或改變了的立體專一性。天然蛋白的氨基酸序列突變體可通過向本發(fā)明的核苷酸中引入適當?shù)暮塑账嶙兓?或通過體外合成所需多肽來制備。這些突變體包括，例如缺失、插入或替換該氨基酸序列中的殘基?？梢酝ㄟ^缺失、插入和替換的組合以得到最終的構建體，提供最終的蛋白產品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)確定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^ 的·歹lHii 至少為15個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為15個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為50個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為50個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為100個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為100個氨基酸的區(qū)域進行測試。更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為250個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為250個氨基酸的區(qū)域進行測試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長度至少為500個氨基酸時，GAP分析就在參與測試的兩個序列的至少為500個氨基酸的區(qū)域進行測試。本發(fā)明涉及的方面還包括IL-IRa蛋白類似物，在它們合成期間或合成后進行了不同的修飾，例如，通過生物素化、芐基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、由已知保護/封閉基團的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細胞配體上等。這些修飾可以用來增加本發(fā)明IL-IRA蛋白的穩(wěn)定性和/或生物活性。藥物組合物用于本發(fā)明或者含有本發(fā)明所述蛋白的藥物組合物。通常，當本發(fā)明藥物組合物用于上述用途時，所述蛋白可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等?！八帉W上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)即有合理的效益/風險比的物質?！八帉W上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。本發(fā)明的蛋白可經過口服、靜脈內、肌內或皮下途徑給藥。上述劑型中可經口服給藥的劑型為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、醑劑。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖、白陶土、微粉硅膠、滑石粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮。而液態(tài)載體包括無菌水、乙醇、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制備藥物組合物的過程中通常使用的佐劑包括調味劑、著色劑、防腐劑(如羥苯烷基丁酯、苯甲酸鈉、山梨酸)和抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉和二丁基羥基甲苯)。上述劑型中可用于注射途徑給藥的劑型包括注射劑、注射用無菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合制成以供注射給藥的形式。溶劑包括無菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、 等滲調節(jié)劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是凍干粉針劑。本發(fā)明的藥物組合物可根據熟知的及公認的制藥生產要求的方法制備。藥物組合物適宜包含本發(fā)明的蛋白質以及藥學上可接受的載體，并適宜為單位劑量形式。本發(fā)明的藥物組合物可包含前藥形式的本發(fā)明的蛋白質，該前藥可在接受者宿主體內代謝轉化成本發(fā)明物的活性形式。本發(fā)明公開了一種腫瘤治療藥物組合藥盒，其包括腫瘤化療藥物制劑和本發(fā)明所述藥物組合物的制劑。用途公開了所述蛋白作為活性成分可以治療或預防放療或/和化療藥物導致的胸腺急性損傷和/或免疫功能抑制副作用的方法，該方法包括給予患者有效劑量的上述(a)或 (b)所述的蛋白。在一些實施方式中，所述方法可通過化療藥物給藥前給藥方式、放療給藥方式，給予患者有效劑量的上述(a)或(b)所述的蛋白?！坝行┝俊被颉爸委熈俊本侵缸阋援a生療效的量。有效量可分一或多次給藥。通常，有效量足以緩和、改善、穩(wěn)定、減慢或延遲疾病的進一步發(fā)展。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴重程度而變化。對大部分大型哺乳動物而言，每天施以有效成分的總劑量約為0. Ol-IOOOmgo通常，成人臨床給藥量的范圍為0. 01-200mg/日，優(yōu)選為0. 05-100mg/日。
在一些實施方式中，所述化療藥物可選自烷化劑類藥物、抗代謝類藥物、抗生素類藥物、植物類藥物、激素類藥物、金屬絡合物、或蛋白藥物，其中優(yōu)選為抗代謝類藥物。抗代謝類藥物選自脫氧氟尿苷、5-脫氧氟尿苷、氟脲苷、丙硫氧嘧啶、丁基氟尿嘧啶、雙喃氟啶、 5-氟嘧啶醇、磺巰嘌呤鈉、巰咪嘌呤、6-巰基嘌呤、6-氨基嘌呤鹽酸鹽、甘氨硫嘌呤、硫烏嘌呤、溶癌呤、硫酸胼、衛(wèi)康醇、亞絲醌、芬可洛寧、異優(yōu)散酮、抑素、氯屈磷酸、氯屈磷酸二鈉、 環(huán)亮氨酸、地查枸林、甲黃酸地查枸林、白瑞夸爾、奧昔嘌醇、澳馬利特、溴巴酸(鈉)、百利德定、溴脲苷、氟脲己胺、10-乙基去氮氨蝶呤、氟甲氨蝶呤、二氧甲氨蝶呤、5，10-雙去氮四氫葉酸、甲滿蝶呤、丁巰嘌呤、丁克他酰胺、胱氮雜烏苷、卡莫氟、尿嘧啶替加氟、戊稀吲哚、 硫若星、優(yōu)福定、甲氧檗因、甲酰溶肉瘤素、氨(基)蝶呤、氨蝶呤鈉、8-氮鳥嘌呤、二甲胺腺苷、(硝基)咪唑硫嘌呤、尿嘧啶、巰甲脲嘧啶、重氮絲氨酸、雷替曲塞、雷替曲占、鹽酸洛拉曲克、槐定堿、甲酰四氫葉酸、甲基四氫高葉酸、唑來磷酸、替莫唑胺、比卡魯胺、門冬酰胺酶、左亞葉酸鈣、亞葉酸鈣、坤來斯巴、三嗪苯酰胺、曲麥克特、曲馬多、氯巴比酸、5-重氮脲嘧啶、吡拉西坦、托泊替康、鹽酸拓撲替康、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、羥基胍、5-氟尿嘧啶核苷、 5-氟尿嘧啶脫氧核苷、氟脲嘧啶脫氧核苷、甘油柑堿、阿壘可散、異惡唑醋酸、氨格魯米特、 氨萘非特、氯胞苷、阿他美坦、氮雜胞苷、抗瘤氨酸、脫氧氮雜胞苷、右雷佐生、克雷斯托、克尼斯他酸、克拉利平、克拉利賓、加洛他濱、吉西他濱、伊巴他濱、依諾他濱、安西他濱、地西他濱、氟西他濱、卡培他濱、依諾他濱、咪唑他濱、克蘭非魯、卡拉酰胺、卡唑酰胺、卡巴萘醌、 偶氮苯溴丙胺、姜黃素、姜黃素二酮、酮曲沙、三甲曲沙、斯?jié)姽艑?、去氧斯?jié)姽艑帯⑤岭辶姿岚?、氯化地特卡里、磷酸氟達那苷、氟芐噻酮、藤黃酸、戈舍瑞林、氮枸嶺、海尼白瑞寧、肌苷二醛、氯苯氨啶、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、柯替波斯地、益若藍精、多潘、美洛格瑞、丙米腙、 迷托醌、米托坦、法扎拉濱、氟達拉濱、克拉屈濱、戊糖苷、苯來寧、苯來美特、磷嘧阿澤胺、匹毛尼唑、聚烯瑞尼酸、蝶酰天冬氨酸、蝶酰三谷氨酸、嘌米舌泊、利波腺苷、雙曲秦、裂裥多糖、溴茴丙烯酸鈉、氨偶氮芐、曲丁磺酯、三乙密胺、三亞胺醌、曲西瑞賓、磷酸曲西瑞賓、雷藤素甲、曲普瑞林、九布洛唑、優(yōu)福定、維他命B-17、威麥寧、ζ-氮雜腺苷、扎西胞苷、依匹哌啶、阿莫諾期、阿多來新、阿克羅寧、阿拉諾新、阿美蒽醌、阿那曲唑、阿那西戎、阿那昔酮、 阿斯吲醒、阿西維辛、阿替韋啶、艾多昔芬、癌可萘、昂究吉寧、個魯達卜辛、抗瘤酮、抗瘤酮 A-10、阿沙芳、蘆筍精、芥吲酸、白瑞夸爾(鈉)、(鹽酸)必桑郡、格拉司瓊、托烷司瓊、氮烯咪胺、恩丹西酮、胸腺素、曲馬多、甲磺酸伊馬替尼、雙氯芬酸、沙利度胺、托氟殺星、托瑞米芬、安溴索、高烏甲素、耐普等因、胸腺肽、氟他胺、乙亞胺、胺苯、氧化新喹、N-甲基甲酰胺、 牢可達唑、蒽甲硫脲、奧昔舒侖、氧化石蒜堿、泊芬撒爾、泊澤尼普定、戊必羅爾、螺氯丙醇、 原白頭翁素、佳代胞、雷替尼卜定、生索拉德、素道霉素、茄軟酯堿、亞胺醌、斯替苯嘧啶、泰莫佐羅、臺多西隆、硫奧里發(fā)新、硝氨丫啶或安丫啶中的一種或多種，其中最優(yōu)選為5-氮雜胞苷。化療藥物給藥劑量按照公知有效劑量給藥，如5-氮雜胞苷臨床一般為靜脈注射， 每次l-2mg/kg, 1次/日。另一方面，本發(fā)明還公開了一種治療腫瘤的方法，該方法包括在放療或/和化療藥物前，給予個體有效劑量的上述蛋白。本發(fā)明的藥物組合物還可與其它腫瘤療法聯(lián)合應用，如同時、序貫或分別應用。本發(fā)明的藥物組合物可包含有其它活性作用物。以下結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中，“rHuIL-lRa”、“IL-lRa”為同一物質，均為上文所指“hIL-IRa”。材料與方法主要試劑5-氮雜胞苷(5-Aza，Sigma公司)、福爾馬林溶液多聚甲醛)、細胞膜通透劑 (0. 1 % Triton χ-100/0. 1 %檸檬酸鈉 /PBS ρΗ 值 7. 2 7. 4)、BrdU (Sigma 公司)實驗動物SPF級BALB/c小鼠，4周，雄性，上海斯菜克實驗動物中心。實驗方法1、5-氮雜胞苷(5-Aza)腹腔注射1)小鼠腹腔注射使用無菌一次性ImL注射器。2)腹腔注射時右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下。進針時從腹部一側進針，向腹中線方向進針約Icm 后注射完藥物，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。3) 5-Aza 注射劑量為 10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg，給藥容積為 0. 1-0. 2mL02、小鼠胸腺的獲取與稱重1)胸腺位于胸腔前縱隔，緊靠心臟，呈灰白色，分左、右兩葉。2)斷頸處死小鼠，投入盛有IOOmL的75%酒精中浸透，拎出后將小鼠仰面翻鋪于超凈臺上一個消毒醫(yī)用托盤內的消毒紗布上引頸處死小鼠。3)用眼科鑷小心捏起小鼠胸腔部的皮膚，用眼科剪小心剪開皮膚，并分離皮膚與肌肉組織。在小鼠胸腔隔膜下向上剪斷胸骨，打開胸腔。4)輕輕撥開心臟，注意不要刺破心臟或血管，露出胸腺，將胸腺及周圍的組織剪下，置于干凈的玻璃培養(yǎng)皿中。5)用無菌PBS輕輕沖洗胸腺組織，在衛(wèi)生紙上輕輕吸去胸腺表面的血液及其他液體，盡量吸凈。6)用眼科剪小心去除胸腺表面的結締組織與淋巴組織，盡量去除干凈后，用精密分析天平稱重。3、胸腺指數(shù)胸腺指數(shù)=胸腺重(mg) /體重(g)4、胸腺細胞總數(shù)1)將胸腺置于干凈的200目篩網上。篩網下置一干凈的培養(yǎng)皿。2)加入 l-2mL 10% FBS/RPMI 1640 培養(yǎng)基至篩網上3)用玻璃注射器的針栓在篩網上輕輕研磨胸腺，直至無可見的塊狀胸腺組織。4)用3-5mL含10% FBS/RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗篩網，盡量沖洗干凈，避免篩網上有殘留的胸腺細胞。10% FBS/RPMI 1640培養(yǎng)基流入篩網下方的培養(yǎng)皿中。5)收集培養(yǎng)皿中的胸腺細胞研磨液，加入15mL無菌離心管中。6) 1600rpm 離心 5 分鐘。7)用預冷的0. 5% FBS/PBS洗滌一次。
8)將細胞重懸于2mL 5mM EDTA/PBS中，如有塊狀懸浮物，盡量用槍頭吹打均勻， 如若不能，則棄去。9)取10 μ L胸腺細胞重懸液，加入事先準備好的血細胞計數(shù)儀稀釋液中，上下顛倒混勻。用血細胞計數(shù)儀進行檢測。5、胸腺組織固定用預冷的PBS沖洗胸腺；將沖洗后的胸腺放入新鮮配制的4%多聚甲醛固定液中， 其中固定液體積應大于10倍的胸腺體積；常溫固定，至少固定M小時；每1-2星期更換固定液，可常溫長時間保存。6、胸腺T細胞亞群增殖檢驗方法如上4制備胸腺細胞重懸液，加入PE-⑶4和PE-Cy5_⑶8抗體進行表面抗原標記后，用2%多聚甲醛固定細胞，0. Triton X-100/0. 1 %檸檬酸鈉透化細胞膜，適宜濃度 DNase I解開DNA雙鏈；胸腺細胞FITC-BrdU抗體染色后先經過前向角(FSC)和測向角散射光(SSC)分析，去除細胞粘連和細胞碎片，分析選中的細胞群。FITC-BrdU抗體染色可見細胞未增殖細胞(BrdU陰性，BrdU_)和增殖細胞(BrdU陽性，BrdU+)區(qū)分明顯，選擇BrdU+/SSC設門劃定增殖細胞，通過同時分析FL2-H和FL3-H雙通道，檢測胸腺細胞⑶4和⑶8表面抗原的分布。下列實施例中，對照組(NS或control)為腹腔注射生理鹽水的小鼠組，給藥組 (rHuIL-IRa或IL-IRa)為腹腔注射rHuIL-IRa的小鼠組。實施例1. 5-Aza化療對胸腺的損傷以及rHuIL_lRa預防性給藥對胸腺的保護在化療前5天連續(xù)注射:3mg/kg/天rHuIL_lRa，在最后一次蛋白給藥M小時內腹腔注射100mg/kg 5-Aza(記為第0天)，在第0天(注射5-Aza前)、1. 5天、3天、7天、11 天、14天分別取對照組與給藥組小鼠胸腺，觀察胸腺指數(shù)與胸腺病理切片H&E染色的變化。實驗結果表明，5-Aza對小鼠胸腺的毒副作用明顯，并引起化療導致的胸腺損傷及修復的過程?；熀蟮?.5天、3天、7天，對照組(NS)小鼠與給藥組(rHuIL-IRa)小鼠胸腺指數(shù)急劇下降。在第3天對照組小鼠胸腺指數(shù)為化療前水平的13. 20%;給藥組為化療前水平的22. 86%，比對照組胸腺指數(shù)高82. 22%，顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學意義(雙尾T 檢驗，η = 4-6)。在第7天，對照組與給藥組小鼠胸腺指數(shù)降低至最低點，表明第7天為化療導致最嚴重的毒副作用時間點，對照組小鼠胸腺指數(shù)為化療前水平的8. 94%，給藥組為 20. 09%，比對照組高136. 1%，顯著高于對照組(雙尾T檢驗，η = 4-6)。在第7天后小鼠胸腺開始迅速恢復。在第14天，對照組小鼠胸腺指數(shù)上升至化療前水平的70. 43%，給藥組恢復至化療前水平的64. 93%，給藥組與對照組間胸腺指數(shù)無顯著差異(圖2)。對化療后第0天、1. 5天、7天、11天和14天的胸腺HE染色切片進行分析，結果表明(1)在化療前，胸腺組織皮質、髓質完整，皮質厚且與髓質有清晰的分界線。對照組與給藥組無顯著差異(圖3)。(2)在化療第1.5天及第7天，胸腺體積，皮質、髓質面積減小，對照組(賂)胸腺皮質髓質界限模糊，給藥組(rHuIL-IRa)胸腺皮質髓質界限清晰。這表明胸腺皮質髓質在 5-Aza注射后受損，且rHuIL-IRa對化療中的胸腺起到了保護作用(圖3，圖4)。(3)在化療后第11天和第14天，通過切片觀察胸腺組織皮髓質完整，面積與厚度
10逐漸恢復至化療前水平，且胸腺皮髓質界限清晰，表明胸腺逐漸恢復(圖3)。通過5-Aza注射后小鼠胸腺指數(shù)與胸腺切片H&E染色圖，可知5_Aza化療后的0 至7天為小鼠胸腺的急性損傷期，在損傷期胸腺重量急劇減小，胸腺指數(shù)下降，其中第7天為胸腺損傷最為嚴重的時間點。rHuIL-IRa預防性給藥能夠在小鼠胸腺的損傷期第3天、第 7天減少化療對小鼠胸腺指數(shù)的減少，并且在第7天能夠減輕小鼠胸腺組織病理學的損傷， 表明rHuIL-IRa能夠減輕5_Aza化療導致的小鼠胸腺損傷。實施例2. rHuIL-IRa預防性給藥保護了胸腺損傷并促進其修復實驗動物為4周齡BALB/c雄性小鼠，實驗設生理鹽水對照組與rHuIL-IRa蛋白給藥組。rHuIL-IRa的給藥劑量為:3mg/kg，在化療前5天每12小時注射一次，注射方式為皮下注射，并以注射同體積無熱源生理鹽水(賂)的小鼠為對照組。在最后一次注射蛋白24h 內，腹腔一次性注射5-Aza 100mg/kgo在第0天(注射5_Aza前)、第7天、第11天分別處死一批小鼠，檢測小鼠胸腺指數(shù)、胸腺細胞總數(shù)、胸腺細胞亞群比例、胸腺細胞增殖、以及外周血初始T細胞的變化。2.1 rHuIL-IRa對胸腺指數(shù)與胸腺細胞總數(shù)的作用實驗設計及小鼠的給藥方法見上述實施例2描述。在化療后的第0天、7天、11天分別取對照組、給藥組小鼠5 6只，處死后分離胸腺，制備胸腺細胞懸液，rHuIL-IRa對胸腺指數(shù)與胸腺細胞總數(shù)的保護作用與實施例1的實驗結果相符合(1)化療后第7天，給藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著高于對照組(圖5) ； (2)化療后第7天，rHuIL-IRa給藥組小鼠胸腺細胞總數(shù)顯著高于對照組，比對照組高131. 11%。第11天胸腺恢復期，rHuIL-IRa給藥組胸腺細胞總數(shù)顯著高于對照組，比對照組高28. 03% (圖6)。2. 2 rHuIL-IRa對胸腺T細胞亞群的作用試驗方法1)實驗設計及小鼠的給藥方法見上述實施例2描述。在化療后的第0天、7天、11 天分別取對照組、給藥組小鼠5 6只，處死后分離胸腺，制備胸腺細胞懸液，計數(shù)細胞濃度。按照下表準備細胞表.1胸腺T細胞亞群表面抗原⑶4、⑶8比例檢測樣品
權利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白在制備用于治療或保護放療和(或)化療藥物導致的胸腺急性損傷、胸腺淋巴細胞損傷和(或)外周T淋巴細胞減少的藥物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQID NO. 1所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有預防或治療放療和(或)化療藥物導致的胸腺急性損傷、胸腺淋巴細胞損傷和(或)外周T淋巴細胞減少活性的蛋白。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述胸腺淋巴細胞為胸腺T細胞。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述外周T淋巴細胞為CD4+CD45RA+T細胞和 (或)CD8+CD45RA+T 細胞。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述胸腺T細胞可為DNT細胞、DPT細胞、 CD4SPT細胞和(或)CD8SPT細胞。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述所述(b)的蛋白為氨基酸序列如SEQID NO. 2所述的蛋白。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述化療藥物可選自烷化劑類藥物、抗代謝類藥物、抗生素類藥物、植物類藥物、激素類藥物、金屬絡合物、或蛋白藥物。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述化療藥物為抗代謝類藥物。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述抗代謝類藥物選自脫氧氟尿苷、5-脫氧氟尿苷、氟脲苷、丙硫氧嘧啶、丁基氟尿嘧啶、雙喃氟啶、5-氟嘧啶醇、磺巰嘌呤鈉、巰咪嘌呤、6-巰基嘌呤、6-氨基嘌呤鹽酸鹽、甘氨硫嘌呤、硫烏嘌呤、溶癌呤、硫酸胼、衛(wèi)康醇、亞絲醌、芬可洛寧、異優(yōu)散酮、抑素、氯屈磷酸、氯屈磷酸二鈉、環(huán)亮氨酸、地查枸林、甲黃酸地查枸林、白瑞夸爾、奧昔嘌醇、澳馬利特、溴巴酸(鈉)、百利德定、溴脲苷、氟脲己胺、10-乙基去氮氨蝶呤、氟甲氨蝶呤、二氧甲氨蝶呤、5，10-雙去氮四氫葉酸、甲滿蝶呤、丁巰嘌呤、丁克他酰胺、胱氮雜烏苷、卡莫氟、尿嘧啶替加氟、戊稀吲哚、硫若星、優(yōu)福定、甲氧檗因、甲酰溶肉瘤素、氨(基)蝶呤、氨蝶呤鈉、8-氮鳥嘌呤、二甲胺腺苷、(硝基)咪唑硫嘌呤、尿嘧啶、巰甲脲嘧啶、重氮絲氨酸、雷替曲塞、雷替曲占、鹽酸洛拉曲克、槐定堿、甲酰四氫葉酸、甲基四氫高葉酸、唑來磷酸、替莫唑胺、比卡魯胺、門冬酰胺酶、左亞葉酸鈣、亞葉酸鈣、坤來斯巴、 三嗪苯酰胺、曲麥克特、曲馬多、氯巴比酸、5-重氮脲嘧啶、吡拉西坦、托泊替康、鹽酸拓撲替康、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、羥基胍、5-氟尿嘧啶核苷、5-氟尿嘧啶脫氧核苷、氟脲嘧啶脫氧核苷、甘油柑堿、阿壘可散、異惡唑醋酸、氨格魯米特、氨萘非特、氯胞苷、阿他美坦、氮雜胞苷、 抗瘤氨酸、脫氧氮雜胞苷、右雷佐生、克雷斯托、克尼斯他酸、克拉利平、克拉利賓、加洛他濱、吉西他濱、伊巴他濱、依諾他濱、安西他濱、地西他濱、氟西他濱、卡培他濱、依諾他濱、咪唑他濱、克蘭非魯、卡拉酰胺、卡唑酰胺、卡巴萘醌、偶氮苯溴丙胺、姜黃素、姜黃素二酮、酮曲沙、三甲曲沙、斯?jié)姽艑?、去氧斯?jié)姽艑?、萘脲磷酸胺、氯化地特卡里、磷酸氟達那苷、氟芐噻酮、藤黃酸、戈舍瑞林、氮枸嶺、海尼白瑞寧、肌苷二醛、氯苯氨啶、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、柯替波斯地、益若藍精、多潘、美洛格瑞、丙米腙、迷托醌、米托坦、法扎拉濱、氟達拉濱、 克拉屈濱、戊糖苷、苯來寧、苯來美特、磷嘧阿澤胺、匹毛尼唑、聚烯瑞尼酸、蝶酰天冬氨酸、 蝶酰三谷氨酸、嘌米舌泊、利波腺苷、雙曲秦、裂裥多糖、溴茴丙烯酸鈉、氨偶氮芐、曲丁磺酯、三乙密胺、三亞胺醌、曲西瑞賓、磷酸曲西瑞賓、雷藤素甲、曲普瑞林、九布洛唑、優(yōu)福定、 維他命B-17、威麥寧、ζ-氮雜腺苷、扎西胞苷、依匹哌啶、阿莫諾期、阿多來新、阿克羅寧、阿拉諾新、阿美蒽醌、阿那曲唑、阿那西戎、阿那昔酮、阿斯吲醒、阿西維辛、阿替韋啶、艾多昔芬、癌可萘、昂究吉寧、個魯達卜辛、抗瘤酮、抗瘤酮A-10、阿沙芳、蘆筍精、芥吲酸、白瑞夸爾 (鈉)、(鹽酸)必?？ぁ⒏窭经偂⑼型樗经?、氮烯咪胺、恩丹西酮、胸腺素、曲馬多、甲磺酸伊馬替尼、雙氯芬酸、沙利度胺、托氟殺星、托瑞米芬、安溴索、高烏甲素、耐普等因、胸腺肽、氟他胺、乙亞胺、胺苯、氧化新喹、N-甲基甲酰胺、牢可達唑、蒽甲硫脲、奧昔舒侖、氧化石蒜堿、 泊芬撒爾、泊澤尼普定、戊必羅爾、螺氯丙醇、原白頭翁素、佳代胞、雷替尼卜定、生索拉德、 素道霉素、茄軟酯堿、亞胺醌、斯替苯嘧啶、泰莫佐羅、臺多西隆、硫奧里發(fā)新、硝氨丫啶或安丫啶中的一種或多種。
9.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述抗代謝類藥物為5-氮雜胞苷。
10.一種腫瘤治療藥物組合藥盒，其包括腫瘤化療藥物制劑和活性成分為權利要求1 所述蛋白的藥物組合物的制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及IL-1Ra的新用途。本發(fā)明公開了一種如下IL-1Ra類蛋白在制備用于治療或保護放療和/或化療藥物導致的胸腺淋巴細胞損傷或或外周T淋巴細胞減少的藥物中的用途。本發(fā)明所述蛋白可有效地降低治療或預防放療或/和化療藥物導致的胸腺急性損傷和/或免疫功能抑制副作用，將可能為今后臨床腫瘤的治療提供新的選擇。
文檔編號A61P35/00GK102370967SQ201010253070
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者于鴻晶, 俞雁, 韓偉 申請人:上海交通大學, 上海伍洋生物醫(yī)藥技術有限公司