專利名稱：用于預(yù)防和治療hiv感染的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的HIV多肽構(gòu)建體、它們在醫(yī)藥中的用途、含有它們的藥物組合物和它們的制備方法。本發(fā)明還涉及編碼該多肽的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明涉及包含HIV-I Nef和HIV-I Gag或其片段的融合蛋白，和編碼它們的多核苷酸。更具體而言，本發(fā)明涉及包含HIV-I Nef、HIV-l Pol和HIV-I Gag蛋白或其片段的融合蛋白和編碼它們的多核苷酸。HIV-I是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的主要原因，AIDS被認為是世界主要健康問題中的ー種。因此需要能夠用于HIV感染的預(yù)防和/或治療的疫苗。
背景技術(shù)：
HIV-I是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒。HIV基因組編碼至少9種蛋白，它們分成三類主要的結(jié)構(gòu)蛋白Gag、Pol和Env、調(diào)節(jié)蛋白Tat和Rev及輔助蛋白Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因組顯示所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3/組構(gòu)。HIV包膜糖蛋白gpl20是用于附著宿主細胞的病毒蛋白。這種附著通過與稱作⑶4的輔助T細胞和巨噬細胞的兩種表面分子和兩種趨化因子受體CCR-5或CXCR-4之ー結(jié)合而介導(dǎo)產(chǎn)生。gpl20蛋白首先表達為較大的前體分子(gpl60)，然后翻譯后裂解產(chǎn)生gpl20和gp41。gpl20蛋白通過與插入到病毒膜中的gp41分子連接而保留在病毒體表面上。gpl20蛋白是中和抗體的主要靶，但遺憾的是，該蛋白最具免疫原性的區(qū)(v3環(huán))也是該蛋白變異性最大的部分。因此，認為gpl20(或其前體gpl60)用作引發(fā)中和抗體的疫苗抗原對于廣泛的保護性疫苗僅具有有限的作用。gpl20蛋白還含有被細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別的表位。這些效應(yīng)細胞能夠消除病毒-感染的細胞，且因此構(gòu)成第二種主要抗病毒免疫機制。與中和抗體的目標區(qū)相反，某些CTL表位似乎在不同HIV株中相對保守。為此，認為gpl20和gpl60是疫苗中的有效抗原性組分，目的在于引發(fā)細胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(特別是CTL)。HIV-I的非包膜蛋白包括，例如內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白如gag和pol基因產(chǎn)物和其它非結(jié)構(gòu)蛋白如 Rev、Nef、Vif 和 Tat (Green 等人，New England J. Med, 324, 5, 308et seq(1991)和Bryant 等人(Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J. ,11,5, 390et seq (1992) HIV Nef是早期蛋白，即它們在感染早期及沒有結(jié)構(gòu)蛋白的情況下表達。Nef基因編碼早期輔助HIV蛋白，其已經(jīng)顯示出具有若干活性。例如，Nef蛋白已知可引起⑶4、HIV受體、和細胞表面的I類MHC分子的下調(diào)，但還沒有討論過這些功能的生物學(xué)重要性。此外，Nef與T細胞信號途徑相互作用并誘導(dǎo)活性狀態(tài)，其依次可促進更有效 的基因表達。某些HIV分離物在該區(qū)具有突變，其引起它們不編碼功能性蛋白且嚴重危害它們的體內(nèi)復(fù)制和發(fā)病。
Gag基因作為前體糖蛋白被翻譯，其被蛋白酶裂解產(chǎn)生產(chǎn)物，該產(chǎn)物包括基質(zhì)蛋白(P17)、衣殼(p24)、核衣殼(p9)、p6和兩個間隔肽，p2和pi。Gag基因?qū)е庐a(chǎn)生55-千道爾頓(kD) Gag前體蛋白，也稱作p55，其自未剪接的病毒mRNA表達。在翻譯過程中，p55的N末端被肉豆蘧?；?，引起它與細胞膜的胞質(zhì)方面相關(guān)聯(lián)。膜相關(guān)的Gag糖蛋白募集病毒基因組RNA的兩個拷貝連同引起病毒顆粒從感染細胞表面出芽的其它病毒蛋白和細胞蛋白。出芽后，在病毒成熟為4個被稱作MA (基質(zhì)[pl7])、CA(衣殼[p24])、NC(核衣殼[p9])、和p6的較小蛋白的過程中，p55被病毒編碼的蛋白酶(pol基因的產(chǎn)物)裂解。除了 3種主要的Gag蛋白外，所有Gag前體均含有若干其它區(qū)，它們被裂解并作為 各種大小的肽保留在病毒體中。這些蛋白具有不同作用，例如，P2蛋白在蛋白酶的調(diào)節(jié)活性中具有預(yù)期的作用并對蛋白分解處理的正確時間控制作出貢獻。pl7(MA)多肽來源于p55的N-末端的肉豆蘧酰化末端。絕大多數(shù)MA分子保持附著于病毒體脂雙層的內(nèi)表面，從而使顆粒穩(wěn)定。MA的一個亞群在病毒體深層募集，它在那里變成復(fù)合物的一部分，其運送病毒DNA到細胞核。這些MA分子可幫助病毒基因組的核轉(zhuǎn)運，這是因為MA上的親核信號可由細胞核輸入機械識別。這ー現(xiàn)象使得HIV感染未-分裂的細胞，這是逆轉(zhuǎn)錄病毒與眾不同的性質(zhì)。p24(CA)蛋白形成病毒顆粒的圓錐形核心。親環(huán)蛋白A已被證實可與p55的p24區(qū)相互作用，導(dǎo)致其摻入到HIV顆粒中。Gag與親環(huán)蛋白A之間的相互作用很重要，因為親環(huán)蛋白A所致該相互作用的破壞可抑制病毒復(fù)制。Gag的NC區(qū)負責(zé)特異性識別HIV所謂的包裝信號。該包裝信號由位于病毒RNA 5’末端附近的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，且足以介導(dǎo)異源RNA插入到HIV-I病毒體中。NC通過由兩個鋅-指基序介導(dǎo)的相互作用與包裝信號結(jié)合。NC也促進逆轉(zhuǎn)錄。p6多肽區(qū)介導(dǎo)p55 Gag與輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導(dǎo)致Vpr摻入到組裝中的病毒體中。P6區(qū)還含有所謂的晚期結(jié)構(gòu)域，其是從感染細胞出芽的病毒體有效釋放所需的。Pol基因編碼含有早期感染中病毒所需的兩種活性的兩種蛋白，即RT和病毒DNA整合到細胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初級產(chǎn)物被病毒體蛋白酶裂解產(chǎn)生氨基末端RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA-依賴性DNA聚合酶活性以及RNA酶H功能)并產(chǎn)生羧基末端整合酶蛋白。HIV RT是全長RT(p66)和缺少羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu)域的裂解產(chǎn)物(P51)的異ニ聚物。RT是由逆轉(zhuǎn)錄基因組編碼的保守性最高的蛋白之一。RT的兩種主要活性是DNAPol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可交換地利用RNA和DNA作為模板且與所有已知的DNA聚合酶一祥，不能開始從頭DNA合成，但需要預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。所有RT蛋白固有的RNA酶H活性在除去作為DNA合成繼續(xù)的RNA基因組的復(fù)制早期起重要作用。它選擇性地使所有RNA-DNA雜交分子的RNA降解。結(jié)構(gòu)上，聚合酶和核糖核酸H占據(jù)分開的、不重疊的結(jié)構(gòu)域，其中Pol覆蓋Pol三分之ニ的氨基。p66催化亞單位折疊成5個不同的亞結(jié)構(gòu)域。它們的氨基末端23具有RT活性部分。這些的羧基末端是RNA酶H結(jié)構(gòu)域。WO 03/025003 描述了編碼 HIV-lpl7/24 Gag、Nef 和 RT 的 DNA 構(gòu)建體，其中該 DNA序列可被密碼子優(yōu)化，從而類似高水平表達的人類基因。這些構(gòu)建體用于DNA疫苗中。含多種HIV抗原的融合蛋白已被建議作為HIV的疫苗候選者，例如WO 99/16884中描述的Nef-Tat融合體。然而，融合蛋白不會直接產(chǎn)生；表達它們有困難是因為它們與天然蛋白不相應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄水平、或其它下游可能有困難。且，它們不能被直接配制成藥學(xué)上可接受的組合物。特別是，包括融合在一起的多種抗原的絕大多數(shù)HIV疫苗形式是DNA或活的載體形式，而不是多肽融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于HIV感染和AIDS的預(yù)防和治療的疫苗中的新的構(gòu)建體。一方面，本發(fā)明提供ー種多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當pl7和p24 Gag同時存在時，它們之間有至少ー個HIV抗原或免疫原性片段。在此處所述本發(fā)明的構(gòu)建體和組合物中，Nef優(yōu)選是全長Nef。在本發(fā)明的構(gòu)建體中，pl7 Gag和p24 Gag優(yōu)選分別是全長pl7和p24。在其中一個實施方案中，該多肽同時包含pl7和p24 Gag或其免疫原性片段。在這類構(gòu)建體中，p24 Gag組分和pl7 Gag組分被至少ー個其它HIV抗原或免疫原性片段，如Nef和/或RT或其免疫原性片段或衍生物分開。可選擇性地，pl7或p24 Gag可分開提供。因此，本發(fā)明還提供一種組合物，它包括(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物；或(i)包含Nef或其免疫原性片段或衍生物和p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽，和(ii)pl7 Gag或其免疫原性片段或衍生物。在另ー實施方案中，本發(fā)明的多肽構(gòu)建體還包括Pol或Pol的衍生物如RT或其免疫原性片段或衍生物。適用于本發(fā)明的RT的特定片段是其中RT在C末端被截短，優(yōu)選使得它們?nèi)鄙亵然┒薘NA酶H結(jié)構(gòu)域的片段。ー個缺少羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu)域的這類片段是此處所述P51片段。優(yōu)選，此處所述融合蛋白中的RT或免疫原性片段是p66 RT或p51 RT。本發(fā)明融合蛋白或組合物的RT組分任選在第592位包括突變，或在除了 HXB2的株中包括等同突變，這樣一來甲硫氨酸通過突變成另ー殘基，例如賴氨酸而被除去。該突變的目的是除去起原核生物表達系統(tǒng)中內(nèi)部起始位點作用的位點。RT組分還，或可選擇性地，包括突變以除去酶活性(逆轉(zhuǎn)錄酶)。因此K231可以代替W存在。在本發(fā)明包含p24和RT的融合蛋白中，可優(yōu)選在該構(gòu)建體中p24在RT之前，這是因為當抗原在大腸桿菌中單獨表達時，觀察到P24的表達較之RT的表達更好。本發(fā)明的優(yōu)選構(gòu)建體包括下列I. p24-RT-Nef-pl7 2. p24-RT*-Nef-pl73. p24-p51RT-Nef-pl74. p24-p51RT*-Nef-pl7
5. pl7-p51RT-Nef6. pl7-p51RT*-Nef7. Nef-pl78.具有接頭的Nef_pl7
9. pl7-Nef10.具有接頭的 pl7_Nef*代表RT甲硫氨酸592突變成賴氨酸上面所列構(gòu)建體中包括的接頭可以是任意較短的氨基酸序列，用于降低與它連接在一起的兩個融合配偶體之間潛在的相互作用。該接頭可以是例如4-10個氨基酸長。例如，它可以是6個氨基酸的序列，如此處實施例所述GSGGGP序列。另ー方面，本發(fā)明提供ー種HIV抗原的融合蛋白，它包括至少4種HIV抗原或免疫原性片段，其中這4種抗原或片段是或來自Nef、Pol和Gag。優(yōu)選Gag作為兩個分開的組分存在，其被融合體中的至少ー個其它抗原分開。優(yōu)選，Nef是全長Nef。優(yōu)選Pol是p66或P51RT。優(yōu)選，Gag是pl7和p24Gag。本發(fā)明這一方面中融合體的抗原組分的其它優(yōu)選特征和性質(zhì)在此處描述。本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實施方案是上面已經(jīng)列出的4種組分的融合體I. p24-RT-Nef-pl72. p24-RT*-Nef-pl73. p24-p51RT-Nef-pl74. p24-p51RT*-Nef-pl7包括在本發(fā)明中的與HIV抗原有關(guān)的術(shù)語“來源干”或“衍生物”是指與天然對應(yīng)物相比，抗原已經(jīng)以有限的方式被改變。這包括點突變，其可改變蛋白的性質(zhì)，例如通過提高在原核系統(tǒng)中表達或除去不希望的活性包括不希望的酶活性。此處對于RT所描述的點突變被設(shè)計用于實現(xiàn)這些情況。然而，該抗原必須保持與天然抗原足夠相似，這樣它們可保留疫苗中所希望的抗原性質(zhì)且因此它們保持能夠引起對天然抗原的免疫反應(yīng)。具體的衍生物是否引起這類免疫反應(yīng)可通過適宜的免疫學(xué)測定法如ELISA(對于抗體反應(yīng))或使用細胞標記和細胞因子的適宜染色的流式細胞術(shù)(對于細胞反應(yīng))測量。本發(fā)明HIV抗原的多肽構(gòu)建體能夠在體外系統(tǒng)包括原核生物系統(tǒng)如大腸桿菌中表達。有利地，它們可通過常規(guī)純化方法純化。當在所選擇的表達系統(tǒng)中表達時，此處所述融合體優(yōu)選可溶，就是它們大量存在于表達系統(tǒng)粗提物的上清液中。粗提物中融合蛋白的存在可通過常規(guī)方法測量，如在SDS凝膠上電泳、考馬斯染色和通過密度測量而檢查適宜的帯。本發(fā)明的融合蛋白優(yōu)選至少50 %可溶，更優(yōu)選至少70 %可溶，且最優(yōu)選90 %或更多可溶，這是通過實施例中所述技術(shù)測量的。提高重組表達蛋白溶解度的技術(shù)是已知的，例如，在原核生物表達系統(tǒng)中，溶解度通過降低誘導(dǎo)基因表達時的溫度而提高?？杉兓颂幩鋈诤系鞍住＞唧w而言，當保持可溶或顯著可溶時可純化它們。此處所述免疫原性片段將含有該抗原的至少ー個表位并顯示出HIV抗原性，且當以適宜構(gòu)建體存在時，能夠提高免疫反應(yīng)，例如當與其它HIV抗原融合或在載體上存在吋，免疫反應(yīng)針對天然抗原。通常，免疫原性片段含有至少20、優(yōu)選50、更優(yōu)選100個來自HIV抗原的連續(xù)氨基酸。本發(fā)明另一方面提供編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸疫苗。該多核苷酸可存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意遞送系統(tǒng)內(nèi)，包括核酸表達系統(tǒng)如質(zhì)粒DNA、細菌和病毒表達系統(tǒng)。許多基因遞送技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的，如 Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198，1998和其中引用的參考文獻描述的那些。適宜的核酸表達系統(tǒng)含有在患者中表達的必需DNA序列(如適宜的啟動子和終止信號)。當表達系統(tǒng)是重組活微生物，如病毒或細菌吋，目標基因可被插入到活的重組病毒或細菌的基因組中。使用該活的載體進行接種和體內(nèi)感染將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達和免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。用于該目的的病毒和細菌是，例如痘病毒(例如牛痘、禽痘、金絲雀痘、修飾痘病毒,例如修飾的病毒Ankara(MVA))、甲病 毒(新培斯病毒、Semliki Forest病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒)、黃病毒(黃熱病病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帯狀皰疹病毒等)、麻疹病毒(例如，麻疹)、李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、奈瑟氏菌、BCG。這些病毒和細菌可以是有毒的，或以各種方式減毒以獲得活疫苗。這種活疫苗形成本發(fā)明的一部分。用作本發(fā)明活載體的優(yōu)選麻疹載體是施瓦茨氏株或從其衍生的株系。用作活載體的優(yōu)選腺病毒是低血清陽性率人腺病毒如Ad5或Ad35或非人來源的腺病毒如非人靈長類動物腺病毒如猿腺病毒。這種低血清陽性率人腺病毒或類似的腺病毒在人群中具有低于60，通常低于50%的血清陽性率。優(yōu)選，載體是復(fù)制缺陷的。通常，這些病毒含有El缺失且可在用El基因轉(zhuǎn)化的細胞系上生長。優(yōu)選的猿腺病毒是從黑猩猩中分離出來的病毒。具體而言，C68(也稱作Pan 9)(見美國專利No6083 716)和Pan 5、6和Pan7 (W0 03/046124)優(yōu)選用于本發(fā)明中。這些載體可被操縱插入本發(fā)明的異源多核苷酸，這樣一來就可表達本發(fā)明的多肽。這類重組腺病毒載體的應(yīng)用、配制和制造在WO 03/046142中詳細描述。因此，本發(fā)明優(yōu)選疫苗的Nef、pl7和p24 Gag和RT可以編碼所需多肽的多核苷酸形式提供。本發(fā)明的多核苷酸可用于在所選擇表達系統(tǒng)中表達編碼的多肽。至少ー個HIV抗原，例如，RT，可被多核苷酸中的密碼子優(yōu)化序列編碼，也就是說該序列已被優(yōu)化以便在所選擇的重組表達系統(tǒng)如大腸桿菌中表達。另ー方面，本發(fā)明提供ー種p51RT多肽或其衍生物或編碼它的多核苷酸,優(yōu)選為在適宜的表達系統(tǒng)，特別是原核生物系統(tǒng)如大腸桿菌中表達而被密碼子優(yōu)化。p51RT多肽或多核苷酸可單獨使用，或與本發(fā)明的多肽或多核苷酸構(gòu)建體組合使用。因此，另一方面，本發(fā)明提供一種組合物，它包括(i)含有Nef或含Nef表位的片段和pl7 Gag和/或p24 Gag的多肽，其中當pl7和p24 Gag同時存在時，它們之間有至少ー個HIV抗原或免疫原性片段，和(ii)p51 RT多肽。本發(fā)明還提供編碼這些的多核苷酸。根據(jù)該實施方案，⑴可選自，例如I. Nef-p172.具有接頭的Nef_pl73. pl7-Nef
4.具有接頭的pl7_Nef優(yōu)選Nef是全長Nef。優(yōu)選pl7是全長pl7。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可與其它抗原或編碼其它抗原的多核苷酸組合。具體而言，這可包括HIV env蛋白或其片段或衍生物。env的優(yōu)選形式是gpl20、gpl40和gpl60。env可以是，例如，WO 00/07631中描述的包膜蛋白，其來源于被稱作R2的HIV-I進化枝B包膜克隆，或其片段或衍生物。因此，本發(fā)明還提供一種組合物，它包含本發(fā)明的任意多肽或多肽組合物，以及HIV env蛋白或其片段或衍生物。類似地，本發(fā)明提供一種組合物，它包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸和編碼HIV env蛋白或其片段或衍生物的多核苷酸。本發(fā)明還提供制備此處所述多肽的方法，該方法包括在適宜的表達系統(tǒng)，特別是原核生物系統(tǒng)如大腸桿菌中表達編碼多肽的多核苷酸，并回收表達的多肽。優(yōu)選在低溫，即 低于37°的溫度下誘導(dǎo)表達，從而促進多肽的溶解。本發(fā)明還提供一種純化此處所述多肽的方法，該方法包括i).提供含未純化多肽的組合物；ii).使該組合物經(jīng)過至少兩個色譜步驟；iii).任選地使該多肽羧基酰胺化；iv)進行緩沖液更換步驟以提供用于藥物制劑的適宜緩沖液中的蛋白。羧基酰胺化可在兩個色譜步驟之間進行。羧基酰胺化步驟可使用碘こ酰亞胺進行。在其中一個實施例中，本發(fā)明方法使用至多兩個色譜步驟。本發(fā)明還提供含本發(fā)明多肽和多核苷酸以及藥學(xué)上可接受的佐劑或載體的藥物組合物和免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明的疫苗可用于HIV的預(yù)防或治療性免疫。本發(fā)明還提供此處所述多肽和多肽組合物以及多核苷酸和多核苷酸組合物在制備用于HIV的預(yù)防或治療性免疫的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的疫苗含有免疫保護或免疫治療量的多肽和/或多核苷酸抗原且可通過常規(guī)技術(shù)制備。疫苗的制備通常在New Trends and Developments in Vaccines, Voller 等人編輯，University Park Press, Baltimore, Maryland, U. S. A. 1978 中描述。在脂質(zhì)體內(nèi)的包囊化由Fullerton, U. S. Patent 4，235，877描述。蛋白與大分子的綴合由Likhite,U. S. Patent 4，372，945 和 Armor 等人，美國專利 4，474，757 公開。疫苗劑量中蛋白的量可選擇為在一般疫苗接種者中誘導(dǎo)免疫保護反應(yīng)，而沒有顯著的不利副作用的量。這種用量將根據(jù)所用具體的免疫原和所選擇的接種方案而變化。通常，預(yù)期各劑含有1-1000 μ g每種蛋白，優(yōu)選2-200 μ g，最優(yōu)選4-40 μ g多肽融合體。具體疫苗的最佳用量可通過標準研究確定，包括受治療者中抗體滴度和其它免疫反應(yīng)的觀察。最初接種后，受治療者可在約4周內(nèi)接受加強免疫，和隨后弟_■次加強免疫。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選與佐劑一起用于本發(fā)明的疫苗制劑中。佐劑一般在VaccineDesign-the Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, PlenumPress, New York, 1995 中描述。適宜的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁或磷酸鋁，但還可以是鈣、鐵或鋅鹽，或可以是?；野彼?、或?；堑牟蝗苄曰鞈乙?，陽離子或陰離子衍生的多糖，或含聚磷腈。在本發(fā)明的制劑中，優(yōu)選佐劑組合物誘導(dǎo)優(yōu)先的Thl反應(yīng)。然而，應(yīng)了解其它反應(yīng)，包括其它體液反應(yīng)也不排除。通過抗原與免疫系統(tǒng)細胞的相互作用，對抗原產(chǎn)生免 疫反應(yīng)。所得免疫反應(yīng)可廣義區(qū)別為兩個極端的種類，即體液或細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(常規(guī)分別由保護的抗體和細胞效應(yīng)機制鑒別)。這些類的反應(yīng)被稱作Thl-型反應(yīng)(細胞-介導(dǎo)的反應(yīng))，和Th2-型免疫反應(yīng)(體液反應(yīng))。極端的Thl-型免疫反應(yīng)可通過抗原特異性的、單倍型限制的細胞毒性T淋巴細胞、和天然殺傷細胞反應(yīng)的產(chǎn)生鑒別。在小鼠中，Thl-型反應(yīng)常常通過IgG2a亞型抗體的產(chǎn)生鑒別，而在人類中，這些相當于IgGl型抗體。Th2-型免疫反應(yīng)的特征在于較寬范圍免疫球蛋白同種型，包括小鼠中IgGl、IgA和IgM?？烧J為這兩種類型免疫反應(yīng)發(fā)展背后的驅(qū)動カ是細胞因子，即許多已經(jīng)確定的蛋白信使，其可幫助免疫系統(tǒng)的細胞并引導(dǎo)最后的免疫反應(yīng)向著Thl或Th2反應(yīng)的方向。因此，高水平的Thl-型細胞因子傾向有利于對已知抗原誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而高水平的Th2-型細胞因子傾向有利于對抗原誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。重要的是應(yīng)記住Thl和Th2_型免疫反應(yīng)的區(qū)別不是絕對的。事實上，個體將支持免疫反應(yīng)，其被描述為占優(yōu)的Thl或占優(yōu)的Th2。然而，常常方便地認為是Mosmann和Coffman在鼠⑶4+ve T細胞克隆中描述的細胞因子家族(Mosmann, T. R.和Coffman,R. L. (1989)THland TH2 cells !different patterns of lymphokine secretion lead todifferent functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173)。通常，Thl-型反應(yīng)與T-淋巴細胞所致INF-Y和IL-2細胞因子的產(chǎn)生有夫。常常直接與Thl-型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)有關(guān)的其它細胞因子不是由T-細胞，如IL-12。相反，Th2-型反應(yīng)與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-β (TNF-β)的分泌有夫。已知特定的疫苗佐劑特別適合于Thl或Th2_型細胞因子反應(yīng)的刺激。通常，接種或感染后，免疫反應(yīng)的Thl Th2平衡的最佳指示劑包括測量使用抗原再次刺激之后，T淋巴細胞體外所致Thl或Th2細胞因子的產(chǎn)生，和/或測量抗原特異性抗體反應(yīng)的IgGl IgG2a 比。因此，Thl-型佐劑是當體外使用抗原再次刺激時，刺激分離的T-細胞群產(chǎn)生高水平Thi-型細胞因子，并誘導(dǎo)與Thl-型同種型有關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白反應(yīng)的佐劑?？膳渲粕a(chǎn)適用于本發(fā)明的佐劑的優(yōu)選Thl-型免疫刺激劑包括且不限于下列。單磷酰脂A，特別是3-脫氧-酰化單磷酰脂A(3D_MPL)是用于本發(fā)明的優(yōu)選Thl-型免疫刺激劑。3D-MPL是由Ribi Immunochem, Montana制造的熟知佐劑。化學(xué)上，常常以3-脫氧-酰化單磷酰脂A與4，5，或6酰化鏈混合物的形式提供。它可通過GB2122204B中教導(dǎo)的方法純化并制備，該文獻還公開了ニ磷酰脂A，及其3_0_脫?；凅w的制備。已經(jīng)描述過其它純化且合成的脂多糖(US 6，005，099和EP O 729473 BI ；Hilgers等人，1986, Int. Arch. Allergy. Tmmunol.，79 (4) :392-6 ；Hilgers 等人，1987, Immunology,60 (I) :141-6 ;和EP 0549074B1)。3D-MPL的優(yōu)選形式是具有直徑小于O. 2 μ m的較小粒度的顆粒制劑形式，且其制備方法在EP O 689 454中公開。皂苷也是本發(fā)明的優(yōu)選Thl免疫刺激劑。皂苷是熟知的佐劑且在Lacai Ile-Dubois, M 和 Wagner H. (1996.A review of the biological andpharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2pp 363-386)中教導(dǎo)。例如，Quil A(來源于南美樹木Quillaja Saponaria Molina的樹皮)及其級分在 US 5，057，540 和“Saponins as vaccine adjuvants，，，KensiI, C. R. , Crit Rev TherDrug Carrier Syst, 1996,12(1-2) :1-55;和 EP 0 362279 BI 中描述。溶血皂苷 QS21 和QS17(Quil A的HPLC純化的級分)已被 描述為有效的系統(tǒng)佐劑，且它們的生產(chǎn)方法在USPatent No. 5，057，540和EP O 362 279 BI中公開。在這些文獻中還描述了 QS7 (Quil-A的非-溶血級分)的用途，其可作為系統(tǒng)疫苗的有效佐劑。QS21的用途在Kensil等人(1991.J. Immunology vol 146,431-437)中進ー步描述。QS21和吐溫或環(huán)糊精的組合也是已知的(W0 99/10008)。包含QuilA級分，如QS21和QS7的顆粒佐劑系統(tǒng)在WO 96/33739和WO96/11711中描述。其中一個這類系統(tǒng)被稱作Iscorn且可含有ー種或多種皂苷。另ー優(yōu)選的免疫刺激劑是含未甲基化的CpG 二核苷酸(“CpG”)的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基序的縮寫詞。當通過全身和粘膜途徑給藥時，CpG在本領(lǐng)域中已知可作為佐劑(W0 96/02555，EP 468520，Davis等人，J. Tmmunol,1998,160(2) :870-876 ；McCluskie 和 Davis, J. Immunol. ,1998,161(9)4463-6)。歷史上，觀察到BCG的DNA級分可發(fā)揮抗-腫瘤作用。在進ー步的研究中，來源于BCG基因序列的合成寡核苷酸顯示出能夠誘導(dǎo)免疫刺激作用(不論體外還是體內(nèi))。這些研究的作者推斷出特定的回文序列，包括中心的CG基序，具有該活性。CG基序在免疫刺激中的重要作用隨后在Krieg，Nature 374，p546 1995的出版物中說明。詳細分析顯示CG基序必須位于特定的序列背景中，且這類序列在細菌DNA中是常見的，但在脊椎動物DNA中卻是稀有的。免疫刺激序列常常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序沒有甲基化；但其它未甲基化的CpG序列已知是免疫刺激性的且可用于本發(fā)明中。在六個核苷酸的特定組合中，存在回文序列。一些這樣的基序，或者作為其中ー個基序的重復(fù)單位，或者作為不同基序的組合，可存在于同一寡核苷酸中。一個或多個這些含寡核苷酸的免疫刺激序列的存在可激活各種免疫亞群，包括天然殺傷細胞(其產(chǎn)生干擾素Y并具有細胞溶解活性)和巨噬細胞(Wooldrige等人，Vol 89 (no. 8)，1977)。其它不含該共有序列、含未甲基化CpG的序列現(xiàn)也顯示出是免疫調(diào)節(jié)的。當配制成疫苗時，CpG通常以游離溶液連同游離抗原(W096/02555 ；McCluskieand Davis, supra)或與抗原共價綴合(W098/16247)或使用載體如氫氧化招配制的形式給藥((Hepatitis surface antigen)Davis 等人 supra ;Brazolot_Millan 等人，Proc. Natl.Acad. Sci.，USA,1998,95(26)，15553-8)?？蓪⑸鲜鲞@類免疫刺激劑連同載體一起配制，如脂質(zhì)體、水包油乳液，和/或金屬鹽，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可使用氫氧化鋁(EP O 689 454)或水包油乳液(W0 95/17210)配制；QS21可有利地使用含膽固醇的脂質(zhì)體(W0 96/33739)、水包油乳液(W) 95/17210)或明礬(W) 98/15287)配制；CpG可使用明礬(Davis等人，supra ；Brazolot-Millan supra)或其它陽離子載體配制。免疫刺激劑的組合也是優(yōu)選的，特別是單磷酰脂A和皂苷衍生物的組合(W094/00153 ；W0 95/17210 ；W0 96/33739 ；W0 98/56414 ；W0 99/12565 ；W0 99/11241)，更特別是TO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合?？蛇x擇性地，CpG加皂苷如QS21的組合也可形成用于本發(fā)明的有效佐劑。可選擇性地，可在脂質(zhì)體或Iscorn中配制皂苷并與免疫刺激性寡核苷酸組合。因此，適宜的佐劑系統(tǒng)包括，例如，單磷酰脂A，優(yōu)選3D-MPL，連同鋁鹽的組合。增強的系統(tǒng)包括單磷酰脂A和皂苷衍生物的組合，特別是WO 94/00153中公開的QS21和3D-MPL的組合，或W096/33739中公開的反應(yīng)原性較低的組合物，其中QS21在含膽固醇的脂質(zhì)體(DQ)中被猝滅。此外，該組合還含有免疫刺激性寡核苷酸。水包油乳液形式的、含QS21，3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑制劑在WO95/17210中描述，且是用于本發(fā)明的另ー優(yōu)選制劑。另ー優(yōu)選制劑包含単獨的CpG寡核苷酸或連同鋁鹽。 本發(fā)明又一方面提供一種制備此處所述疫苗制劑的方法，其中該方法包括將本發(fā)明的多肽與適宜佐劑混合。用于本發(fā)明制劑的特別優(yōu)選的佐劑組合如下i)3D_MPL+QS21，在脂質(zhì)體中ii)Alum+3D-MPLiii)Alum+QS21，在脂質(zhì)體中 +3D-MPLiV) Alum+CpGV)3D_MPL+QS21+水包油乳液Vi) CpG藥物組合物的給藥可采用ー個或超過ー個的単獨給藥形式，例如含有相同多肽組合物的重復(fù)給藥，或異質(zhì)性“激發(fā)-加強”接種方案。異質(zhì)性激發(fā)-加強方案在激發(fā)和加強時，使用不同形式疫苗的給藥，其各自本身可包括兩次或多次給藥。激發(fā)組合物和加強組合物將共有至少ー個抗原，雖然無需相同形式的抗原，它可以是不同形式的相同抗原。本發(fā)明的激發(fā)加強免疫可使用蛋白和基于DNA的制劑的組合進行。這種策略被認為可有效誘導(dǎo)廣泛的免疫反應(yīng)。含佐劑的蛋白疫苗主要包括抗體和T輔助細胞免疫反應(yīng)，而DNA作為質(zhì)粒或活載體的遞送可誘導(dǎo)較強的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)。因此，蛋白和DNA接種的組合可提供廣泛的免疫反應(yīng)。這在HIV背景下是特別合適的，因為同時中和抗體和CTL被認為對HIV的免疫防御很重要。根據(jù)本發(fā)明，接種方案可包括多肽抗原和編碼該多肽的DNA的順序(“激發(fā)_加強”)或同時給藥。該DNA可以裸DNA如質(zhì)粒DNA或重組活載體，如痘病毒載體、腺病毒載體、麻疹病毒載體或任何其它適宜活載體的形式遞送。蛋白抗原可注射一次或若干次，接著是一次或多次DNA給藥，或可首先一次或多次給予DNA，接著進行一次或多次蛋白免疫。本發(fā)明激發(fā)-加強免疫的具體例子包括使用重組活載體形式的DNA，如修飾的痘病毒載體，例如修飾的病毒Ankara(MVA)或甲病毒，例如委內(nèi)瑞拉馬腦亞病毒載體，或腺病毒載體或麻疹病毒載體激發(fā)，接著使用蛋白，優(yōu)選配有佐劑的蛋白加強。因此，本發(fā)明還提供一種藥物試劑盒，它包含a) 一種組合物，包括含Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物的多肽連同藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中當P17和p24Gag同時存在吋，它們之間有至少ー個HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和b) 一種組合物，包括多核苷酸連同藥學(xué)上可接受的賦形劑，該多核苷酸編碼Nef和Gag中的ー個或多個或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。優(yōu)選a)的多肽還含有RT或其免疫原性片段或衍生物如p51RT。在可選擇的實施方案中，該藥物試劑盒包含a) 一種組合物，它包括多核苷酸連同藥學(xué)上可接受的賦型劑，所述多核苷酸編碼 多肽，該多肽含有Nef或其免疫原性片段或衍生物和pl7和/或p24 Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當P17和p24 Gag同時存在吋，它們之間有至少ー個HIV抗原或免疫原性片段或衍生物；和b) 一種組合物，它包含多肽連同藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中該多肽含有Nef和Gag中的ー個或多個或含有存在于a)的多肽中的Nef或Gag表位的Nef或Gag的免疫原性片段或衍生物。優(yōu)選，a)的多核苷酸編碼多肽，其進ー步包含RT或其免疫原性片段或衍生物如P51RT。用于本發(fā)明激發(fā)/加強試劑盒中的優(yōu)選多肽和多核苷酸是此處所述的多肽和多核苷酸。因此，蛋白/DNA型激發(fā)加強方法的蛋白組分可以是此處所述任何優(yōu)選的融合蛋白。同樣，DNA組分可以是編碼任何優(yōu)選蛋白的多核苷酸。因此，例如，此處所述p24-RT-Nef_pl7，p24_RT *-Nef-p 17，p24-p51RT_Nef-pl7，p24-p51RT * -Nef-p 17, pl7_p51RT_Nef 或 pl7_p51RT * -Nef 融合體或任何 pl7_Nef 融合體可在激發(fā)加強試劑盒中提供，其中激發(fā)組合物包含融合蛋白而加強組合物包含編碼該融合蛋白的多核苷酸，或激發(fā)組合物包含多核苷酸而加強組合物包含融合蛋白。激發(fā)組合物和加強組合物均可以超過ー劑的形式遞送。此外，初始的激發(fā)和加強給藥之后，可進ー步給藥，其可交替得到，例如DNA質(zhì)粒激發(fā)/蛋白加強/進ー步DNA質(zhì)粒給藥/進ー步蛋白給藥。密碼子優(yōu)化是指多核苷酸序列被優(yōu)化從而類似所需表達系統(tǒng)，例如原核生物系統(tǒng)如大腸桿菌中基因的密碼子選擇。具體而言，序列中的密碼子選擇被優(yōu)化，從而類似高水平表達的大腸桿菌基因。為在本發(fā)明重組系統(tǒng)中表達而優(yōu)化密碼子的目的有兩重提高重組產(chǎn)物的表達水平并使表達產(chǎn)物更均勻(獲得更均勻的表達模式)。均勻性提高意味著無關(guān)的表達產(chǎn)物如截短物更少。適于大腸桿菌表達的密碼子選擇還可消除推斷的“移碼”序列以及過早終止和/或內(nèi)部起始位點。DNA代碼有4個字母(A，T，C和G)且使用這些拼成三個字母的“密碼子”，其代表生物基因中編碼的蛋白的氨基酸。沿著DNA分子的密碼子線性序列被翻譯成由那些基因編碼的蛋白中的氨基酸線性序列。代碼是高度簡并的，61個密碼子編碼20種天然氨基酸，3個密碼子代表“終止”信號。因此，絕大多數(shù)氨基酸由不止ー個密碼子編碼-事實上許多由4個或更多不同的密碼子編碼。當使用不止ー個密碼子編碼已知氨基酸時，觀察到生物的密碼子選擇模式是高度非隨機的。不同物種顯示它們密碼子選擇的不同偏好且，此外，密碼子的利用在單一物種的以高水平和低水平表達的基因之間顯著不同。這種偏好在病毒、植物、細菌和哺乳動物細胞中是不同的，且某些物種顯示出較之其它物種，遠離隨機密碼子選擇的更強偏好。例如，人和其它哺乳動物與某些細菌或病毒相比，偏好不太強。由于這些原因，源于在大腸桿菌中表達的哺乳動物病毒的病毒基因，或在哺乳動物細胞中表達的外源或重組基因?qū)τ谟行П磉_具有不適當?shù)拿艽a子分布存在顯著可能性。據(jù)信在密碼子簇異源DNA序列中的存在或密碼子的富足，很少在存在表達的宿主中觀察到，它是該宿主中較低異源表達水平的預(yù)兆。在本發(fā)明的多核苷酸中，密碼子選擇模式因此可根據(jù)典型的人免疫缺陷病毒而改變，從而更接近代表靶生物，例如大腸桿菌的密碼子偏好。用于密碼子優(yōu)化的可公開得到的程序有很多，例如，"CalcGene" (Hale andThompson, Protein Expression and Purification 12:185-189(1998)。


圖IA和IB是F4p24-RT_Nef-P17的考馬斯染色的凝膠(上圖)和蛋白質(zhì)印跡(下 圖)的圖像(其中使用還原的10% SDS-PAGE)。圖2是密碼子優(yōu)化的F4的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。I/未誘導(dǎo)2/B834 (DE3) /F4 (天然基因)3/BLR(DE3) /F4 (天然基因)4/BLR(DE3) /F4 (密碼子優(yōu)化的基因)圖3是FT蛋白的比對。 弓丨入點突變以除去酶活性粗體和下劃線不同于RT/HXB2的氨基酸強調(diào)區(qū)RNA酶H結(jié)構(gòu)域粗體整合酶的第一個氨基酸方括號p51的末端圖4是P51 RT(密碼子優(yōu)化的)的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。圖5是說明RT/P51和RT/p66的溶解度的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。圖6是顯示Nef_pl7和pl7_Nef融合體的表達的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。圖7是說明Nef-pl7、pl7-Nef和Nef蛋白的溶解度的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。圖8是顯示F4融合蛋白的表達的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。其中在22°C下誘導(dǎo)19小時。
1/F4
2/P4*3/F4 (Q瓊脂糖洗脫液樣品)2.5yg4/F4 (Q瓊脂糖洗脫液樣品)250ng
a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000α ρ24 :合并物 3 Mabs (JC 13. I, JC 16. I, IG 8. I. I) 1/5000α RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—:由甲硫氨酸內(nèi)部“起始”位點產(chǎn)生的帶圖9是顯示F3融合蛋白的表達的考馬斯染色的凝膠(上圖)和蛋白質(zhì)印跡(下圖)的圖像。圖10是顯示F3*融合蛋白的表達的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。I/陰性對照(B834(DE3>:|>ET29 >
2/F33/FS*a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000a RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—由甲硫氨酸內(nèi)部“起始”位點產(chǎn)生的帶圖11是顯示F4(p51)的表達的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。圖12是顯示F4(p51)和F4(p51)*融合蛋白的表達的考馬斯染色的凝膠(左圖)和蛋白質(zhì)印跡(右圖)的圖像。其中在22°C下誘導(dǎo)19小時。I/陰性對照(B834(DE3>:pET29 0
2/F4
3/F4*
4/F4(pS1)
5/F4(p51)*a NefTat :多克隆兔 388 LAS 97340 1/10000a RT :多克隆兔(P03L 16) 1/10000—由甲硫氨酸內(nèi)部“起始”位點產(chǎn)生的帶圖13A和13B是顯示F4融合蛋白的純化的考馬斯染色的凝膠(A)和蛋白質(zhì)印跡(B)圖像。A :考馬斯亮藍染色的4-20 % SDS-凝膠，5yg蛋白/道；B:抗-p24/抗Nef-Tat蛋白質(zhì)印跡，O. 5 μ g蛋白/道，第I道，MW標準品；第2道，勻漿；第3道，澄清的勻漿；第4道，重混懸的AS沉淀；第5道，S03洗脫液；第6道，辛基瓊脂糖洗脫液；第7道，Q瓊脂糖洗脫液 ’第8道，Superdex 200洗脫液。圖14A和14B是顯示F4(p51)*的純化的考馬斯染色的凝膠(A)和蛋白質(zhì)印跡(B)圖像。A :考馬斯亮藍染色的4-20 % SDS-凝膠，5 μ g蛋白/道；B :抗-p24/抗Nef-Tat蛋白質(zhì)印跡，OJyg蛋白/道，第I道，勻漿F4;第2道，勻漿F4(p51)* ;第3道，澄清的勻漿；第4道，勻漿沉淀；第5道，AS沉淀上清液；第6道，重混懸的AS沉淀；第7道，S03洗脫液；第8道，辛基瓊脂糖洗脫液；第9道，Q瓊脂糖選脫液；第10道Superdex 200洗脫液；第11道，Q洗脫液F4 ;第12道，Superdex 200洗脫液F4。圖15A和15B是顯示F4*融合蛋白的純化的考馬斯染色的凝膠(A)和蛋白質(zhì)印跡(B)圖像。A :考馬斯亮藍染色的4-20 % SDS-凝膠，5 μ g蛋白/道；B :抗-p24/抗Nef-Tat蛋白質(zhì)印跡，O. 5 μ g蛋白/道，第I道，勻漿；第2道，澄清的勻漿；第3道，重混懸的AS沉淀；第4道，S03洗脫液；第5道，辛基瓊脂糖洗脫液；第6道，Q洗脫液；第7道，濃縮/透析的Q瓊脂糖洗脫液；第8道,Superdex 200洗脫液;第9道，從Superdex 200洗脫液棄去的級分。圖16A和16B是顯示F4、F4*和F4(p51)*融合蛋白之間的純度比較的考馬斯染色的凝膠㈧和蛋白質(zhì)印跡⑶圖像。
A :Q洗脫液，B :S200洗脫液。將5μ g蛋白上樣到4_12% SDS-凝膠上進行考馬斯亮藍染色(左側(cè))并將O. 5 μ g上樣進行抗-p24/抗-Nef-Tat蛋白質(zhì)印跡(右側(cè))。圖17是在F4co純化和羧基酰胺化的F4co純化后的考馬斯染色的凝膠圖像。在4-12% SDS凝膠上分離在F4co或F4coca純化過程中收集的5 μ g各級分。將凝膠考馬斯亮藍染色1 :勻漿；2 CM hyperZ洗脫液；3 :Q瓊脂糖洗脫液；4 :純化級分。圖18是F4、F4co和F4coca純化后的考馬斯染色的凝膠圖像。在還原條件(左側(cè))或非還原條件(右側(cè))下，在4-12% SDS凝膠上分離5 μ g各蛋白。將凝膠考馬斯亮藍染色1 :方法II-F4co ；2 :方法II-F4coca ；3 :方法I-F4coca ；4 方法I-F4 ;5 :方法I-F4羧基酰胺化。圖19是ー系列柱狀圖，顯示小鼠中的免疫原性。圖20是兩個柱狀圖，顯示小鼠中的免疫原性。圖21是純化方法I的純化流程圖。 IPA-過程中的分析如果沒有特別說明，所有緩沖液均含有ImM DTT。圖22是純化方法11的純化流程圖。
具體實施例方式實施例實施例I :HIV-1 p24-RT-Nef-pl7融合體F4和密碼子優(yōu)化的(co)F4的構(gòu)建和表達I.未密碼子優(yōu)化的F4HIV-I gag p24(衣殼蛋白)和pl7(基質(zhì)蛋白)、逆轉(zhuǎn)錄酶和Nef蛋白在嗜菌體T7啟動子(PET表達系統(tǒng))的控制下，在大腸桿菌B834株(Β834ΦΕ3)是BL21(DE3)的甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型親代)中表達。它們表達為含有4種蛋白的完整序列的單ー融合蛋白。成熟的p24編碼序列來自HIV-I BHlO分子克隆，成熟的pl7序列和RT基因來自HXB2且Nef基因來自BRU分離物。誘導(dǎo)后，重組細胞表達占總蛋白10%的顯著水平的p24-RT-Nef_pl7融合體。
當細胞在22°C下生長并誘導(dǎo)時，p24-RT-Nef-pl7融合蛋白主要被限制到細菌裂
解產(chǎn)物的可溶性級分(甚至凍/融之后)。當在30°C下生長時，約30%的重組蛋白與不溶
性級分有夫。融合蛋白p24-RT-Nef-pl7由1136個氨基酸組成，分子量約為129kDa。全長蛋白
在SDS凝膠上遷移約130kDa。該蛋白基于其氨基酸序列具有7. 96的理論等電點(pi)，這
是通過2D-凝膠電泳加以證實的。重組質(zhì)粒的詳細描述名稱pRITl5436(或?qū)嶒炇颐Q pET28b/p24-RT_Nef-pl7)宿主載體pET28b復(fù)制子colEl選擇卡那霉素啟動子T7插入p24-RT-Nef-pl7融合基因重組蛋白的詳細描述p24-RT-Nef-pl7 融合蛋白1136 個氨基酸N-末端-p24 232a. a.-鉸鏈區(qū)2a. a. -RT :562a. a.-鉸鏈區(qū)2a. a. -Nef :206a.
a. —P17 132a. a. —C-末端核苷酸和氨基酸序列核苷酸序列
atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact
ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg
ttttcagcattatcagaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg
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gagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta ^ctatcJ RRtRRcaBRtRRtcaaaaaRtaRtRtRRttRRatRRcctactRtaaRRRaaaRaatRaRacRaRctRaRccaRcaRcaRatRRRRtRRRaRcaRcatctcRaRacctRRaaaaacatRRaRcaatcaCaaRtaRcaatacaRcaRctaccaatRctRcttRtRcctRRctaRaaRcacaaRaRRaRRaRRaRRtRRRttttccaRtcacacctcaRRtacctttaaRaccaatRacttacaaRRcaRctRtaRatcttaRccactttttaaaaRaaaaRRRRRRactRRaaRRRctaattcactcccaacRaaRacaaRatatccttRatctRtRRatctaccacacacaaRRctacttccctRattRRcaRaactacacaccaRRRCcaRRRRtcaRatatccactRacctttRRatRRtRctacaaRctaRtaccaRttRaRccaRataaRRtaRaaRaRRccaataaaRRaRaRaacaccaRcttRttacaccctRtRaRcctRcatRRaatRRatRaccctRaRaRaRaaRtR
ttagaRtRRaRRtttRacaRCCRCCtaRcatttcatcacRtRRCCCRaRaRCtRcatccRRaRtacttcaaRaactRc jaggcct) atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa [SEQ ID NO :1]p24序列以粗體表示Nef序列加了下劃線方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸
氨基酸序列
MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPEVIPMPSALSEGATP5 O
QDLNmLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAOPIAPeQMREP100
ROSDIAGTTSTLOEgiGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMySPTS150
ILDIRCGPKEPPRDYVDRPYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK200TILKALGPAATLEEMMTACQQVGGPGHKARVI GPISPIETVSVKLKPG 2S0MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK 300KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY 350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT 400KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT 450TPDKKHQKEPPFL § MGYELHPDKffTVQPIVLEKDSffTVDIQKLVGKLN 500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH 550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV 600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE 650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK 700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES 750ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV 畫MGGK 800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA 850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ 900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE 950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000NC ■ MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100TKEALDKI EEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO :2]P24序列氨基酸1-232 (粗體)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸K(賴氨酸)代替色氨酸(W).引入突變除去酶活性重組蛋白的表達在pET質(zhì)粒中，靶基因(p24-RT-Nef-pl7)受到強嗜菌體T7啟動子的控制。該啟動子不能由大腸桿菌RNA聚合酶識別且依賴于宿主細胞中T7 RNA聚合酶的來源。B834(DE3)宿主細胞含有在lacUV5控制之下的T7 RNA聚合酶的染色體拷貝且表達通過向細菌培養(yǎng)物中加入IPTG而誘導(dǎo)使預(yù)培養(yǎng)物在37 °C下，在搖瓶中生長至中-対數(shù)期(A620 :0. 6)然后在4 °C下過夜(以避免靜止期培養(yǎng)物)貯存。使培養(yǎng)物在補充了 1%葡萄糖和50 μ g/ml卡那霉素的LBT培養(yǎng)基中生長。將葡萄糖加入到生長培養(yǎng)基中具有減少基礎(chǔ)重組蛋白表達(避免cAMP介導(dǎo)的lacUV5啟動子的脫抑制)的優(yōu)點。4°C過夜貯存的IOml培養(yǎng)物用于接種200ml含卡那霉素的LBT培養(yǎng)基(不含葡萄糖)。培養(yǎng)物在30°C和22°C下生長且當0.0.62。達到O. 6時，加入IPTG(lmM終濃度)。使培養(yǎng)物再培養(yǎng)3、5和18小時(過夜)。在3、5和18小時誘導(dǎo)之前和之后采集樣品。提取物制備如下將細胞沉淀混懸于斷裂緩沖液* (理論O. D.為10)中并通過在弗氏壓碎器(20. OOOpsi或1250巴)中傳代4次而破裂。20. OOOg離心粗提物(T) 30分鐘，分離可溶性
(S)和不溶性⑵級分。*斷裂緩沖液50mM Tris-HCL pH 8. O, ImM EDTA, ImM DTT+蛋白酶抑制劑雞尾酒(しomplete/Boerhinger)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析與不溶性沉淀⑵、上清液⑶和粗提物⑴相應(yīng)的級分在10%還原SDS-PAGE上電泳。p24-RT-Nef-pl7重組體是通過考馬斯亮藍染色和蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測的?？捡R斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白顯現(xiàn)為其中一個帶在±130kDa(使用計算的麗擬合)MW理論值128. 970道爾頓MW 近似值130kDa蛋白質(zhì)印跡分析試劑=RT的單克隆抗體(p66/p51)購自ABI (Advanced Biotechnologies)稀釋1/5000-堿性磷酸酶綴合的抗-小鼠抗體稀釋1/7500表達水平22°C下誘導(dǎo)20小時后，非常強的p24-RT-Nef_pl7特異性帶，占總蛋白的最多10% (見圖1A)重組蛋白“溶解度”“新鮮的”細胞提取物(T，S，P級分)22°C /20h生長/誘導(dǎo)，在細胞提取物的可溶性級分中回收到幾乎所有的p24-RT-Nef-pl7融合蛋白(圖1A)。30°C /20h生長/誘導(dǎo)，約30%的p24-RT-Nef-pl7蛋白與不溶性級分有關(guān)(圖1A)“凍 / 融”(S2，P2 級分) -20°C保存可溶性(SI)級分(22°C誘導(dǎo)20h)。融化并20. 000g/30分鐘離心S2和P2(重混懸于l/10vol中)含DTT的斷裂緩沖液幾乎所有p24-RT-Nef-pl7融合蛋白仍然可溶(僅1_5%沉淀)(見圖1B)不含DTT的斷裂緩沖液85-90%的p24-RT_Nef-pl7仍然可溶(圖1B)圖圖IA-考馬斯染色和蛋白質(zhì)印跡圖lB-p24-RT-Nef_pl7 溶解度測定法
F4蛋白使用實施例7中的方法I純化。除非指定了其它條件(例如，溫度、斷裂緩沖液組成)，下面實施例的細胞生長和
誘導(dǎo)條件及細胞提取物的制備如實施例I中所述。2.密碼子-優(yōu)化的F4下列多核苷酸序列被密碼子優(yōu)化，這樣密碼子選擇類似在大腸桿菌中高水平表達
的基因的密碼子選擇。氨基酸序列與上面未密碼子優(yōu)化的F4所給出的相同。F4co的核苷酸序列
atggtcattgttcagaacatacagggccaaatggtccaccaggcaattagtccgcgaact cttaatgcatgggtgaaggtcgtggaggaaaaggcattctccccggaggtcattccaatg ttttctgcgctatctgagggcgcaacgccgcaagaccttaataccatgcttaacacggta ggcaggcaccaagccgctatgcaaatgctaaaagagactataaacgaagaggccgccgaa tgggatcgagtgcacccggtgcacgccggcccaattgcaccaggccagatgcgcgagccg cgcgggtcfcgatattgcaggaactacgtctacccttcaggagcagattgggtggatgact aacaatocaccaatcccggtcggagagatctataagaggtggatcatactgggactaaac aagatagtccgcatgtattctccgacttctatactggatatacgccaaggcccaaaggag ccgttcagggactatgtcgaccg^ttctataagacccttcgcgcagagcaggcatcccag gaggtcaaaaattggatgacagaaactcttttggtgcagaatgcgaatccggattgtaaa acaattttaaaggctctaggaccggccgcaacgctagaagagatgatgacggcttgtcagggagtcggtggaccggggcataaagcocgcgfcctta|cacatcj{ ggcccgatatctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatggatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagagatttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtacaatacaccggtatttgcaataaagaaaaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagattttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactagggatcccacatccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatattttagtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaacaatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtctccggcgatatttcagagctgtatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccggatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattgggcagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactactcccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccggacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgatattcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtccgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacggaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggggtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaatggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgcatgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattactactgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaaacatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaatttgtcaacacgccgccacttgttaagct
ttggtaccagcttgaaaaggagccgatagtaggggcagagaccttctatgtcgatggcgccgcgaatcgcgaaacgaagctaggcaaggcgggatacgtgactaataggggccgccaaaaggtcgtaacccttacggataccaccaatcagaagactgaactacaagcgatttaccttgcacttcaggatagtggcctagaggtcaacatagtcacggactctcaatatgcgcttggcattattcaagcgcagccagatcaaagcgaaagcgagcttgtaaaccaaataatagaacagcttataaagaaagagaaggtatatctggcctgggtccccgctcacaagggaattggcggcaatgagcaagtggacaagctagtcagcgctgggattcgcaaggttctt Igcqatgl gggggta
agtggtctaagtctagcgtagtcggctggccgacagtccgcgagcgcatgcgacgcgccgaaccagccgcagatggcgtgggggcagcgtctagggatctggagaagcacggggctataacttccagtaacacggcggcgacgaacgccgcatgcgcatggttagaagcccaagaagaggaagaagtagggtttccggtaactccccaggtgccgttaaggccgatgacctataaggcagcggtggatctttctcacttccttaaggagaaaggggggctggagggcttaattcacagccagaggcgacaggatattcttgatctgtggatttaccatacccaggggtactttccggactggcagaattacaccccggggccaggcgtgcgctatcccctgactttcgggtggtgctacaaactagtcccagtggaacccgacaaggtcgaagaggctaataagggcgagaacacttctcttcttcacccggtaagcctgcacgggatggatgacccagaacgagaggttctagaatggaggttcgactctcgacttgcgttccatcacgtagcacgcgagctgcatccaRaatatttcaagaactgc [cgccca| atgggcgccagggccagtgtacttagtggcggagaactagatcgatgggaaaagatacgcctacgcccggggggcaagaagaagtacaagcttaagcacattgtgtgggcctctcgcgaacttgagcgattcgcagtgaatccaggcctgcttgagacgagtgaaggctgtaggcaaattctggggcagctacagccgagcctacagactggcagcgaggagcttcgtagtctttataataccgtcgcgactctctactgcgttcatcaacgaattgaaataaaggatactaaagaggcccttgataaaattgaggaggaacagaataagtcgaaaaagaaggcccagcaggccgccgccgacaccgggcacagcaaccaggtgtcccaaaactactaa[SEQ ID NO :3]p24序列以粗體表示Nef序列加了下劃線方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸將未密碼子優(yōu)化的F4所用的過程用于密碼子優(yōu)化的序列。重組質(zhì)粒的詳細描述名稱pRITl55l3(實驗室名稱pET28b/p24-RT-Nef_pl7)宿主載體pET28b復(fù)制子colEl選擇卡那霉素啟動子T7插入片段p24-RT-Nef-pl7融合基因，密碼子-優(yōu)化的F4密碼子-優(yōu)化的基因在大腸桿菌BLR (DE3)細胞，即B834 (DE3)株的recA—衍生物中表達。RecA突變防止λ嗜菌體的推斷產(chǎn)生。
預(yù)培養(yǎng)物在37°C搖瓶中生長至中-対數(shù)期(A62tl :0. 6)，然后4°C (以避免靜止期培養(yǎng)物)過夜貯存。培養(yǎng)物在補充了 I % 葡萄糖和50 μ g/ml卡那霉素的LBT培養(yǎng)基中生長。將葡萄糖加入到生長培養(yǎng)基中具有減少基礎(chǔ)重組蛋白表達(避免cAMP介導(dǎo)的lacUV5啟動子的脫抑制)的優(yōu)點。4°C過夜貯存的IOml培養(yǎng)物用于接種200ml含卡那霉素的LBT培養(yǎng)基(不含葡萄糖)。培養(yǎng)物在37 °C下生長且當O. 0.62(|達到O. 6時，加入IPTG(lmM終濃度)。使培養(yǎng)物22°C再培養(yǎng)19小時(過夜)。在19小時誘導(dǎo)之前和之后采集樣品。提取物制備如下:將細胞沉淀重混懸于樣品緩沖液(理論O. D.為10)中，煮沸并直接在SDS-PAGE上樣。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析使粗提物在10%還原SDS-PAGE上電泳。p24-RT-Nef-pl7重組蛋白是通過考馬斯亮藍染色(圖2)和蛋白質(zhì)印跡檢測的?？捡R斯染色p24-RT-Nef-pl7蛋白顯現(xiàn)為其中一個帶在± 130kDa(使用計算的麗擬合)MW理論值128. 967道爾頓MW 近似值130kDa蛋白質(zhì)印跡分析試劑=-兔多克隆抗RT (兔P03L16)稀釋1/10.000-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)稀釋1/10. 000-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體·稀釋1/750022°C誘導(dǎo)19小時后，重組BLR(DE3)細胞以占總蛋白10_15%的非常高的水平表達
F4融合體。與源于天然基因的F4相比，源于密碼子-優(yōu)化基因的F4重組產(chǎn)物分布稍稍簡化。60kDa處的主要F4-相關(guān)帶，以及下面的次要帶沒有顯現(xiàn)(見圖2)。與表達F4的B834(DE3)重組株相比，產(chǎn)生F4co的BLR(DE3)株具有下列優(yōu)點產(chǎn)生較高水平的F4全長蛋白，重組產(chǎn)物的復(fù)合帶模式較少。實施例2 P51 RT (截短的、密碼子-優(yōu)化的RT)的構(gòu)建和表達氨基酸428-448之間的RT/p66區(qū)對大腸桿菌蛋白酶敏感。P51構(gòu)建體終止于Leu427，導(dǎo)致RNA酶H結(jié)構(gòu)域除去(見圖3中的RT序列比對)。還除去了 RT天然基因序列中鑒定的推斷大腸桿菌“移碼”序列(通過p51基因的密碼子優(yōu)化)。p51合成基因的設(shè)計/構(gòu)建體根據(jù)大腸桿菌密碼子選擇設(shè)計合成p51基因的序列。因此，它被密碼子優(yōu)化，這樣一來密碼子選擇類似大腸桿菌中高水平表達基因的密碼子選擇。合成基因如下構(gòu)建以ー步PCR組裝32個寡核苷酸。在第二步PCR中，使用末端引物擴增全長組裝體，且所得PCR產(chǎn)物克隆到PGEM-T中間質(zhì)粒中。校正在基因合成過程中引入的點誤差后，p51合成基因克隆到pET29a表達質(zhì)粒中。該重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化Β834ΦΕ3)細胞。重組蛋白特征P51 RT核甘酸序列atg agtact ggtccgatctctccgatagaaacagtttcggtcaagcttaaaccagggatg 60gatggtccaaaggtcaagcagtggccgctaacggaagagaagattaaggcgctcgtagag120atttgtactgaaatggagaaggaaggcaagataagcaagatcgggccagagaacccgtac180aatacaccggtatttgcaataaagaagaaggattcaacaaaatggcgaaagcttgtagat240tttagggaactaaacaagcgaacccaagacttttgggaagtccaactaggtatcccacat300ccagccggtctaaagaagaagaaatcggtcacagtcctggatgtaggagacgcatatttt360agtgtaccgcttgatgaggacttccgaaagtatactgcgtttactataccgagcataaac420aatgaaacgccaggcattcgctatcagtacaacgtgctcccgcagggctggaaggggtct480ccggcgatatttcagagctctatgacaaaaatacttgaaccattccgaaagcagaatccg540gatattgtaatttaccaatacatggacgatctctatgtgggctcggatctagaaattggg600cagcatcgcactaagattgaggaactgaggcaacatctgcttcgatggggcctcactact660cccgacaagaagcaccagaaggagccgccgttcctaaagatgggctacgagcttcatccg720gacaagtggacagtacagccgatagtgctgcccgaaaaggattcttggaccgtaaatgat780attcagaaactagtcggcaagcttaactgggcctctcagatttacccaggcattaaggtc840cgacagctttgcaagctactgaggggaactaaggctctaacagaggtcatcccattaacg900gaggaagcagagcttgagctggcagagaatcgcgaaattcttaaggagccggtgcacggg960gtatactacgacccctccaaggaccttatagccgagatccagaagcaggggcagggccaa1020tggacgtaccagatatatcaagaaccgtttaagaatctgaagactgggaagtacgcgcgc1080atgcgaggggctcatactaatgatgtaaagcaacttacggaagcagtacaaaagattact1140actgagtctattgtgatatggggcaagaccccaaagttcaagctgcccatacagaaggaa1200acatgggaaacatggtggactgaatattggcaagctacctggattccagaatgggaattt1260gtcaacacgccgccgctggtaaaactg [aqcfcctqctaqc| taa 1302[SEQ ID NO :4]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸氨基酸序列M st GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPY 60NTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYF120SVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSgMTKILEPFRKQNP180DIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFL k MGYELHP 240DKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLT300EEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR 360MRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWEF420VNTPPLVKL RPAS433
[SEQ ID NO :5]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸K(賴氨酸)代替色氨酸(W).引入突變以除去酶活性長度、分子量、等電點(IP)433AA, MW 50. 3kDa,，IP :9. 08p51 在 B834(DE3)細胞中的表達與RT/p66生產(chǎn)株平行評價P51表達水平和重組蛋白溶解度。p51表達水平
誘導(dǎo)條件5小時內(nèi)，37°C下細朐牛長/誘導(dǎo)(+ImM IPTG)斷裂緩沖液50mMTris/HCl, DH :7. 5，ImM EDTA, +/-ImM DTT.蛋白質(zhì)印跡分析試劑兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋=1/10,000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋1/7500)使與粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相應(yīng)的細胞級分在10%還原SDS-PAGE上電泳。正如在考馬斯染色的凝膠和蛋白質(zhì)印跡(圖4)說明的，觀察到非常高表達水平的P51(占總蛋白的15-20% )，高于對P66所觀察到的。p51和p66蛋白(37°C誘導(dǎo)5小時后)，在細胞提取物的可溶級分(SI)中回收到80%重組產(chǎn)物(見圖4)。當在30°C下表達時，99%重組蛋白與可溶級分有關(guān)(沒有給出數(shù)據(jù))。p51蛋白質(zhì)印跡模式為多帶，但較之相對P66觀察到的，復(fù)雜程度較低。溶解度測定法溶解度測定法在還原(含DTT的斷裂緩沖液)和非-還原條件下制備的可溶
(SI)級分的凍/融(5h誘導(dǎo)，37°C)。融化后，20. 000g/30分鐘離心SI樣品，產(chǎn)生S2和P2 (p2再次混懸于1/10νο1·)。在還原以及非-還原條件下制備的可溶級分(SI)凍/融后，在可溶(S2)部分中仍然回收到99%的p51和ρ66。在沉淀(Ρ2)中僅發(fā)現(xiàn)1%。這在圖5中示出。實施例3 :有或沒有接頭的pl7_Nef和Nef_pl7的構(gòu)建和表達使用或不使用接頭構(gòu)建雙融合蛋白。接頭目的在于降低兩個融合配偶體之間潛在的相互作用且如下所示Nef- ^SGGGP] ~P17 和 pl7_ IGSGGGP| -Nef重組質(zhì)粒的構(gòu)建· pET29a/Nef-pl7 表達載體通過PCR從F4重組質(zhì)粒擴增Nef-pl7融合基因。將PCR產(chǎn)物克隆到中間pGEM_T克隆載體中，并隨后克隆到pET29a表達載體中?！?pET28b/pl7-Nef 表達載體通過PCR從F4重組質(zhì)粒擴增Nef基因。將PCR產(chǎn)物克隆到中間pGEM_T克隆載體中，隨后克隆到pET28b/pl7表達載體中，作為與P17基因框內(nèi)融合的C-末端?！?pET29a/Nef-接頭-pl7 和 pET28b/pl7_ 接頭-Nef 表達載體通過定點誘變(使用"GeneTailorSite-Directed Mutagenesis System",Invitrogen)將編碼六肽接頭(GSGGGP)的18bp DNA片段插入到Nef和pl7融合配偶體之間。
重組蛋白特征 長度、分子量、等電點(IP)Nef-p 17 (稱作 NP) 340AA, MW :38. 5kDa, IP :7. 48Nef- IGSGGGP] -P17 (稱作 NLP) 346AA, MW :38. 9kDa, IP :7. 48pl7-Nef (稱作 PN) 342AA, MW :38. 7kDa, IP :7. 19pl7- ^SGGGP] -Nef (稱作 PLN) 348AA, MW :39. IkDa, IP :7. 19 氨基酸序列和多核苷酸序列Nef-p 17核苷酸序列 Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg 60Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat 120Ijgagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca 180しaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact 240i'acaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta 300Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac 360rtccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga 420Iggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag 480Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg 540rtagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg 600bagtacttcaagaactgcaggcctatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaa 660i'tagat cgatgggaaaaaatt cggt taaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaa 720しatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaa 780Acatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatca 840baagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggata 900bagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaag 960Aaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattac 1020Taa1023[SEQ ID NO :6]Nef-pl7(NP)
MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDliEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA 60QBEEEVGPPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHPIiKEKGGLEGLIHSQRRQDIIiDLWiyHTQGY 120FPDWQNYTPGPGVRYPliTFGWCYKLVPVBPOKVBEANKGENTSI.LHPVSLHQMDDPEREV 180LEWRPDSRLAFHHVARELHPEYPKNCgl MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKKKYKLK 240HIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRI 300EIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY340[SEQ ID NO :7]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸Nef序列以粗體表示P17_Nef核苷酸序列
Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60Ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120Ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180Ctgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct300Ttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct360Gacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctatgggtggcaag420Tggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgag480Ccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcaca540Agtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag600Gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagct660Gtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaa720Cgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattgg780Cagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaag840Ctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttg900Ttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtgttagagtggagg960Tttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaag1020Aactgctaa 1029[SEQ ID NO :8]P17-Nef (PN)
MOARASVLSGeELDRWBKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAWPOLLBTSEGCROI60
LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVKQRIEIKDTK￡^LDKIEEEQNKSKKKAQQAAA120DTOHSNQVSQlTXppMGGKffSKSSffGffPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAIT 180SSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ240RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSL300LHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC342[SEQ ID NO :9]方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸pl7序列以粗體表示Nef-接頭-P 17核苷酸序列Atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatg60Agacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaaaaacat120Ijgagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagca180しaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact240i'acaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggcta300Attcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctac360rtccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttgga420 Iggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagag480
Aacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagagagaagtg540Ttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccg600Gagtacttcaagaactgcaggcctggatccggtggcggccctatgggtgcgagagcgtca660
Gtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaag720Aaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagtt780Aatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaacca840Tcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctat900Tgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaa960 Gagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaat1020Caggtcagccaaaattactaa1041[SEQ ID NO :10]Nef-接頭-pl7 (NLP)MGGKWSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAACAWLEA60QEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY120FPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREV180LEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC GSGGGPMGARASVLSGGELDRWEKIKLRPGGK 240KKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLY300CVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY346[SEQ ID NO :11]六肽接頭方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸P17-接頭-Nef核苷酸序列Atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60i'taaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120ctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180しtgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240Acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagct300i'tagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagct360bacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattacctcgacaggcctggatccggtggc420bgtcctatgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaa480Agaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagacctggaa540Aaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcctggcta600baagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagacca660Atgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaa720bggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaa780ijgctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacc840i'ttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaa900bgagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgagaga960baagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctg1020
Catccggagtacttcaagaactgctaa1047[SEQ ID NO :12]P17-接頭-Nef (PLN)MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQI 60
LGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAA 120DTGHSNQVSQNY EdrpI GSGGGPMGGKffSKSgVYGffPTVRERMRRAEPAADGYGAASRDLE 180KHGAITSSNTAATNAAcAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLE 240GLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANK 300GENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC348[SEQ ID NO :13]六肽接頭方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸 有或沒有接頭的Nef-p 17，pl7_Nef融合體的比較表達與F4和Nef產(chǎn)生株平行，30°C誘導(dǎo)4種重組株3小吋。制備粗提物并通過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡分析試劑兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋=1/10,000)-堿性磷酸酶綴合的-抗-兔抗體(稀釋1/7500)如圖6中舉例說明的，有或沒有接頭的Nef_pl7和pl7_Nef融合體以高水平(占總蛋白10% )表達。在蛋白質(zhì)印跡中四個雙融合構(gòu)建體呈現(xiàn)多帶模式，但較之相對F4觀察到的，復(fù)雜性較低。當單獨表達時，Nef和pl7蛋白呈現(xiàn)單帶模式。進ー步分析(溶解度測定法，見下文)表達Nef-p 17 (NP)和pl7_Nef(PN)融合體、沒有接頭肽的株。Nef-p 17和pl7_Nef溶解度測定法與F4和Nef產(chǎn)生株平行，誘導(dǎo)Nef-pl7和pl7_Nef蛋白。誘導(dǎo)條件3小時內(nèi)，30°C下細胞牛長/誘導(dǎo)(+ImM IPTG)斷裂緩沖液50mMTris/HCl pH 8,50mM NaCl, ImM EDTA新鮮的細胞提取物制備細胞提取物(在非還原條件下)并按照考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析與粗提物(T)、不溶沉淀(P)、和上清液(SI)相對應(yīng)的部分。如圖7中考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡舉例說明的，在細胞提取物的可溶級分
(S)中回收到幾乎所有Nef-pl7、pl7-Nef以及Nef蛋白。對于F4構(gòu)建體在沉淀級分中已經(jīng)回收了 5-10%的重組蛋白。結(jié)論所試驗的所有雙融合構(gòu)建體均高水平表達(> 10%總蛋白)。P17_Nef和Nef_pl7融合蛋白較之F4更易溶解。兩者均呈現(xiàn)復(fù)雜性較低的WB模式。實施例4 p24-RT * -Nef-p17 (F4 * )的構(gòu)建和表達F4 *是F4(p24-RT/p66-Nef-pl7)融合體的突變形式，其中592位的甲硫氨酸被賴氨酸取代。該甲硫氨酸是推斷的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄“起始”位點，如在F4純化實驗的Q瓊脂糖洗脫物樣品上進行的N-末端測序所支持的。實際上，Q洗脫物樣品中存在的62kDa的主要F4-相關(guān)小帶在592位的甲硫氨酸處開始。甲硫氨酸被賴氨酸取代RMR — RSR。RSR基序天然存在于分化枝A RT序列中。評價該突變對⑶4-⑶8表位的影響-其中ー個HLA-A3CTL表位(A* 3002)丟失，但另外9個HLA-A3表位存在于RT序列中。-在該區(qū)中沒有鑒定到輔助表位。重組蛋白特性
N-末端-|p24: 232a.a.l -/ 較鏈區(qū):2a.a] - jRT: 562a.J 鏈區(qū):2a.a.j -Nef:206a.a.l- ^17:132a.a.l - C-末端 長度、分子量、等電點(IP):1136AA, 129kDa, IP :8. 07 核苷酸序列
atggttateotacagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact
ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg
ttttcagcattatcaoaaggagccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg
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aSTdggaAgtgacatagCieggftdC t&ct&gtsicccttc&gg 在攻在 ca
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aaaatagtaagaatgtatagccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaa
ccttttagagactafcgtagaceggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag
gaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag
actattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcafcgtcagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttgicatatj ggccccattagccctattgagactgtgtcagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaatactccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaataagagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagtaacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcatttaccatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaaggatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagttatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagaggagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacc
tccattccttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctggactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagtaaggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagctagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagacttaatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctgaaaacaggaaaatatgcacgtaaacgcggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaaaaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatgggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctcctttagtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagctaacagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactgacacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacatagtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatcaaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggaggaaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta pctatcjj; RgtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgaRccaRcaRcaRatRRRRtRRRaRcaRcatctcRaRacctRRaaaaacatRRaRcaatcaCaaRtaRcaatacaRcaRctaccaatRctRcttRtRcctRRctaRaaRcacaaRaRRaRRaRRaRRtRRRttttccaRtcacacctcaRRtacctttaaRacccaatRacttacaaRRcaRctRtaRatcttaRccactttttaaaaRaaaaRRRRRRactRRaaRRRctaattcactcccaacRaaRacaaRatatccttRatctRtRRatctaccacacacaaRRctacttccctRattaRcaRaactacacaccaRRRccaRRRRtcaRatatccactRacctttaRatRRtRctacaaRctaRtaccaRttRaRccaRataaRRtaRaaRaRRccaataaaRRaRaRaacaccaRcttRttacaccctRtRaRcctRcatRRaatRRatRaccctRaRaRaRaaRtRttagaRtRRaRRtttRacaRCCRCCtaRcatttcatcacRtRRCCCRaRaRCtRcatccRRaRtacttcaaRaactRc laggcctj atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcacagcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa[SEQ ID NO :14] p24序列以粗體表示Nef序列加了下劃線方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸
氨基酸序列
MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKWEEKAFSPBVIPMPSALSEGATP5 O
QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETエNEEAAEWDRVHPVKAGPIAPGQMREP100
RGSDIAGTTSTLOEOIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS150
ILDIROGPKEPFRDYVDRPyKTLRABCASOBVKimMrrBTLIiVCNAWPDCK200TILKALGPAATLEEMMTACQGVGOPGHKARVI^i GPISPIETVSVKLKPG250MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK300 KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY350FSVPLDEDFRKYTAFTIPSIMNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT400KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT450TPDKKHQKEPPFL | MGYELHPDKffTVQPIVLPEKDSffTVNDIQKLVGKLN500WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH550GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR | RGAHTNDV600KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffE650FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK700VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES750ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV @MGGK800WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA850CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ900RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE950EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK1000NC ^(MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKKKYKLKHIVffASRELERFAV1050NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1136[SEQ ID NO :15]P24序列氨基酸1-232 (粗體)RT 序列氨基酸 235-795Nef 序列氨基酸 798-1002P17 序列氨基酸 1005-1136方框通過基因構(gòu)建體引入的氨基酸K(賴氨酸代替甲硫氨酸(內(nèi)部“起始”密碼子)K(賴氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突變以除去酶活性F4*在B834(DE3)細胞中的表達與F4未突變構(gòu)建體平行，18小時內(nèi)22°C誘導(dǎo)F4 *重組株。制備粗提物并通過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。如圖8所示，F(xiàn)4*高水平表達(10%總蛋白)，稍高于F4且小62kDa帶消失。蛋白質(zhì)印跡分析:試劑_合并 3 種 Mabs 抗 p24(JC13. 1，JC16. 1，IG8. I. I)(稀釋 1/5000)-兔多克隆抗 RT (兔 P03L16)(稀釋1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀釋 1/10000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋1/7500)-堿性磷酸酶綴合的抗-小鼠抗體(稀釋1/7500)
實施例5 F3和F3 * (突變F3)的構(gòu)建和表達F3(pl7-p51_Nef)和F3 * (pl7_p51 *-Nef)，其中推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位點被賴氨酸取代。F3和F3 I蟲合體可與p24組合使用。重組質(zhì)粒的構(gòu)建F3 -J人pET29a/p51表達質(zhì)粒切下編碼p51的序列(Seal和StuI DNA片段)并在StuI位點處(位于pl7和Nef基因之間)連接到pET28b/pl7_Nef質(zhì)粒中，作為與pl7和Nef序列的框內(nèi)融合體。所得融合構(gòu)建體pl7-p51-Nef被稱作F3。F3 * :使用“Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis system，，(Invitrogen)獲得推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位點的突變，產(chǎn)生F3 *構(gòu)建體。F3和F3 *質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化B834(DE3)細胞。重組蛋白特性
N-末端 p!7: 134a.a.-鉸鏈區(qū):2a.a. - |ρ51/ρ51*: 426a.a.j -鉸鏈區(qū)2a.a.|-Nef: 206a.a] C-末端 長度、分子量、等電點(IP)770AA, 88. 5kDa, IP 8. 58 核苷酸序列(F3*)
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcgg60
ttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggag120
cfcagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaata180
ctgggacagctacaaccatcocttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataat240
acagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaagaaagct300
tcagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaa^gcacaaaaagcaacacict3$0gacacaggaGaoageaateaggtcagccaaaattacctcgaclaggactli GGTCCGATCTCT 420CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG480TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG540GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA600AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA660ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG720AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC780TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC840TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT900
ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 960ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1020GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1080GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG I140ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAALCTAGTCGGCAAG 1200CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1260AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCT TGAGCTG 1320GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1380GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA 1440GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1500GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1560
GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1620GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1680AAACTG IEi cctt ATgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctactgta 1740agggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcgagac 1800ctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgcc 1860tggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtaccttta 1920agaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga 1980ctggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccac 2040acacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatatcca 2100ctgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggcc 2160aataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccct 2220gagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccga 2280gagctgcatccggagtacttcaagaactgctaa2213[SEQ ID NO :16]P17 以粗體表示的序列P51 :以大與字母表不的序列
Nef 以小寫字母表示的序列方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸 氨基酸序列(F3)
UGAIlASVLSGOELDRWEKIRliRPOGKKKYKLKHIVWASRELERFAVNPOIiLETSKOCRQI 60LOQliQP SItOXGSEELRSLYNTVATLYCVKgRIBIKDTKEMiDKIEEEgKKSKKKAOOAAA 120DTGHSNQVSQN^I^ GPISPIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEK 180EGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKK 240KSVTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSS 300MTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQK 360EPPFL | MGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLL 420RGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQ 480
EPFKNLKTGKYAR gRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIffGKTPKFKLPIQKETffETffffT 540EYffQATffI PEffEFVNTPPLVKL MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRD 600LEKHGAITSSNTAATNAACAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGG 660LEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEA 720NKGENTSLLHPVSDHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC770[SEQ ID NO :17]P17序列氨基酸1-134 (粗體)P51 序列氨基酸 137-562Nef 序列氨基酸 565-770方框通過基因構(gòu)建引入的氨基酸F3 *構(gòu)建體中494位的甲硫氨酸被賴氨酸取代K(賴氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突變以除去酶活性F3在B834 (DE3)細胞中的表達與F4(p24-p66-Nef_pl7)和pl7_Nef(F2)生產(chǎn)株平行，評價F3表達水平和重組蛋白溶解度。誘導(dǎo)條件3小時內(nèi)，細朐37°C下牛長/30°C下誘導(dǎo)(+ImM IPTG)斷裂緩沖液—F450mMTris/HCl pH :8. O. 50mM NaCl，ImM EDTA, +/-ImM DTTF2 50mMTris/HCl pH 8. 0,50mM NaCl, ImM EDTA，不含 DTTF3 50mMTris/HCl pH :7.5,50mM NaCl，ImM EDTA, +/-ImM DTT蛋白質(zhì)印跡分析:試劑-兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀釋 1/10000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋1/7500)“新鮮的”細胞提取物在10%還原SDS-PAGE上分析與粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相對應(yīng)的細胞級分。如圖9所示，F(xiàn)3融合蛋白以高水平表達(10%總蛋白)。在細胞提取物的可溶級分(S)回收到幾乎全部F3，雖然5-10%的F4產(chǎn)物已經(jīng)與沉淀級分有夫。與F4相比，WB模式被簡化。F3*在Β834ΦΕ3)細胞中的表達37°C誘導(dǎo)F3 *重組株3小吋，與F3未突變構(gòu)建體平行。制備粗細胞提取物并通過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。如圖10所示，F(xiàn)3*融合蛋白以高水平(10-20%總蛋白)表達。與F3相比，WB模式簡化；+/_32kDa(僅在WB上檢測到)處非常弱的帶消失。實施例6 F4 (p51)和F4(p51) *的構(gòu)建和表達RT/p51用于F4融合構(gòu)建體(代替RT/p66)中。F4(p51) = p24-p51_Nef-pl7F4(p51) * = p24_p51 *-Nef-pl7_突變的F4 (p51):推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位點(存在于RT部分中)被賴氨酸取代，從而進一步簡化了抗原模式。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建F4(p51):通過PCR從pET29a/p51表達質(zhì)粒擴增編碼p51的序列。將限制位點摻入到PCR引物中(NdeI和StuI位于編碼序列的5'末端，AvrII位于編碼序列的3'末端)。將PCR產(chǎn)物克隆到pGem-T中間質(zhì)粒中并測序。pGem_T/p51中間質(zhì)粒被NdeI和AvrII限制且P51片段連接到由NdeI和NheI限制的pET28b/p24-RT/p66-Nef-pl7表達質(zhì)粒中(導(dǎo)致RT/p66序列的切除)。連接是在有T4DNA連接酶存在的條件下，通過適宜濃度下的組合消化反應(yīng)進行的。連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌細胞。p51向正確翻譯讀框中的插入(代替f4融合體中的RT/p66)是通過DNA測序加以證實的。所得融合構(gòu)建體p24_RT/p51-Nef-pl7 被稱作 F4 (p51)。F4(p51) %推斷的內(nèi)部甲硫氨酸起始位點(存在于RT/p51中)的突變使用^GeneTailor Site-Directed Mutagenesis system”(Invitrogen)實現(xiàn)，產(chǎn)生 F4(p51) *構(gòu)建體。F4(p51)和F4(p51) *表達質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化B834 (DE3)細胞。重組蛋白特性
N-末端悶232a.^- 鏈區(qū):4a.a.卜 551/51*: 426a.a]■鏈區(qū):3a.aJ ·丙ef: 206a.a.| g鏈區(qū):2a.a. ]· [p!7: 132a.aj - C-末端 長度、分子量、等電點(IP)1005 AA, 114. 5kDa, IP :8. 47 核苷酸序列(F4(p51) *)
Atggttatcgtacagsiacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaact 60 Ttaaatgcatgggtaaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatg 120 Ttttcagcattatcagaaagaaccaccccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtg 180 Oggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagaccatcaatgaggaagctgcagaa 240 Tgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatgagagaacca 300 Aggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgaca 360 Aataatccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataateetgggattaaat 420
Aaaatagtaagaatgtatagccctdccagcattctggacataagacaagg^ccaaaagaa 4Θ0 Ccttttagagactatgtagaccggttctataaaactctaagagccgagcaagcttcacag 540 Gaggtaaaaaattggatgacagaa^ccttgttggtccaaaatgcgaacccagattgtaag 600 Actabtttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgtcag 660Gaaataggaagacccggccahaaggcaagragfcttt^^TATGaggcctl GGTCCGATCTCT 720CCGATAGAAACAGTTTCGGTCAAGCTTAAACCAGGGATGGATGGTCCAAAGGTCAAGCAG 780TGGCCGCTAACGGAAGAGAAGATTAAGGCGCTCGTAGAGATTTGTACTGAAATGGAGAAG 840GAAGGCAAGATAAGCAAGATCGGGCCAGAGAACCCGTACAATACACCGGTATTTGCAATA 900AAGAAGAAGGATTCAACAAAATGGCGAAAGCTTGTAGATTTTAGGGAACTAAACAAGCGA 960ACCCAAGACTTTTGGGAAGTCCAACTAGGTATCCCACATCCAGCCGGTCTAAAGAAGAAG 1020AAATCGGTCACAGTCCTGGATGTAGGAGACGCATATTTTAGTGTACCGCTTGATGAGGAC 1080TTCCGAAAGTATACTGCGTTTACTATACCGAGCATAAACAATGAAACGCCAGGCATTCGC 1140
TATCAGTACAACGTGCTCCCGCAGGGCTGGAAGGGGTCTCCGGCGATATTTCAGAGCTCT 1200ATGACAAAAATACTTGAACCATTCCGAAAGCAGAATCCGGATATTGTAATTTACCAATAC 1260ATGGACGATCTCTATGTGGGCTCGGATCTAGAAATTGGGCAGCATCGCACTAAGATTGAG 1320GAACTGAGGCAACATCTGCTTCGATGGGGCCTCACTACTCCCGACAAGAAGCACCAGAAG 1380GAGCCGCCGTTCCTAAAGATGGGCTACGAGCTTCATCCGGACAAGTGGACAGTACAGCCG 1440
ATAGTGCTGCCCGAAAAGGATTCTTGGACCGTAAATGATATTCAGAAACTAGTCGGCAAG 1500CTTAACTGGGCCTCTCAGATTTACCCAGGCATTAAGGTCCGACAGCTTTGCAAGCTACTG 1560AGGGGAACTAAGGCTCTAACAGAGGTCATCCCATTAACGGAGGAAGCAGAGCTTGAGCTG 1620GCAGAGAATCGCGAAATTCTTAAGGAGCCGGTGCACAGGGTATACTACGACCCCTCCAAG 1680GACCTTATAGCCGAGATCCAGAAGCAGGGGCAGGGCCAATGGACGTACCAGATATATCAA I740GAACCGTTTAAGAATCTGAAGACTGGGAAGTACGCGCGCAAACGAGGGGCTCATACTAAT 1800GATGTAAAGCAACTTACGGAAGCAGTACAAAAGATTACTACTGAGTCTATTGTGATATGG 1860GGCAAGACCCCAAAGTTCAAGCTGCCCATACAGAAGGAAACATGGGAAACATGGTGGACT 1920GAATATTGGCAAGCTACCTGGATTCCAGAATGGGAATTTGTCAACACGCCGCCGCTGGTA 1980AAACTG jqccctaGCij ATGggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtggttggatggcctact 2040Gtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggagcagcatctcga 2100Gacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgt 2160Gcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacct 2220Ttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggg 2280Ggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctac 2340Cacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccaggggtcagatat 2400Ccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagag 2460
Gccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgac 2520Cctgagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcc 2580Cgagagctgcatccggagtacttcaagaactgc IAGGCC1It ATGGGTGCGAGAGCGTCAGTA 2640TTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAA 2700AAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAAT 2760CCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCC 2820CTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGT 2880GTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAG 2940CAAAACAAAAGTAAGAAAAAAGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGACACAGCAATCAG 3000GTCAGCCAAAATTACtaa 3018[SEQ ID NO :18]P24:以粗體表示的序列P51 :以大與字母表不的序列
Nef :以小與子母表不的序列P17 :加下劃線的序列方框通過基因構(gòu)建引入的核苷酸 氨基酸序列(F4(p51) *)
MVIVQNIQGQMVHQAI SPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTV 60GGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMT 120NNPPIPVGEIYKRffIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQ 180EVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL 畫畫 GPIS 240PIETVSVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAI 300KKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDED 360
FRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQY 420MDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFL J MGYELHPDKffTVQP 480IVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELEL 540AENREILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYAR | RGAHTN 600DVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETffffTEYffQATffIPEffEFVNTPPLV 660KL ^MGGKWSKSSWGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAAC 720AWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY 780HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVEEANKGENTSLLHPVSLHGMDD 840PEREVLEffRFDSRLAFHHVARELHPEYFKNC MGARASVLSGGELDRffEKIRLRPGGKK 900KYKLKHIVWASRELERFAVNPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYC 960VHQRIEIKDTKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY1005「SEQ ID NO :191P24 :氨基酸 1-232P51 :氨基酸 237-662Nef :氨基酸 666-871P17 :氨基酸 874-1005K(賴氨酸)代替甲硫氨酸(內(nèi)部"起始"密碼子)K(賴氨酸)K:代替色氨酸(W).引入突變以除去酶活性F4(p51)在 B834(DE3)細胞中的表達與F4表達株平行，評價F4(p51)表達水平和重組蛋白溶解度。誘導(dǎo)條件19小時內(nèi)，細胞在37C下牛長/22C下誘導(dǎo)(+ImM IPTG)斷裂緩沖液50mMTris/HClDH :7. 5，ImM EDTA, ImM DTT_3]蛋白質(zhì)印跡分析:試劑-兔多克隆抗RT (兔P03L16)(稀釋1/10000)-兔多克隆抗Nef-Tat (兔 388)(稀釋 1/10000)-堿性磷酸酶綴合的抗-兔抗體(稀釋1/7500)在10%還原SDS-PAGE上分析與粗提物⑴、不溶沉淀⑵和上清液⑶相對應(yīng)的細胞級分。如圖11所示，F(xiàn)4(p51)以高水平(10%總蛋白)表達，類似F4。在細胞提取物的可溶級分(S)中回收到幾乎所有的F4(p51)。用抗-Nef-tat試劑檢測后，F(xiàn)4(p51)WB模式顯示被簡化(+/_60kDa以下的截短產(chǎn)物減少)。F4(p51) *在 B834(DE3)細胞中的表達與F4(p51)未突變構(gòu)建體F4和F4*平行，22°C誘導(dǎo)F4(p51) *重組株18小時。制備粗細胞提取物并通過考馬斯染色凝膠和蛋白質(zhì)印跡分析。如圖12所示，觀察到F4(p51)和F4(p51) *融合體的高水平表達，占至少10%的總蛋白。WB模式低于+/-60kDa的截短產(chǎn)物減少。此外，就F4(p51) I勾建體而言，47kDa帶(由于內(nèi)部起始位點)消失。實施例7 :F4、F4(p51) *和F4 *的純化-純化方法I含4HIV抗原p24-RT-Nef-pl7的融合蛋白F4是按照純化方法I從大腸桿菌細胞勻漿純化的，該方法包括下列主要步驟· F4的硫酸銨沉淀· S03 Fractogel陽離子-交換色譜(正電模式)
·辛基瓊脂糖疏水相互作用色譜(正電模式)· Q瓊脂糖FF陰離子-交換色譜(正電模式)·有SDS存在條件下的Superdex 200凝膠過濾色譜·透析和濃縮此外，F(xiàn)4(p51) *融合蛋白(RT被攜帶附加突變Met592Lys的、密碼子優(yōu)化的p51取代)和F4 *蛋白(攜帶附加Met592Lys突變的F4)是用同一純化方法I純化的。蛋白定量 使用Lowry測定法測定總蛋白。測量蛋白濃度之前，針對PBS，O. 1% SDS透析所有樣品過夜，從而除去干擾物質(zhì)(脲，DTT)。BSA(Pieree)用作標準品。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡·在還原或非還原SDS-PAGE樣品緩沖液(+/_ β -巰基こ醇)中制備樣品并95°C加熱5分鐘。· 200V下,在4-20% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上,使用Imm厚的預(yù)制Novex Tris-甘氨酸凝膠或Criterion凝膠(Bio-Rad),分離蛋白75分鐘?！な褂每捡R斯亮藍R250目測觀察蛋白?！みM行蛋白質(zhì)印跡(WB)吋，4°C IOOV下將蛋白從SDS-凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad)上共I. 5小時或30V下過夜?！?F4是使用不同抗原的單克隆抗體,抗_p24、抗-Nef-Tat、抗-RT檢測的(有時，抗-p24和抗Nef-Tat的混合物用于檢測最大數(shù)目的蛋白帯)。 堿性-磷酸酶綴合的杭-小鼠或抗-兔抗體與第一抗體結(jié)合，并使用BCIP和NBT作為底物觀察蛋白帯?？?大腸桿菌蛋白質(zhì)印跡·通過SDS-PAGE分離5 μ g蛋白(Lowry)并轉(zhuǎn)移到上述硝酸纖維素膜上?！な褂枚嗫寺】?大腸桿菌抗體檢測殘余的宿主細胞蛋白。使用上述堿性-磷酸酶反應(yīng)觀察蛋白帶。純化方法I方法I包括利用硫酸銨沉淀和4個色譜步驟·在含 IOmM DTTUmM PMSFUmM EDTA 的 pH 8. 050mM Tris 緩沖液中，在 0D50(約360ml)對大腸桿菌細胞進行勻漿。1000巴下進行2次Rannie傳代?！?14400 Xg離心20分鐘除去細胞碎片和不溶物質(zhì)。·將硫酸銨(AS)從3. 8M原液加入到澄清的上清液中至I. 2M終濃度。使蛋白室溫(RT)沉淀約2小時并通過離心(lOmin，14400Xg)沉淀。將沉淀重混懸于溶解了 8M脲、IOmM DTT的pH 7. O的IOmM磷酸鹽緩沖液?！ぴ谟腥芙饬?8M脲和IOmM DTT的pH 7. O的磷酸鹽緩沖液存在條件下，在S03Fractogel柱(Merck)上捕獲抗原。洗滌柱子，從而洗脫下未結(jié)合的蛋白，接著通過使用170mM NaCl進行預(yù)洗脫步驟而除去結(jié)合的宿主細胞蛋白(HCP)。然后用溶解了 460mMNaCl、8M IIUOmM DTT的pH 7. O的磷酸鹽緩沖液洗脫F4?！な褂胮H 7的IOmM磷酸鹽緩沖液2倍稀釋S03洗脫液，并在有溶解了 4M脲、ImMDTT、230mM NaCl的pH 7. O的磷酸鹽緩沖液存在的條件下，上樣到辛基瓊脂糖柱(AmershamBiosciences)。洗滌步驟(平衡緩沖液)之后，用溶解了 8M脲、ImMDTT的pH 8. O的25mMTris緩沖液洗脫結(jié)合的F4。 稀釋辛基洗脫液并調(diào)節(jié)至pH 9. O，然后在有pH 9. O的8M脲(25mM Tris)存在的條件下，F(xiàn)4 與 Q 瓊脂糖柱(Amersham Bioscience)結(jié)合。洗掉(8M 脲、25mM Tris, pH 9. O)未結(jié)合的蛋白并通過預(yù)洗脫步驟(90mM NaCl，溶于8M脲、25mM Tris中，pH 9.0)除去HCP和F4-降解產(chǎn)物。使用溶解了 200mM NaCl、8M脲的pH 9. O的Tris緩沖液使F4從柱子上解吸。 將I % SDS加入Q洗脫液的等分試樣并針對含O. I % SDS和ImMDTT的PBS緩沖液透析，從而在將樣品注射到凝膠過濾柱上之前除去脲(制備級Superdex 200，成行連接的兩個16X60cm柱)。過程中的SDS-PAGE分析之后合并相關(guān)級分。· RT下，在透析膜(12_14kDa截留分子量)中，針對11 O. 5M精氨酸、IOmM Tris、5mM谷胱甘肽，pH 8. 5過夜透析樣品兩次。連續(xù)純化步驟在圖21中表示。F4純化結(jié)果純化過程后的SDS-PAGE/蛋白質(zhì)印跡圖13表示在F4純化過程中含F(xiàn)4級分的SDS凝膠和抗_p24/抗-Nef-Tat蛋白質(zhì)印跡。大腸桿菌勻漿在圖13第2道中表示，據(jù)估計F4占總蛋白的約10% (考馬斯藍染色的SDS-凝膠的密度掃描)。離心后，在澄清的上清液中回收到F4的可溶級分(第3道)。硫酸銨沉淀步驟除去了許多雜質(zhì)(第4道)并減少了隨后色譜步驟的蛋白電荷。此外，SM脲用于重混懸含HCP的F4的解離復(fù)合物沉淀，并通過從S03樹脂定量洗脫而完全捕獲F4。第5道中所示S03洗脫液被認為富含于F4中，但不均一模式大部分保持未變。疏水性辛基瓊脂糖柱主要除去低分子量(LMW) HCP和F4-降解產(chǎn)物(第6道)，由此簡化F4模式。Q瓊脂糖色譜可進一步簡化F4模式并除去許多雜質(zhì)(第7道)。大腸桿菌雜質(zhì)的最終純化是在該步驟之后獲得的。事實上，通過抗-大腸桿菌蛋白質(zhì)印跡分析，在Q洗脫液中沒有檢測到宿主細胞蛋白。由此產(chǎn)生的純化的F4被稱作F4Q。Superdex 200柱可將LMW F4-降解產(chǎn)物從全長F4中分離出來，提高Superdex 200洗脫液中F4的均勻性(第8道)。術(shù)語F4S可用于指代按照方法I的完整流程純化的F4。對在F4純化過程中收集的相同級分進行抗-大腸桿菌蛋白質(zhì)印跡。在抗-大腸桿 菌蛋白質(zhì)印跡上沒有可見帶，這表示Q洗脫液和Superdex洗脫液中的HCP污染低于I %。F4和蛋白回收通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析評價純化過程各步驟的F4回收。為了通過SDS-凝膠評價F4回收，上樣到SDS-凝膠上的樣品體積與純化過程中收集的不同級分的體積相對應(yīng)。表I表示含F(xiàn)4級分中的蛋白回收表I :純化過程中收集的F4-陽性級分的蛋白回收(360ml勻衆(zhòng))。使用Lowry測定法測定蛋白濃度。
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含Nef或其免疫原性片段或衍生物，和pl7Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段或衍生物，其中當P17和p24Gag同時存在時，它們之間有至少一個HIV抗原或免疫原性片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽，進一步包含Pol或RT或其免疫原性片段或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的多肽，其中RT或免疫原性片段是其中RT在C末端被截短，使得它缺少羧基末端RNA酶H結(jié)構(gòu)域的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其中RT片段是p51片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任意一項所述的多肽，其中RT在第592位包含突變，使得由另一個殘基，例如賴氨酸取代甲硫氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的多肽，其中Nef是全長Nef。
7.一種選自下列之一的多肽1.p24-RT-Nef-pl72.p24-RT*-Nef-pl73.p24-p51RT-Nef-pl74.p24-p51RT*-Nef-pl75.pl7-p51RT-Nef6.pl7-p51RT*-Nef7.Nef-pl7 8.具有接頭的Nef-p179.pl7-Nef 10.具有接頭的pl7-Nef *代表RT甲硫氨酸592突變成賴氨酸。
8.一種用于純化權(quán)利要求1-7任意一項所述的多肽的方法，該方法包括 i).提供含未純化多肽的組合物； ii).使該組合物經(jīng)過至少兩個色譜步驟； iii).任選地使該多肽羧基酰胺化； iv)進行緩沖液更換步驟以提供用于藥物制劑的適宜緩沖液中的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中有至多兩個色譜步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的方法，其中羧基酰胺化在兩個色譜步驟之間進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療HIV感染的疫苗。具體地，本發(fā)明涉及用于免疫原性組合物和疫苗中的Gag、Pol和Nef的HIV多肽和多核苷酸融合體。本發(fā)明具體涉及包含Nef或其免疫原性片段，和p17Gag和/或p24Gag或其免疫原性片段的多肽，其中當p17和p24Gag同時存在時，它們之間有至少一個HIV抗原或免疫原性片段。該多肽還可包含Pol或RT或其免疫原性片段。
文檔編號A61P31/18GK102633866SQ20111040626
公開日2012年8月15日 申請日期2005年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者G·H·沃斯, H·阿布勒希特, M·德爾錢布爾, M·馬尚, N·L·馬蒂, P·J·G·G·佩爾曼納 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司