專利名稱：絲氨酸蛋白酶抑制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有炔基氨基側鏈的絲氨酸蛋白酶抑制劑，含有它的藥物組合物，以及所述的抑制劑生產用于治療和防止與凝血酶相關的疾病的藥劑的應用。
絲氨酸蛋白酶除了別的作用之外，主要是在凝血級聯(lián)(cascade)中起重要作用。這組蛋白酶的成員是例如凝血酶、胰蛋白酶、凝血因子Ⅶa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa和C蛋白。
凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，它調節(jié)凝血級聯(lián)的最后步驟。凝血酶的基本功能是切割血纖蛋白原，產生血纖蛋白單體，后者通過交聯(lián)，形成不溶性的凝膠。此外，凝血酶通過在級聯(lián)的早期活化凝血因子Ⅴ和Ⅷ來調節(jié)凝血酶自身的生產。它在細胞水平也具有重要的作用，在細胞水平，它作用于特定的受體，造成血小板凝集，內皮細胞活化和成纖維細胞增生。因此凝血酶在血停滯和血栓形成中具有中心調節(jié)作用。由于凝血酶抑制劑具有廣泛的治療應用，在此領域已進行了詳盡的研究。
在絲氨酶蛋白酶，特別是凝血酶的合成抑制劑的開發(fā)中，對那些以類似于天然底物方式被蛋白水解酶識別的小的合成肽的興趣再增加。結果，制備出新的肽樣抑制劑，如凝血酶的轉換狀態(tài)抑制劑。
對更有效、更有選擇性的凝血酶抑制劑的研究有增無減，為的是獲得可以以更低劑量給藥且具有更少和更輕的副作用的凝血酶抑制劑。再者，對口服生物利用度給予了特別的關注。潛在的靜脈內凝血酶抑制劑在需要治療與凝血酶相關的疾病的急性護理背景方面是臨床有效的。然而，特別是在防止與凝血酶相關的疾病如心肌梗死、血栓形成和中風，需要長期的治療，優(yōu)選通過口服抗凝劑。
大多數(shù)在現(xiàn)有公開文獻中公開的肽樣凝血酶抑制劑含有精氨酸側鏈。凝血酶抑制劑也可以含有代替精氨酸的賴氨酸側鏈，如抑制劑N-Me-D-Cha-Pro-Lys-COOH及其衍生物，由Jones等公開于《酶抑制雜志》，9(1995),43-60，和抑制劑N-Me-D-Phe-Pro-Lys-X,X是羧酰胺或羧酸，由Lewis等公開于《血栓形成與血停滯》，74(4)(1995),1107-12。此外，Brady等，《生物有機與醫(yī)學化學》,3(1995),1063-78，描述了D-Phe-Pro-Lys-酮酯。其它的凝血酶抑制劑公開于WO 94/25051，其中賴氨酸或精氨酸側鏈用氨基環(huán)己基部分代替。已知的含有精氨酸和賴氨酸的凝血酶抑制劑的問題在于它們具有低的口服生物利用度。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，式Ⅰ的具有炔基氨基側鏈的絲氨酸蛋白酶抑制劑，特別是凝血酶、Ⅹa和Ⅶa抑制劑，或其前藥或其可藥用鹽是潛在選擇性抑制劑
其中A是H、任選取代的D,Lα-羥基乙?；1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，其中R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基和(3-8C)環(huán)烷基，這些基團可任選由(3-8C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、COOH、CF3或鹵素取代，和選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳鏈烯基，它們中的芳基可以任選由(1-6C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、COOH、CF3或鹵素取代；每個基團R2獨立地是H或具有與R1相同的含意；m是1、2或3；B是一個鍵，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-12C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-12C)鏈烯基)-CH2-CO-、-N((2-12C)炔基)-CH2-CO-、-N(芐基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水、堿性或中性側鏈的L-或D-氨基酸，這些氨基酸可以任選是N-(1-6C)烷基取代的；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中R3和R4獨立地是R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，或R3和R4之一與R5相連與它們鍵合的“N-C”一起形成5-或6-元環(huán)，這些環(huán)可以與脂族或芳族6-元環(huán)稠合；且R5是疏水、堿性或中性側鏈；X是帶有疏水側鏈的L-氨基酸、絲氨酸、蘇氨酸、任選含有另外的選自N、O或S的雜原子和任選由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代的環(huán)狀氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片斷
其中n是2、3或4，且W是CH或N；Y是H、-CHF2、-CF3、-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-6C)烷基、-CONR7R8且R7和R8獨立地是H或(1-6C)烷基或R7和R8一起是(3-6C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑，這些雜環(huán)可任選由(1-6C)烷基、苯基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代；且r是0、1、2或3。
此外，一些本發(fā)明化合物在口服給藥后，顯示出良好的生物利用度。
本發(fā)明化合物可用于治療和預防凝血酶介導和與凝血酶相關的疾病。這些疾病包括許多凝血級聯(lián)被活化的血栓形成和前血栓形成病癥，這些病癥包括但不限于，深處靜脈血栓形成、肺栓塞、血栓性靜脈炎、血栓形成或栓塞造成的動脈閉塞、在血管成形術或血栓溶解期間或之后的動脈再閉塞、動脈損傷或侵害性心臟病學操作后的再狹窄、術后靜脈血栓形成或栓塞、急性或慢性動脈粥樣硬化、中風、心肌梗死、癌癥和轉移瘤、以及神經變性疾病。本發(fā)明化合物也可以在體外血液循環(huán)中，如果需要在透析和手術中用作抗凝血劑。本發(fā)明化合物也可以用作體外抗凝血劑。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物具有式Ⅰ，其中X是帶有疏水側鏈的L-氨基酸、絲氨酸、蘇氨酸或-NR2-CH2-C(O)-。
其它優(yōu)選的式Ⅰ化合物是這樣的化合物，其中A如前面所定義；B是一個鍵，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-6C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-6C)鏈烯基)-CH2-CO-、-N(芐基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸，這些氨基酸可以任選是N-(1-6C)烷基取代的；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-；X是任選含有另外的選自N、O或S的雜原子和任選由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代的環(huán)狀氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片斷
更優(yōu)選的是式Ⅰ化合物，其中A是H、2-羥基-3-環(huán)己基-丙?；?、9-羥基-芴-9-羧基、R1、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，其中R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳鏈烯基；每個基團R2獨立地是H或具有與R1相同的含意；B是一個鍵，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸，這些氨基酸可以任選是N-(1-6C)烷基取代的；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-；Y是-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6、-CONR7R8，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑。
特別優(yōu)選是式Ⅰ化合物，其中A是H、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；B是一個鍵，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-或R1-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基、(3-8C)環(huán)烷基、(7-15C)芳烷基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-，且R5是疏水側鏈；Y是-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-3C)烷基、-CONR7R8,R7和R8獨立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
當A是R2OOC-(CHR2)m-時，優(yōu)選B是具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-，且另一個獨立地是(1-12C)烷基、(2-6C)鏈烯基、(3-8C)環(huán)烷基、芐基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；和X是2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸、2-八氫吲哚羧酸或-[N(3-8C)環(huán)烷基]-CH2-C(O)-。最優(yōu)選的是這樣的化合物，其中A是HOOC-CH2-；B是D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是HOOC-CH2-，另一個獨立地是(1-4C)烷基、(1-4C)烷基-SO2-或HOOC-CH2-，且R5是(3-8C)環(huán)烷基、(3-8C)環(huán)烷基(1-4C)烷基、苯基、芐基、任選由氯或(1-4C)烷氧基取代。特別優(yōu)選的是這樣的化合物，其中Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
當A是R1-SO2-時，優(yōu)選B是一個鍵、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R1-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-；X是2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸、2-八氫吲哚羧酸或-[N(環(huán)戊基)]-CH2-C(O)-或片斷
更優(yōu)選的是這樣的化合物，其中A是乙基-SO2-或芐基-SO2-；B是一個鍵、D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是乙基-SO2-或芐基-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-，且R5是(3-8C)環(huán)烷基、(3-8C)環(huán)烷基(1-4C)烷基、苯基、芐基、二苯基次甲基，這些基團任選由氯或(1-4C)烷氧基取代。最優(yōu)選的是這樣的化合物，其中Y是-CO-NH-CH2-C6H5、-CO-NH-CH2CH2-C6H5或-CONR7R8,R7和R8獨立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
最優(yōu)選地，式Ⅰ化合物中r是1。
在部分A的定義中定義的N-保護基團是任何的用于肽的N-保護基團。適合的N-保護基團可見于T.W.Green和P.G.M wuts:《有機合成中的保護基團》，第二版(Wiley,紐約，1991)和《肽、分析、合成、生物學》，第3卷，E.Gross和J.Meienhofer編(Academic Press,紐約，1981)。
“任選取代的D,Lα-羥基乙?；币辉~是指式HO-CRaRb-C(O)-的基團，其中Ra和Rb獨立地是H、疏水側鏈，或Ra和Rb一起形成5-或6-元環(huán)，它任選與一或二個脂族或芳族6-元環(huán)稠合，且此5-或6-元環(huán)由碳原子和任選一個選自N、O和S的雜原子組成。優(yōu)選的D,Lα-羥基乙?；鶊F是2-羥基-3-環(huán)己基-丙酰基-和9-羥基-芴-9-羧基。
“(1-12C)烷基”一詞是指具有1至12個碳原子的支鏈或未支鏈化的烷基，如甲基、乙基、叔丁基、異戊基、庚基、十二烷基等。優(yōu)選的烷基是(1-6C)烷基，具有1-6個碳原子。更優(yōu)選的是(1-4C)烷基。在R6、R7和R8中的定義中最優(yōu)選的是(1-3C)烷基，具有1-3個碳原子，如甲基、乙基、異丙基。
(2-12C)鏈烯基是具有2-12個碳原子的支鏈或未支鏈化的不飽和烴基。優(yōu)選的是(2-6C)鏈烯基。實例是乙烯基、丙烯基、烯丙基等。
“(1-6C)亞烷基”一詞是指具有1到6個碳原子的支鏈或未支鏈化的亞烷基，如-(CH2)m-且m是1至6、-CH(CH3)-、-CH(CH3)-(CH2)-等。在Y的定義中的優(yōu)選的亞烷基是亞乙基和亞甲基。
(2-12C)炔基是含有一個叁鍵和具有2至12個碳原子的支鏈或未支鏈化的烴基。優(yōu)選的是(2-6C)炔基，如乙炔基和丙炔基。
(6-14C)芳基是6-14個碳原子的芳族部分。芳基可以進一步含有一或多個雜原子，如N、S或O。芳基的實例是苯基、萘基、(異)喹啉基、2,3-二氫化茚基等。最優(yōu)選的是苯基。
(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳鏈烯基是烷基和鏈烯基分別被一或多個芳基取代，碳原子的總數(shù)分別為7-15和8-16。
“(1-6C)烷氧基”一詞是指具有1-6個碳原子的烷氧基，其烷基部分具有前面定義的含義。
“(3-8C)環(huán)烷基”一詞是指具有3-8個碳原子的環(huán)烷基，為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基。環(huán)戊基和環(huán)己基是優(yōu)選的環(huán)烷基。
“鹵素”一詞是指氟、氯、溴或碘。
“酯衍生物”一詞是指任何適宜的酯衍生物，優(yōu)選是(1-4C)烷基酯、如甲基-、乙基-或叔丁基酯。
1-和3-Tiq分別是指1,2,3,4-四氫異喹啉-1-或-3-羧酸；1-和3-Piq分別是指1-和3-羧基全氫化異喹啉；Atc是2-氨基-1,2,3,4-四氫化萘-2-羧酸；Aic是氨基-1,2-二氫化茚-羧酸；Phe是苯丙氨酸；Cha是環(huán)己基丙氨酸；Dpa是二苯基丙氨酸；Coa是環(huán)辛基丙氨酸；Chg是環(huán)己基甘氨酸；Nle是正亮氨酸；Asp是天冬氨酸。
“疏水側鏈”一詞是指(1-12C)烷基，任選由一或多個(3-8C)環(huán)烷基或(6-14C)芳基(它可以含有雜原子，例如氮)如環(huán)乙基、環(huán)辛基、苯基、吡啶基、萘基、四氫化萘基等取代，這些疏水側鏈可任選由取代基如鹵素、三氟甲基、低級烷基(例如甲基或乙基)、低級烷氧基(例如甲氧基)、苯氧基、芐氧基等取代。
在定義中，“取代的”一詞是指由一或多個取代基取代。
具有堿性側鏈的氨基酸是例如，但不限于，精氨酸和賴氨酸，優(yōu)選是精氨酸?！熬哂兄行詡孺湹陌被帷笔侵赴被崛缇哂?-甲基磺酰基-乙基側鏈的氨基酸(methionine sulphon)等。
環(huán)狀氨基酸是例如2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、1-氨基-1-羧基-(3-8C)環(huán)烷(優(yōu)選4C、5C或6C)、4-哌啶羧酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸、氮雜脯氨酸、2-八氫吲哚羧酸等。優(yōu)選的是2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸和2-八氫吲哚羧酸。“前藥”一詞是其中式Ⅰ化合物的炔基氨基側鏈被保護的化合物，例如被羥基、(1-6C)烷氧基或(1-6C)烷氧基羰基保護。
本發(fā)明還涉及制備式Ⅰ化合物的方法，包括偶合適合地被保護的氨基酸或氨基酸類似物，接著去除保護基團。
式Ⅰ化合物可以用常規(guī)用于這些化合物的方式制備。具有炔基氨基側鏈的修飾的氨基酸以類似于對其它氨基酸已知的方法的方式引入。
為此目的，在溶液中或固體載體上，將適合的Nα保護的(和側鏈保護的，如果反應性側鏈存在)氨基酸衍生物或肽活化和偶合到適合的羧基保護的氨基酸或肽衍生物上。α-氨基官能團通常是通過氨基甲酸乙酯官能團如酸不穩(wěn)定的叔丁氧基羰基(Boc)、芐氧羰基(Z)和取代的類似物或堿不穩(wěn)定的9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)基團來發(fā)生。Z基團也可以通過催化氫化來去除。其它適合的氨基保護性基團包括Nps、Bmv、Bpoc、Msc等。氨基保護性基團的全面的綜述給出在《肽、分析、合成、生物學》第3卷，E.Gross和J.Meienhofer編(Academic Press，紐約，1981)。羧基的保護可以通過酯的形成來保護，例如堿不穩(wěn)定的酯，象甲基-或乙基酯、酸不穩(wěn)定的酯象叔丁基酯，或氫解不穩(wěn)定的酯如芐基酯。炔基氨基側鏈的保護可以用上文提到的基團來實現(xiàn)。適合地保護的氨基酸或肽的羧基的活化可以用疊氮化物、混合酐、活性酯或碳化二亞胺方法來發(fā)生，特別是加入催化和外消旋抑制化合物，如1-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀酰亞胺、3-羥基-4-氧代-3,4-二氫-1,2,3-苯并三嗪、N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺。參見，例如《肽、分析、合成、生物學》(參見上文)和Pure and Applied Chem.59(3),331-334(1987)。
本發(fā)明化合物，它可以是游離堿形式，可以以可藥用鹽的形式，由反應混合物分離。可藥用鹽也可以通過用有機或無機酸如氫氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、馬來酸、丙二酸、甲磺酸、富馬酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸和抗壞血酸處理式Ⅰ的游離堿來獲得。
本發(fā)明化合物具有一或多個手性碳原子，因此可以獲得其純對映體，或對映體混合物，或含有非對映體的混合物。獲得純對映體的方法是本領域已知的，例如由旋光酸或外消旋混合物獲得的鹽的結晶，或使用手性柱色譜。對于非對映體可以使用正相或反相柱。
本發(fā)明化合物可以經腸或不經腸給藥，且優(yōu)選給藥于人，每日劑量0.001-100mg/kg體重，優(yōu)選0.01-10mg/kg體重。與可藥用的輔助劑混合，例如如標準參考文獻中所描述的，Gennaro等，Remington’sPharmaceutical Science,(第18版，Mack Publishing Company,1990，參見特別是第8部分，Pharmaceutical Preparations and TheirManufacture)，化合物可以壓制成固體劑量單位，如丸劑、片劑，或配制成膠囊或栓劑。借助于可藥用的液體，化合物也可以以溶液、懸浮液、乳液的形式施用，例如用作注射制劑，或作為噴霧劑，例如用作鼻噴霧劑。
制作劑量單位，例如片劑時，考慮使用常規(guī)的添加劑如填料、著色劑、聚合物粘合劑等。通?？梢允褂貌桓蓴_活性化合物功能的可藥用添加劑?？膳c組合物一起給藥的適合的載體包括乳糖、淀粉、纖維素衍生物等，或其混合物，以適合量使用。
本發(fā)明用下列實施例進一步說明。實施例“-賴氨炔基ψ[COCO]-OH、-賴氨炔基-OMe和-賴氨炔基-(2-噻唑基)”是指下式的殘基
其中Y=分別是COOH、OCH3和2-噻唑基。Azt=2-氮雜環(huán)丁烷羧酸；Boc=叔丁氧基羰基；Cbz=芐氧羰基；Bzl=芐基。實施例1HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)1-氨基-4-氯-2-丁炔鹽酸鹽將1,4-二氯-2-丁炔(73.8g)溶解于氯仿(600ml)中。加入六胺(84.0g)，反應混合物回流加熱2.5小時，之后在5℃下冷卻24小時。濾出六胺配合物(220g)。將配合物的乙醇(1l)溶液與濃鹽酸(180ml)一起在室溫下攪拌24小時。濾出沉淀出的氯化銨，將濾液真空濃縮，直到晶體初現(xiàn)。之后加入乙醚，沉淀出1-氨基-4-氯-2-丁炔的鹽酸鹽。由乙醇/乙醚重結晶，給出1-氨基-4-氯-2-丁炔鹽酸鹽(59.75g)。
TLC:Rf=0.60,硅膠，二氯甲烷/甲醇/水70/30/5 v/v/v。(b)1-乙?；被?4-氯-2-丁炔將1-氨基-4-氯-2-丁炔鹽酸鹽(59.75g)溶解于10％乙酸鈉的水溶液(335ml)中。加入乙酸乙酯(500ml)，在室溫下滴加入乙酸酐(70ml)。加入25％的乙酸鈉水溶液至pH5，并將此溶液在室溫下攪拌30分鐘。分離開乙酸乙酯層，水層用乙酸乙酯萃取二次。合并的有機層用水、鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并真空蒸發(fā)，產生1-乙?；被?4-氯-2-丁炔，如黃色漿(58.8g)。
TLC:Rf=0.99，硅膠，二氯甲烷/甲醇/水70/30/5 v/v/v。(c)乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯向氫化鈉(60％礦物油分散液，3.48g)的二噁烷(70ml)的冷(0℃)溶液滴加入無水乙醇(70ml)。讓混合物升溫至室溫，滴加入乙酰氨基丙二酸二乙酯(20.5g)的二噁烷(70ml)溶液。加入碘化鈉(9.07g)，并在室溫下滴加1-乙?；被?4-氯-2-丁炔(11g)的二噁烷(140ml)溶液。加入另外的100ml乙醇后，混合物回流2.5小時。將反應混合物冷卻，濾出形成的沉淀物。使用硅膠色譜(洗脫液乙酸乙酯/甲醇9/1 v/v)純化，產生乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯(15.9g)。
TLC:Rf=0.25,硅膠，乙酸乙酯。(d)2,6-二氨基-4-己炔酸二鹽酸鹽(H-賴氨炔酸二鹽酸鹽)將乙酰氨基(4-乙酰氨基-2-丁炔基)-丙二酸二乙酯(7.64g)溶解于乙酸(140ml)和6M鹽酸溶液(290ml)的混合物中，并在95℃下加熱過夜。真空濃縮混合物。殘留物用乙醇/水結晶，產生2,6-二氨基-4-己炔酸二鹽酸，為晶狀粉末(4.0g)。(e)Boc-賴氨炔基(Cbz)-OH
將五水硫酸銅(Ⅱ)(287mg)加入到2,6-二氨基-4-己炔酸二鹽酸鹽(500mg)的17ml二噁烷/水3/2v/v溶液中，pH通過加入2M氫氧化鈉溶液調節(jié)到9。在室溫下，與2M氫氧化鈉溶液一起，滴加在二噁烷(10ml)中的N-(芐氧基羰氧基)-琥珀酰亞胺(573mg)，保持pH在9-9.5左右。加畢，將反應混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物過濾，并將由此獲得的沉淀物懸浮于二噁烷(20ml)中。加入二碳酸二叔丁基酯(500mg),pH通過加入4M氫氧化鈉溶液調節(jié)到12-13。反應混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物過濾，濾液用水稀釋。加入4M鹽酸溶液，直到pH2，水層用二氯甲烷萃取二次。合并的有機相用水洗滌，經硫酸鈉干燥，蒸發(fā)去除溶劑，產生Boc-賴氨炔基(Cbz)-OH(540mg)。
TLC:Rf=0.70，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(f)Boc-賴氨炔基(Cbz)-NMeOMe將N,O-二甲基-羥胺鹽酸鹽(363mg)和[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽](1.2g)加入到Boc-賴氨炔基(Cbz)-OH(1.4g)的二氯甲烷(50ml)溶液中，pH通過加入N,N-二異丙基乙胺調節(jié)到pH9-10。反應混合物在室溫下攪拌1小時。將混合物依次用冷的2M鹽酸溶液、水、5％碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。有機層經硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物用硅膠色譜純化(洗脫液乙酸乙酯/庚烷3/2 v/v)，產生Boc-賴氨炔基(Cbz)-NMeOMe(1.37g)。
TLC:Rf=0.70，硅膠，乙酸乙酯/庚烷4/1 v/v。(g)Boc-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)將2-溴噻唑(1.78g)的乙醚(10ml)溶液滴加入正丁基鋰(10.9mmol)的乙醚(10.9ml)的冷(-78℃)的攪拌著的溶液中。在溶液在-78℃攪拌30分鐘后，緩慢加入Boc-賴氨炔基(Cbz)-NMeOMe(1.37g)的無水四氫呋喃(15ml)溶液?；旌衔镌?78℃攪拌1小時，之后加入5％的碳酸氫鈉水溶液。讓混合物升溫至室溫，將不同的層分離。水層用乙醚萃取。合并的有機層用水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物用硅膠色譜(洗脫液乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v)純化，產生Boc-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.21g)。
TLC:Rf=0.72,硅膠，乙酸乙酯/庚烷3/1 v/v。(h)H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA將Boc-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.21g)溶解于三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(15ml；1/1 v/v)，并在室溫下攪拌1小時。粗制的胺在蒸發(fā)去除溶劑之后分離，定量產生黃色的油狀物，即刻用于制備N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)。
TLC:Rf=0.25,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(i)H-D-Cha-OMe.HCl向冷(-20℃)無水甲醇(195ml)中滴加入亞硫酰氯(28ml)。加入H-D-Cha-OH.HCl(40g)，反應混合物回流加熱5小時。反應混合物真空濃縮，與甲醇共蒸發(fā)(3次)。殘留物用甲醇/乙醚結晶，產生H-D-Cha-OMe.HCl，為白色晶狀粉末(40.9g)。
TLC:Rf=0.66,硅膠，正丁醇/乙酸/水10/1/3 v/v/v。(j)N-(叔丁氧基羰基甲基)-D-Cha-OMe將溴代乙酸叔丁基酯(36g)加入到攪拌著的H-D-Cha-OMe.HCl(40.9g)的400ml乙腈溶液中。混合物的pH用N,N-二異丙基乙胺調節(jié)至8.5?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?6小時，真空蒸發(fā)。殘留物溶解于二氯甲烷中，溶液用水洗滌，用硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)。在硅膠上用庚烷/乙酸乙酯9/1(v/v)作洗脫液色譜，給出64g N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-OMe。
TLC:Rf=0.25,硅膠，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(k)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe將N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-OMe(64g)和二碳酸二叔丁基酯(40.3g)的N,N-二甲基甲酰胺(500ml)溶液的pH用N,N-二異丙基乙胺調節(jié)到8.5?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?6小時。真空去除溶劑。向殘留物加入二氯甲烷和水。將有機層分開，用冷1N鹽酸、水、5％碳酸氫鈉和水洗滌。有機層用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)濾液成非晶形固體狀的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe，產量59.6g。
TLC:Rf=0.50,硅膠，二氯甲烷/庚烷1/1 v/v。(l)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH將N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OMe(59.6g)的900ml二噁烷/水9/1(v/v)溶液用足夠量的6N氫氧化鈉處理，保持其pH為12在室溫下6小時。酸化后，混合物倒入水中，并用二氯甲烷萃取。有機層用水洗滌，用硫酸鈉干燥。濾液蒸發(fā)，產生54g N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH。
TLC:Rf=0.60,硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(m)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OSu.
將N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH(12.5g)的200ml乙腈溶液用N-羥基琥珀酰亞胺(4.1g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(6.84g)在室溫下處理過夜。反應混合物蒸發(fā)至于，殘留物溶解于乙酸乙酯中。有機相用水洗滌，經硫酸鈉干燥，濃縮，給出活性酯，它直接用于下一步驟。(n)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH將H-Pro-OH.HCl(7.5g)溶解于100ml水中。反應混合物的pH用1N氫氧化鈉溶液調節(jié)到8，之后滴加溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺中的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OSu。反應在室溫下在pH約8下攪拌過夜。將反應混合物冷卻，用1N鹽酸調節(jié)至pH約2。水層用乙酸乙酯萃取。有機相用水洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空蒸發(fā)。硅膠純化，使用梯度液乙酸乙酯/甲醇9/1→1/1(v/v)，給出11.0g所需二肽。
TLC:Rf=0.81,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(o)N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)將N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-OH(1.31g)溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺(15ml)中。加畢三乙胺(750μl)，反應混合物放置于氮氣，冷卻到-15℃。隨后加入氯甲酸異丁基酯(352μl)，將混合物在-15℃下攪拌15分鐘。將H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(1.15g)溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中，滴加入冷的混合酐溶液，通過加入三乙胺保持pH在8.5。反應混合物在-15℃下攪拌30分鐘。將反應混合物蒸發(fā)至干。殘留物溶解于乙酸乙酯中，依次用水、5％碳酸氫鈉水溶液、水和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空濃縮。殘留物在硅膠上色譜(洗脫液二氯甲烷/甲醇95/5 v/v)純化，產生N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.77g)。(p)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)將N-Boc-N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(1.77g)在室溫下用三氟乙酸/茴香硫醚10/1 v/v(20ml)處理4小時。反應混合物真空濃縮，殘留物溶解于水中。用乙醚徹底洗滌水相。水層直接裝填到制備HPLC Supelcosil LC-18-BD柱上，使用20％A/70％B/10％C至20％A/50％B/30％C梯度洗脫體系，歷時45分鐘，流速20ml/min。(A:0.5M磷酸緩沖液pH2.1，B水，C乙腈/水3/2 v/v)。
產生二種非對映體。*300mg.Massa:ESI+:518.5[AH]+；259.8[AH2]2+Rt(LC):28.81分鐘；20％A/80％B至20％A/20％B/60％C，經40分鐘*500mg.Massa:ESI+:518.5[AH]+；259.8[AH2]2+Rt(LC):29.88分鐘；20％A/80％B至20％A/20％B/60％C，經40分鐘實施例2N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)Boc-賴氨炔基(Cbz)-OMe將[2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽](1.83g)加入到Boc-賴氨炔基(Cbz)-OH(2.15g)在二氯甲烷∶甲醇9∶1混合物(25ml)的溶液中，pH通過加入N,N-二異丙基乙胺調節(jié)至7-8。反應混合物室溫下攪拌1小時?；旌衔镉?N鹽酸、水、5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌。有機層經無水硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。殘留物在硅膠上用乙酸乙酯/庚烷6/4v/v作洗脫液進行色譜純化。產量2.17g。
Rf=0.5,硅膠，乙酸乙酯/庚烷3/1 v/v。(b)2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(芐氧基羰基氨基)-庚-5-炔-腈在-78℃下，向攪拌著的2g Boc-賴氨炔基-OMe的60ml二氯甲烷溶液加入18.2ml預冷卻的二異丁基鋁氫化物(1.0M的己烷液)溶液，加入的速度要使溫度保持低于-70℃。溶液攪拌半小時。將混合物倒入檸檬酸的水溶液中，用二氯甲烷萃取。合并的萃取液用水、5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，并過濾。濾液真空濃縮，產生2.25g油。粗制的產物溶解于25ml二氯甲烷中。將溶液冷卻到0℃，加入0.31g芐基三乙基氯化銨、1.2ml乙酸酐和2.5g氰化鈉的75ml水溶液?；旌衔镌?-5℃下劇烈攪拌30分鐘。分離出有機層，用水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干。殘留物在硅膠上用庚烷∶乙酸乙酯8∶2(v/v)作洗脫液進行色譜純化，給出1.4g 2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(芐氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈。
Rf=0.6,硅膠，庚烷/乙酸乙酯1/1 v/v。(c)H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH在-20℃下，將6.5g氣態(tài)氯化氫導入1.4g 2-乙酰氧基-3-(丁氧羰基氨基)-7-(芐氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈在乙醚/甲醇9/1 v/v混合物的溶液中?；旌衔镌?-4℃下攪拌過液。之后將混合物冷卻到-20℃，加入6.75ml水。反應混合物在20℃下攪拌4小時。分離出有機層。水相的pH用1N氫氧化鈉調節(jié)至10，接著用1-丁醇萃取。合并的萃取液用鹽水洗滌，真空濃縮，給出650mg H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
Rf=0.17,乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(d)N-Boc-N-Me-D-Phe-OH將商品化的H-N-Me-D-Phe-OH(11g)溶解于二噁烷/水1/2(165ml)混合物中，接著添加二碳酸二叔丁基酯(19.1g)。反應混合物的pH用氫氧化鈉作為堿保持在8.5-9。接著，反應混合物真空濃縮，殘留物溶解于乙酸乙酯中。有機相用0.1N鹽酸和飽和氯化鈉洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾，并蒸發(fā)到干，給出17.1g產物。
TLC:Rf=0.35,硅膠，二氯甲烷/甲醇8/2 v/v。(e)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH根據(jù)針對N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OBzl合成(參見實施例1)描述的步驟偶合N-Boc-N-Me-D-Phe-OH(17.1g)和H-Pro-OMe.HCl(10.1g)。獲得的二肽，N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OMe(22.6g)，溶解于二噁烷/水9/1(200ml)中，在室溫下用4N氫氧化鈉(21.7ml)處理過液。反應混合物用300ml冰水稀釋，用4N鹽酸酸化(pH2)，用二氯甲烷萃取。合并的有機層用飽和氯化鈉洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)至干，給出粗制產物。用乙醚/庚烷2/3 v/v結晶，給出純的N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(12.6g)。
TLC:Rf=0.20,硅膠，甲苯/乙酸乙酯6/4 v/v。(f)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH在-20℃下，將氯甲酸異丁基酯(0.101g)加入到N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(0.195g)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中，用三乙胺將混合物pH調節(jié)至8。在-20℃下，將pH用三乙胺調節(jié)至8.5的H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(0.3g)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)溶液加入到反應混合物中?；旌衔飻嚢柽^夜。反應未完成，因此將N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-OH(293mg)的N,N-二甲基甲酰胺(5ml)溶液在0℃下用N-羥基琥珀酰亞胺(95mg)和1,3-二環(huán)己基碳化二亞胺在pH8.5下處理，并加入到反應混合物中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時。真空去除揮發(fā)物。殘留物溶解于二氯甲烷中。溶液用水洗滌，用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干。殘留物在硅膠上用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/5/1.5/2.75 v/v/v/v作洗脫液進行色譜分離。
將級分合在一處，給出0.26g N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
Rf=0.24,用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/5/1.5/2.75 v/v/v/v于硅膠上。(g)N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH將N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(260mg)的20ml二氯甲烷溶液用1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氫-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮(180mg)處理。混合物在室溫下攪拌3個半小時，用硫代硫酸鈉溶液和水洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，給出0.35gN-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH，與試劑的一些降解產物一起。
Rf=0.36，用乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v于硅膠上。(h)N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH將N-Boc-N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH(0.3g)的三氟乙酸/茴香硫醚10/1 v/v(10ml)混合物中的溶液在室溫下攪拌4小時。反應混合物真空濃縮，溶解于水中，用乙醚洗滌。殘留物真空干燥，給出430mg粗制的N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH，它在制備HPLC Supelcosil LC-18-DB柱上純化，使用A20％；B80％；C0％至A20％；B70％；C10％梯度洗脫體系，歷時45分鐘，流速20ml/min。
產生二種非對映體。*53.7mg；MS:FAB+429.1[M+H]；FAB-426.9[M-H]Rt(LC):15.25分鐘；A:20％；B:80％；C:0％至A:20％；B:20％；C60％，經40分鐘*51.6mg；MS:FAB 429.1[M+H]；FAB-426.8[M-H]Rt(LC):16.30分鐘；A:20％；B:80％；C:0％至A:20％；B:20％；C60％，經40分鐘實施例3N-Me-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH與實施例2(e)中描述的步驟相同，由N-Me-N-Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OMe.HCl為原料，制備出N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。
TLC:Rf=0.26，硅膠，乙酸乙酯/甲醇4/1 v/v。(b)Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe將2-乙酰氧基-3-(叔丁氧羰基氨基)-7-(芐氧羰基氨基)-庚-5-炔-腈(36g)的乙醚/甲醇3/1 v/v(1l)溶液冷卻到-20℃。向溶液中通入氣態(tài)氯化氫，直到濃度達到3M(109g)，之后將混合物在0-4℃攪拌過夜。加入水(170ml)，加入速度使溫度＜5℃。接著，讓反應混合物升溫，在室溫下再攪拌5小時。分離出有機相。水層的pH用稀氫氧化鈉調節(jié)到10，接著用1-丁醇萃取。合并的萃取液用鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，并蒸發(fā)至干，給出H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(58g)。向H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(58g)的甲醇溶液中加入二碳酸二叔丁基酯(18.4g),pH通過加入三乙胺調節(jié)至8。反應混合物在室溫下攪拌。反應完畢后，將之真空濃縮。殘留物溶解于乙酸乙酯中，用0.1N鹽酸溶液和鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂干燥，過濾和蒸發(fā)。殘留物在硅膠上(洗脫液庚烷/乙酸乙酯7/3 v/v，至乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v的梯度)色譜純化。將級分合在一處，給出4.76g Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。
TLC:Rf=0.40，硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。
另外，分離出一副產物，經鑒定為Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu(0.94g)。
TLC:Rf=0.47，硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(c)H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA根據(jù)實施例1h中描述的方法，將Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(500mg)轉化成標題化合物(500mg)，即刻用于偶合。
TLC:Rf=0.12，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe向N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(546mg)的N,N-二甲基甲酰胺(10ml)的冷(0℃)溶液中依次加入1-羥基苯并三唑(202mg)，二環(huán)己基碳化二亞胺(308mg)和H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(516mg)，之后將溶液的pH用三乙胺調節(jié)到8。反應混合物在0下攪拌1小時，保持在室溫下過夜。將混合物冷卻到-20℃，通過過濾去除二環(huán)己基脲。濾液蒸發(fā)到干。殘留物溶解于乙酸乙酯中，用1N鹽酸、水、5％碳酸氫鈉和水依次洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空濃縮。殘留物在硅膠上用庚烷/乙酸乙酯1/1→1/4(v/v)作洗脫液進行色譜分離。將含有N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe級分合并，蒸發(fā)。產量544mg。
TLC:Rf=0.39，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH將N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(544mg)溶解于二噁烷/水7/3(v/v)(13ml)中，用2N氫氧化鈉溶液(0.61ml)在室溫下處理1小時。反應混合物用水(30ml)稀釋，加入2N鹽酸溶液，直到pH2，水層用二氯甲烷萃取。合并的有機相用水、鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，給出所需的產物。產量560mg。
TLC:Rf=0.47，硅膠，二氯甲烷/甲醇4/1 v/v。(f)N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH將N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(500mg)溶解于2.3ml的1-羥基-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮1-氧化物的二甲基亞砜的0.5M溶液，在室溫過夜攪拌。反應混合物用硫代硫酸鈉(1.25g)的150ml水的溶液驟止，用冰浴冷卻，之后溶液的pH用2N鹽酸調節(jié)到2。水層用二氯甲烷萃取，合并的有機層用飽和的氯化鈉溶液洗滌。有機相經硫酸鈉干燥，過濾，并真空蒸發(fā)，給出粗制的N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH。
TLC:Rf=0.71，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水88/31/18/7 v/v/v/v。(g)N-Me-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH將粗制的N-Me-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OH在與實施例2h中描述的相同的條件下處理，在HPLC純化后，給出175mg純的N-Me-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH，為非對映體混合物。
Rt(LC):22.19和22.83分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例43,3-二苯基丙?；?Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)3,3-二苯基丙?；?脯氨?；?OH與實施例2e中描述的步驟相同，使用3,3-二苯基丙酸(5.0g)和H-Pro-OMe.HCl(3.66g)，制備出3,3-二苯基丙酰基-脯氨?；?OH(5.2g)TLC:Rf=0.65，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(b)3,3-二苯基丙?；?Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe與實施例3中描述的步驟相同，將3,3-二苯基丙酰基-脯氨?；?OH(648mg)與H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(722mg)偶合，純化后，給出被保護的三肽3,3-二苯基丙酰基-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(1.13g)。
TLC:Rf=0.40，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)3,3-二苯基丙?；?Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH與實施例3(e)中描述的步驟相同，將3,3-二苯基丙酰基-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(860mg)皂化。與實施例2g中描述的一樣，粗制的產物在二氯甲烷(80ml)中使用1,1,1-三乙酰氧基-1,1-二氫-1,2-benziodoxol-3(1H)-酮(594mg)氧化。隨后在TFA和茴香硫醚中脫保護(實施例2h)，給出3,3-二苯基丙?；?Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(229mg)，為非對映體混合物。
Rt(LC):20.31分鐘，20％A,60％B和20％C至20％A,80％C，經30分鐘。實施例5芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH正Leu(環(huán))-Glv是指下式的結構片斷
(a)N-Boc-L-α-氨基-ε-己內酰胺向攪拌著的(10g)的二噁烷/水(2/1 v/v)(30ml)的溶液中加入1N氫氧化鈉溶液(7.8ml)，接著加入二碳酸二叔丁基酯(18.8g)，將混合物在室溫下攪拌16小時，并真空濃縮。殘留物溶解于乙酸乙酯中，用水和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并真空蒸發(fā)。粗制的物質用己烷研磨，過濾，并真空干燥，產生N-Boc-L-α-氨基-ε-己內酰胺(16g)。
TLC:Rf=0.85,硅膠，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(b)Boc-正Leu(環(huán))-Gly-OMe將N-Boc-L-α-氨基-ε-己內酰胺(10g)溶解于二氯甲烷(100ml)中。在-20℃下，緩慢加入雙(三甲基甲硅烷基)酰胺在四氫呋喃/環(huán)己烷(1/1 v/v)中的1M溶液(1當量)，并將混合物攪拌30分鐘。隨后加入溴乙酸甲酯(4ml)，并將混合物在室溫下攪拌2小時。加入另一份雙(三甲基甲硅烷基)酰胺在四氫呋喃/環(huán)己烷(1/1 v/v)中的溶液，迫使反應完畢。混合物用二氯甲烷稀釋，用0.1N鹽酸溶液、水、5％碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并真空蒸發(fā)。殘留物在硅膠上(洗脫液庚烷/乙酸乙酯/6/4v/v)色譜純化，產生N-Boc-正Leu(環(huán))-Gly-OMe(12g)。
TLC:Rf=0.55，硅膠，乙酸乙酯/庚烷6/4 v/v。(c)芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-OMe將N-Boc-正Leu(環(huán))-Gly-OMe(5.4g)溶解于50％TFA/二氯甲烷1/1(v/v)(40ml)中，并在室溫下攪拌1小時。反應混合物真空蒸發(fā)。粗制的胺溶解于二氯甲烷(40ml)中，冷卻(0℃)，并加入芐基磺酰氯(3.43g)。加入三乙胺，在反應期間保持pH為8。混合物在室溫下攪拌1小時，之后將混合物真空濃縮。將殘留物溶解于乙酸乙酯中，用5％碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾，并真空蒸發(fā)，產生芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-OMe(6.1g)。
TLC:Rf=0.88，硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(d)芐基SO2-正Leu(環(huán))-Glv-OH將芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-OMe(6.1g)的100ml二噁烷/水9/1的溶液用足夠量的1N氫氧化鈉處理，在室溫下保持pH在13持續(xù)2小時。酸化后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取。有機層用水洗滌，經硫酸鈉干燥。過濾，接著蒸發(fā)溶劑，給出所需的化合物(6.3g)。
TLC:Rf=0.73,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/20/6/11 v/v/v/v。(e)芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH與實施例3中描述的步驟相同，以芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-OH(385mg)和H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(520mg)為原料制備出標題化合物。將被保護的三肽(625mg)皂化，氧化和去保護(參見實施例4)，在HPLC純化后，給出芐基SO2-正Leu(環(huán))-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(68mg)，為非對映體混合物。
Rt(LC):25.9分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和80％C，經40分鐘。實施例6乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OMe(a)Boc-D-Cha-Pro-OPac(-OPac=苯乙酮酯)類似于實施例2中描述的方法，使用Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OPac，制備Boc-D-Cha-Pro-OPac。
TLC:Rf=0.5,硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac將Boc-D-Cha-Pro-OPac(3.8g)溶解于50％TFA/二氯甲烷(25ml)中，并在室溫下攪拌30分鐘。將反應混合物真空蒸發(fā)。粗制的胺溶解于二氯甲烷(50ml)中，并在-78℃下加入乙磺酰氯(0.8ml)。在反應期間，加入三乙胺，保持pH在8。在0℃下，將混合物攪拌3小時，之后加入水(25ml)。在室溫下另外攪拌30分鐘之后，反應混合物真空濃縮。殘留物溶解于乙醚中，用1N鹽酸溶液、水、5％碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并真空蒸發(fā)。用甲醇研磨粗制的物質，產生乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac(3.0g)。
TLC:Rf=0.6，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)乙基SO2-D-Cha-Pro-OH向乙基SO2-D-Cha-Pro-OPac(10g)的四氫呋喃(250ml)溶液中加入四丁基氟化銨在四氫呋喃(84ml)中的1M溶液。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘，并倒入水(1l)中。水溶液用乙酸乙酯萃取。合并的有機層依次用1N鹽酸溶液和水洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空濃縮。殘留物用乙酸乙酯/二異丙醚結晶來純化，產生乙基SO2-D-Cha-Pro-OH(6.0g)。
TLC:Rf=0.2，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(d)乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OMe如實施例3(d)所述，偶合乙基SO2-D-Cha-Pro-OH(515mg)和H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA，給出被保護的三肽(550mg)。氧化，接著脫保護(參見實施例2)，在HPLC純化后，給出所需的產物(130mg)，為非對映體混合物。
Rt(LC):38.2分鐘和38.5分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例7乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH類似于實施例6，制備出乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[CHOHCO]-OMe(550mg)。隨后根據(jù)實施例3和2中所述的方法，皂化，氧化和脫保護，在HPLC純化后，給出180mg乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(非對映體混合物)。
Rt(LC):35.7分鐘和36.0分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例81-Piq-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)2-Cbz-(4aR,8aR)-全氫異喹啉-1(R,S)-羧酸(=N-(Cbz)-1-Piq-OH)如EP 0643073，實施例1所述，合成出N-(Cbz)-1-Piq-OH。
TLC:Rf=0.85，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水63/30/6/11 v/v/v/v。(b)N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH根據(jù)實施例2中所述的方法，偶合N-(Cbz)-1-Piq-OH(500mg)和H-Pro-OtBu(270mg)，產生N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OtBu(634mg)。在二氯甲烷(1ml)、三氟乙酸(3ml)、苯甲醚(0.15ml)的混合物中在室溫下1小時來完成此叔丁基酯的去除。反應混合物在低溫下真空濃縮，殘留物溶解于pH為9.5的水中。水相用乙醚洗滌，之后水相用2M鹽酸溶液酸化至pH2.5。水層用乙酸乙酯萃取，有機相用鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，真空濃縮，產生N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH(588mg)。
TLC:Rf=0.54，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水60/3/1/2 v/v/v/v。(c)1-Piq-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH根據(jù)實施例3所述的方法偶合N-(Cbz)-1-Piq-Pro-OH(478mg)和賴氨炔基部分。將純化的保護三肽(667mg)皂化、氧化和脫保護(參見實施例2)，在HPLC純化后，給出1-Piq-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(33mg)的單異構體。
Rt(LC):20.08分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例9HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH類似于實施例3所述的方法，將685mgN-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(參見實施例1)偶合到H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(參見實施例3c)，之后將被保護的三肽(658mg)皂化、氧化、脫保護和純化，產生158mg HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH，為非對映體混合物。
Rt(LC):22.3分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例10HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-環(huán)戊基-Gly-OMe將H-Gly-OMe.HCl(46.4g)溶解于400ml甲醇中，加入環(huán)戊酮(34g)和氰基硼氫鈉(14g)，讓反應在室溫下進行16小時。反應混合物用6M鹽酸驟止直到pH2，并在室溫下攪拌30分鐘。減壓蒸發(fā)去除溶劑，殘留物溶解于水中，用乙醚洗滌。pH通過加入6M氫氧化鈉溶液調節(jié)到pH＞10，產物用二氯甲烷萃取，用鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并減壓濃縮?；衔镉靡宜嵋阴ソY晶成HCl鹽。產量43.5g。
TLC:Rf=0.71，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水88/31/18/7 v/v/v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH根據(jù)實施例1中對二肽部分描述的步驟，使用N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-OH和N-環(huán)戊基-Gly-OMe，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH。
TLC:Rf=0.30，硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(c)HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Glv-賴氨炔基ψ[COCO]-OH按實施例3所述的方法，將N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH(547mg)偶合到H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(參見實施例3c)，之后將被保護的三肽(660mg)皂化、氧化、脫保護和純化，產生212mg HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH，為非對映體混合物。Rt(LC):28.5和29.1分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例11HOOC-CH2-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH根據(jù)實施例19所述方法，使用N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-OH和H-Pro-OBzl.HCl，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH。
TLC:Rf=0.63，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水664/31/18/7 v/v/v/v。HOOC-CH2-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH按實施例3所述的方法，將677mgN-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH與H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA偶合，之后將獲得的三肽(814mg)皂化、氧化、脫保護和HPLC純化，給出HOOC-CH2-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(248mg)，為非對映體混合物。Rt(LC):16.1和17.0分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例12HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH根據(jù)實施例1中描述的類似步驟，將H-D-p-Cl-Phe-OH.HCl(10g)轉化成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH。產量16.7g。
TLC:Rf=0.27，硅膠，乙酸乙酯/甲醇9/1 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OSu(Su=琥珀酰亞胺)
將N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OH(14.67g)的250ml乙腈溶液用N-羰基琥珀酰亞胺(4.11g)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(6.86g)在室溫下處理過夜。將反應混合物蒸發(fā)至干，殘留物溶解于乙酸乙酯中。有機相用水洗滌，經硫酸鈉干燥，濃縮，給出19.11g活性酯，它直接用于下一步驟。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH將H-Pro-OH.HCl(10.79g)溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺和100ml水中。反應混合物的pH用1N氫氧化鈉溶液調節(jié)至8，之后滴加溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中的N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-OSu(19.11g)。反應在室溫下，pH約8下攪拌過夜。將反應混合物冷卻，并用1N鹽酸調節(jié)到pH約2。水層用二氯甲烷萃取。有機相用水洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空蒸發(fā)。硅膠純化，使用梯度液乙酸乙酯/甲醇9/1→1/1，給出7.04g所需二肽。
TLC:Rf=0.24，硅膠，乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v。(d)HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH按實施例3所述的方法，將N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH(500mg)與H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA偶合，之后將獲得的三肽(572mg)皂化、氧化、脫保護和通過HPLC純化，給出HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH(129mg)，為非對映體混合物。
Rt(LC):22.3和23.1分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C。實施例13HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2如實施例1中的所述的方法制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如實施例3(b)中所述的方法制備出Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu。(a)Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH向Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu(320mg)的二噁烷/水9/1v/v(11.2ml)的溶液中加入1ml 1N氫氧化鈉溶液。反應混合物在室溫下攪拌3小時。混合物通過加入1N鹽酸溶液調節(jié)到pH7，且通過蒸發(fā)去除大多數(shù)的二噁烷?；旌衔锏谷肜渌校靡宜嵋阴ポ腿?。合并的有機層用水洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并真空蒸發(fā)，產生308mg Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
TLC:Rf=0.46，硅膠，二氯甲烷/甲醇8/2 v/v。(b)Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2將1-羥基-苯并三唑水合物(117mg)、N-甲基嗎啉(132μl)、氯化銨(107mg)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(186mg)加入到Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(308mg)的N,N-二甲基甲酰胺(16.6ml)溶液中。反應混合物在室溫下攪拌3小時。將混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取。合并的有機層用1N鹽酸溶液、水、5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌。有機層經硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物在硅膠上(洗脫液二氯甲烷/甲醇98/2 v/v至96/4 v/v/的梯度液)色譜純化，產生Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2(117mg)。
TLC:Rf=0.14，硅膠，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(c)H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA如實施例1(h)所述，制備H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA(d)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2在0℃下，將1-羥基-苯并三唑水合物(50mg)和二環(huán)己基碳化二亞胺(60mg)加入到N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(119.6mg)的N,N-二甲基甲酰胺(2ml)溶液中。反應混合物在0℃下攪拌半小時。H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2.TFA(100mg)的N,N-二甲基甲酰胺(1ml)的溶液的pH用N,N-二異丙基乙胺調節(jié)至8，并將其加入冷溶液中。1小時后，讓混合物升至室溫并攪拌過夜。反應混合物冷卻到-20℃，過濾，并將濾液減壓濃縮。殘留物溶解于乙酸乙酯中，用5％碳酸氫鈉溶液、水、2％檸檬酸水溶液和鹽水洗滌。有機層經硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)。殘留物在硅膠上(洗脫液二氯甲烷/甲醇97/3 v/v至95/5 v/v)色譜純化，產生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NH2(93.5mg)。
TLC:Rf=0.34，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2如實施例2(g)中所述，制備N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2。
混合物用硫代硫酸鈉溶液、5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌。
TLC:Rf=0.38，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(f)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2如實施例2(h)所述制備出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2。水層直接裝填到制備HPLC DeltaPak柱，使用20％A,70％B,10％C至20％A,30％B,50％C的梯度洗脫體系，經40分鐘，流速50ml/分鐘。
(A:0.5M磷酸緩沖液pH2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)87mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NH2，產生35mgHOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2。
Massa:Cl+:478.4[M-H]+；Cl-:476.4[M-H]-；Rt(LC):21.10和21.41分鐘(非對映體混合物)；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例14HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OEt如實施例1中所述，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如實施例3(b)所述，制備出Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。(a)H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl在-20℃下，將Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(2.14g)溶解于在乙醇(100ml)中的3M鹽酸溶液中。在反應混合物在室溫下攪拌6小時之后，將其真空濃縮，給出H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(2.36g)。
TLC:Rf=0.17和Rf=0.25(非對映體混合物)，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt如實施例13(d)所述，由H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OEt.HCl(2.40g)和N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(2.38g)，但用三乙胺代替N,N-二異丙基乙胺，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt。粗制的產物在硅膠上(洗脫液庚烷/乙酸乙酯1/1 v/v至二氯甲烷/甲醇97/3 v/v至95/5 v/v的梯度)色譜純化，產生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COHCO]-OEt(1.24g)。
TLC:Rf=0.5，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt如實施例13(e)所述，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt。
TLC:Rf=0.51，硅膠，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(d)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OEt如實施例13(f)所述制備出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OEt。水層直接裝填到制備HPLC DeltaPak柱，使用20％A,80％B,0％C至20％A,54％B,26％C的梯度洗脫體系，經45分鐘，流速80ml/分鐘。
(A:0.5M磷酸緩沖液pH 2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)293mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-OEt，產生62mgHOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OEt。
Massa:ESI+:507.9[MH]+Rt(LC):26.45和27.30分鐘(非對映體混合物)20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例15HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)如實施例1所述制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。用類似于實施例13的方式，以Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OBu為原料，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)。427mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)脫保護(參見實施例13(f))，在HPLC純化后，給出105mg產物。
HPLC條件DeltaPak柱，使用20％A,80％B,0％C至20％A,45％B,35％C的梯度洗脫體系，經45分鐘，流速80ml/分鐘。
(A:0.5M磷酸緩沖液pH 2.1,B水，C乙腈/水=3/2v/v)Massa:FAB+:518.3[M+H]+；FAB-:516.2[M+H]-；Rt(LC):26.24和26.70分鐘(非對映體混合物)；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，經40分鐘。實施例16HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)根據(jù)實施例1中的步驟制備N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-甘氨酸。
類似于實施例15中描述的方式，制備N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)。401mg N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-(1-氮雜環(huán)丁烷)脫保護，在HPLC純化之后，給出107mg產物。
Massa:FAB+:546.2[M+H]-；FAB-:544.0[M+H]-；Rt(LC):35.85分鐘20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，經40分鐘。實施例17HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph如實施例1中所述，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH。如實施例3(c)所述，制備出H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe
如實施例13(d)所述，由H-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe.TFA(1.09g)和N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-OH(1.18g)，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe。粗制的產物在硅膠上(洗脫液庚烷/乙酸乙酯4/6v/v至3/7v/v)色譜純化，產生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(0.99g)。
TLC:Rf=0.5，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(b)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH向N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe(0.98g)在二噁烷/水9/1 v/v(20ml)混合物中的溶液中加入1ml 1N氫氧化鈉溶液?；旌衔锏谷肜渌校ㄟ^加入1N鹽酸溶液調節(jié)至pH2，并用乙酸乙酯萃取。合并的有機層用水洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并真空蒸發(fā)，產生1.05g N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH。
TLC:Rf=0.4，硅膠，乙酸乙酯/甲醇7/3 v/v。(c)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NHCH2Ph將1-羥基-苯并三唑水合物(150mg)、N-甲基嗎啉(150μl)、苯胺(155μl)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(190mg)加入到N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH(502mg)的N,N-二甲基甲酰胺(16.6ml)溶液中。反應混合物在室溫下攪拌17小時。將混合物倒入冷的1N鹽酸溶液中，并用乙酸乙酯萃取。合并的有機層用水、5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌。有機層經硫酸鎂干燥，過濾并蒸發(fā)，產生N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-NHCH2Ph(512.4mg)。
TLC:Rf=0.5，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NHCH2Ph如實施例13(e)所述制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[COCO]-NHCH2Ph。
TLC:Rf=0.32，硅膠，二氯甲烷/甲醇97/3 v/v。(e)HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph如實施例13(f)所述，制備出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NHCH2Ph。Rt(LC):39.05分鐘；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，經40分鐘。實施例18HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH(CH3)2類似于實施例17所述，以N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH為原料，制備出HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NH(CH3)2。Rt(LC):32.84分鐘；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B,60％C，經40分鐘。實施例19HOOC-CH2-D-Dpa-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)Boc-D-Dpa-Pro-OBzl向Boc-D-Dpa-OH(5.2g)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)的冷0℃溶液依次加入1-羥基苯并三唑(3.1g)、二環(huán)己基碳化二亞胺(3.3g)、H-Pro-OBzl.HCl(4.07g)和三乙胺(2.46ml)。混合物在0℃下攪拌1小時，然后在室溫下保持過夜。混合物冷卻到-20℃，通過過濾去除二環(huán)己基脲。蒸發(fā)濾液至干。殘留物溶解于乙酸乙酯中，依次用5％的碳酸氫鈉、水和鹽水依次洗滌，經硫酸鈉干燥，并真空濃縮。殘留物在硅膠上(洗脫液庚烷/乙酸乙酯4/6 v/v)色譜，產生Boc-D-Dpa-Pro-OBzl(8.7g)。TLC:Rf=0.95,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水520/31/18/7 v/v/v/v。(b)Boc-D-Dpa-Pro-OH將10％的炭載鈀(1g)加入Boc-D-Dpa-Pro-OBzl(7.0g)的甲醇(140ml)溶液中?；旌衔镌谑覝叵略诔合職浠?小時。鈀催化劑通過過濾去除，減壓蒸發(fā)去除溶劑，產生Boc-D-Dpa-Pro-OH(5.5g)。
TLC:Rf=0.59，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水520/31/18/7 v/v/v/v。(c)Boc-D-Dpa-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中的描述的步驟，將混合酐偶合在Boc-D-Dpa-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，產生N-Boc-D-Dpa-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(560mg)。
TLC:Rf=0.1，硅膠，甲苯/乙酸乙酯3/7 v/v。(d)H-D-Dpa-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA將N-Boc-D-Dpa-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(560mg)溶解于無水二氯甲烷(2.5ml)和三氟乙酸(2.5ml)中，并在室溫下攪拌1小時。將溶液真空濃縮，與甲苯共蒸發(fā)，產生H-D-Dpa-Pro-Lys(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(670mg)。TLC:Rf=0.51，硅膠，甲苯/乙酸乙酯1/1 v/v。(e)N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)
將H-D-Dpa-Pro-Lys(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(570mg)溶解于乙腈(10ml)中，加入溴乙酸叔丁基酯(141μl)。用N,N-二異丙基乙胺將溶液保持在pH8，在室溫下攪拌2小時。反應混合物真空濃縮，溶解于乙酸乙酯中，用水和鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，再濃縮。殘留物在硅膠上使用乙酸乙酯/甲苯1/4作洗脫液色譜，產生N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(499mg)。TLC:Rf=0.47，硅膠，二氯甲烷/甲醇96/4 v/v。(f)HOOC-CH2-D-Dpa-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的方法，進行N-(叔丁氧羰基甲基)-D-Dpa-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)的脫保護和純化。產生二種非對映體的混合物177mg。Rt(LC):32.57和33.22分鐘；20％A和80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例20HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2根據(jù)實施例1中制備二肽的方法，制備N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-甘氨酸。
用類似于實施例13中描述的方式，以Boc-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OMe為原料，制備出N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-NH2。Rt(LC):34.09分鐘；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例21HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NHCH3用類似于實施例17中描述的方式，以N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-Pro-賴氨炔基(Cbz)ψ[CHOHCO]-OH為原料，制備HOOC-CH2-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-NHCH3。Rt(LC):29.61分鐘；20％A,80％B,0％C至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例22N-Me-D-Nle-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)H-D-Nle-OMe.HCl向冷卻至-15℃的270ml甲醇中加入18.2g亞硫酰氯。隨后，讓溫度升至-10℃，保持在此溫20分鐘后，加入10g H-D-Nle-OH。溫度緩慢升高，并在回流下保持恒定5小時。產物用甲醇和乙醚在4℃下結晶，由此產生12.9g。
TLC:Rf=0.61，硅膠，正丁醇/乙酸/水10/1/3 v/v/v。(b)Boc-D-Nle-OMe將H-D-Nle-OMe.HCl(12.9g)溶解于200ml無水甲醇中，接著加入二碳酸二叔丁基酯(15.5g)和三乙胺(19.8ml)。反應在室溫下攪拌3小時，之后，混合物真空濃縮。接著，殘留物溶解于乙酸乙酯中，用水洗滌。產物在硅膠上使用庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v色譜。產量16.9g。
TLC:Rf=0.55，硅膠，庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v。(c)N-Me-Boc-D-Nle-OMe在氮氣下，將Boc-D-Nle-OMe(16.9g)溶解于20ml無水N,N-二甲基甲酰胺。接著，加入甲基碘(24.9ml)，冷卻至0℃，加入氫化鈉(3.31g,60％油分散液)，讓混合物在室溫下反應16小時?；旌衔镎婵諠饪s，溶解于乙酸乙酯中，用0.1N鹽酸、水、碳酸氫鈉(5％)和水洗滌，干燥和再濃縮。由此產生18.8g烷基化的產物。
TLC:Rf=0.56,硅膠，庚烷/乙酸乙酯3/1 v/v。(d)N-Me-Boc-D-Nle-OH將N-Me-Boc-D-Nle-OMe(18g)溶解于400ml二噁烷/水9/1(v/v)中，溶液的pH用1N NaOH調節(jié)到12。讓反應進行2小時，保持pH恒定在12。后處理步驟涉及用鹽酸酸化，用冰冷卻，加入另外的水(400ml)，用二氯甲烷萃取。有機層用鹽水洗滌，干燥，過濾和真空濃縮。由此產生18.9g。
TLC:Rf=0.26,硅膠，二氯甲烷/甲醇9/1 v/v。(e)N-Me-Boc-D-Nle-Pro-OH先由N-Me-Boc-D-Nle-OH為原料，制備N-琥珀酰亞胺酯。18g的此衍生物溶解于乙腈(250ml)，并加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(14.5g)和N-羥基-琥珀酰亞胺(HONSu)(8.7g)。反應需要在室溫下16小時，之后去除溶劑，殘留物溶解于乙酸乙酯中，用水洗滌，并干燥。由此產生24.3g粗制的ONSu酯。下一步是將脯氨酸.HCl(20.9g)溶解于300ml N,N-二甲基甲酰胺和300ml水中，pH用2NNaOH溶液調節(jié)到8。將ONSu酯(24.3g溶于300ml N,N-二甲基甲酰胺)溶液在pH為8下滴加入此溶液中。5小時后，反應完畢，之后通過真空蒸發(fā)去除大量的有機溶劑。加入另一份(300ml)水，將混合物酸化。產物用乙酸乙酯萃取，用水洗滌。在干燥后，過濾并濃縮，獲得的產物為黃色油狀物，22.2g。粗產物在硅膠上使用乙酸乙酯/甲醇8/2 v/v作洗脫液色譜。產量13.2g。
TLC:Rf=0.65,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水=163/20/6/11v/v/v/v。(f)N-Me-Boc-D-Nle-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)將N-Me-Boc-D-Nle-Pro-OH(376mg)溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中。在加入N,N-二異丙基乙胺(0.19ml)后，反應混合物放置在氮氣下，并冷卻到-20℃。隨后加入氯甲酸異丁基酯(136μl)，讓混合物在-20℃攪拌15分鐘。將H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)溶解于無水N,N-二甲基甲酰胺(3ml)中，并滴加入冷的混合酐溶液中，通過加入N,N-二異丙基乙胺，保持pH在8.5。反應混合物在-20℃下攪拌15分鐘，并在室溫下攪拌1小時。反應混合物蒸發(fā)至干。殘留物溶解于乙酸乙酯中，依次用5％碳酸氫鈉水溶液、水和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，真空濃縮。殘留物通過在硅膠上(洗脫液乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v)色譜純化，產生Boc-N-Me-D-Nle-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(408mg)。
TLC:Rf=0.21，硅膠，乙酸乙酯/庚烷1/1 v/v。(g)N-Me-D-Nle-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)描述于實施例1p中的步驟制備Boc-N-Me-D-Nle-Pro-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基)(408mg)。粗制的產物裝填到制備HPLC Deltapack C18RP柱上，使用20％A/80％B至20％A/30％B/50％C的梯度洗脫體系，經40分鐘，流速80ml/分鐘。
產生二種非對映體105mg。Rt(LC):19.17分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。110mg。Rt(LC):21.47分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例23N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH用H-D-Phe-OH為原料，根據(jù)實施例2中描述的步驟，合成N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH。(b)N-Me-D-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在N-Me-Boc-D-Phe-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)，脫保護和純化。
產生二種非對映體89mg。Rt(LC):8.45分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。63mg。Rt(LC):10.98分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。實施例24N-Me-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH用H-D-Cha-OH為原料，根據(jù)實施例3中描述的步驟，合成N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH。(b)N-Me-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在N-Me-Boc-D-Cha-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)，脫保護和純化。
產生二種非對映體140mg。Rt(LC):12.93分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。139mg。Rt(LC):14.31分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。實施例25乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)乙基SO2-D-Cha-Pro-OH用Boc-D-Cha-OH和H-Pro-OPac為原料，根據(jù)實施例6中描述的步驟，合成乙基SO2-D-Cha-Pro-OH。(b)乙基SO2-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在乙基SO2-D-Cha-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)，脫保護和純化。產生非對映體127mg。
Rt(LC):44.52分鐘和45.58分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例262-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)Boc-Asp(OMe)-OH將H-Asp(OMe)-OH(10.0g)溶解于二噁烷/水2/1(150ml)中，用冰冷卻。分批加入碳酸氫鈉(4.6g)和二碳酸二叔丁基酯(13.1g)。將混合物攪拌16小時，用碳酸氫鈉保持pH在8.5。加入水(400ml)，混合物用庚烷徹底洗滌，用冰冷卻，用1N鹽酸酸化至pH2.5，用乙酸乙酯萃取(300ml)。有機層用水和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，過濾并真空蒸發(fā)，產生Boc-Asp(OMe)-OH(10.25g)。
TLC:Rf=0.58，硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11 v/v/v/v。(b)Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl如WO 95/35312，實施例中所描述的，用N-乙基嗎啉代替N-甲基嗎啉，合成出Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl。
TLC:Rf=0.40，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(c)H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl將Boc-Asp(OMe)-Pro-OBzl(7.25g)溶解于無水乙酸乙酯(25ml)中，并用冰冷卻。加入用鹽酸(45ml)飽和的乙酸乙酯，混合物在0℃下攪拌5小時。過量的鹽酸通過氮氣流去除，所得的溶液真空濃縮，產生H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl，為白色固體(6.21g)。
TLC:Rf=0.17，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(d)2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-OBzl將H-Asp(OMe)-Pro-OBzl.HCl(6.21g)、無水二氯甲烷(10ml)和N,N-二異丙基乙胺(200μl)的溶液在0℃下加入到2-丙基戊酸酐溶液中，該2-丙基戊酸酐溶液已通過下述方法制備將2-丙基戊酸(1.63ml)溶解于無水二氯甲烷(15ml)中、在冰中冷卻，加入1,3-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.11g)、并將此溶液攪拌5分鐘?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?，通過加入N,N-二異丙基乙胺，保持pH在8.5,16小時后，加入0.5當量的2-丙基戊酸酐，并將溶液再攪拌4小時。之后通過過濾去除1,3-環(huán)己基脲。濾液真空濃縮，殘留物溶解于乙酸乙酯中。此溶液依次用1N鹽酸、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，經硫酸鈉干燥，真空濃縮。殘留物在硅膠上使用甲苯/乙酸乙酯8/2 v/v作洗脫液色譜純化，產生2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-OBzl(6.54g)。
TLC:Rf=0.65，硅膠，二氯甲烷/甲醇95/5 v/v。(e)2-丙基戊酰基-Asp(OMe)-Pro-OH將10％的炭載鈀(750mg)加入到2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-OBzl(705mg)的甲醇(10ml)溶液。混合物在室溫、常壓下氫化2小時。過濾去除鈀催化劑，減壓蒸發(fā)去除溶劑，產生2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-OH(580mg)。
TLC:Rf=0.48,硅膠，乙酸乙酯/吡啶/乙酸/水163/20/6/11v/v/v/v。(f)2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在2-丙基戊?；?Asp(OMe)-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，脫保護和純化。
產生二種非對映體的混合物186mg。Rt(LC):23.16分鐘和24.30分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。實施例271-Piq-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)1-Piq-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例8中描述的步驟，合成1-Piq-Pro-OH。(b)1-Piq-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在1-Piq-Pro-OH和和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，脫保護和純化。
產生二種非對映體92mg。Rt(LC):23.75分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。97mg。Rt(LC):25.72分鐘，20％A,80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例28HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH
根據(jù)實施例10中描述的步驟，用H-D-Cha-OH.HCl為原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH。(b)HOOC-CH2-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Cha-N-環(huán)戊基-Gly-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，脫保護和純化。
產生二種非對映體的混合物107mg。Rt(LC):20.39分鐘和20.82分鐘，20％A,60％B和20％C至100％C，經40分鐘。實施例29HOOC-CH2-D-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH根據(jù)實施例11中描述的步驟，用H-D-Phe-OH.HCl為原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH。(b)HOOC-CH2-D-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-Phe-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，脫保護和純化。
產生二種非對映體143mg。Rt(LC):24.98分鐘，20％A,80％B至和20％A,20％B和60％C，經40分鐘。
149mg。Rt(LC):26.91分鐘，20％A,80％B至和20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例30HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)(a)N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH根據(jù)實施例12中描述的步驟，用H-D-p-Cl-Phe-OH.HCl為原料，合成N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH。(b)HOOC-CH2-D-p-Cl-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)根據(jù)實施例22中描述的步驟，將混合酐偶合在N-(叔丁氧羰基甲基)-N-Boc-D-p-Cl-Phe-Pro-OH和H-賴氨炔基(Cbz)-(2-噻唑基).TFA(參見實施例1)間，脫保護和純化。
產生二種非對映體的混合物187mg。Rt(LC):28.86分鐘和30.63分鐘，20％A和80％B至20％A,20％B和60％C，經40分鐘。實施例31另外，可以用本發(fā)明的方法制備下列化合物-HOOC-CH2-D-Cha-Pec-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-Pec-賴氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-D-Cha-(N-環(huán)己基)-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-(N-環(huán)己基)-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-D-Cha-(N-環(huán)丙基)-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-HOOC-CH2-D-Cha-(N-環(huán)丙基)-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)-N-Me-D-Phe-(N-環(huán)戊基)-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-N-Me-D-Phe-(N-環(huán)戊基)-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)-2-丙基-戊酰基-Asp(OMe)-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-2-丙基-戊?；?Asp-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-2-丙基-戊?；?Asp-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)-2-羥基-3-環(huán)己基-丙酰基-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-2-羥基-3-環(huán)己基-丙?；?Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)1-Piq-(N-環(huán)戊基)-Gly-賴氨炔基ψ[COCO]-OH1-Piq-(N-環(huán)戊基)-Gly-賴氨炔基-(2-噻唑基)-二苯基丙酰基-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)-N-Me-D-Nle-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-D-Phe-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-D-Phe-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OH-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)-乙基SO2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噁唑基)-HOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基ψ[COCO]-OHHOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噻唑基)-HOOC-CH2-N(Me)-D-Cha-Pro-賴氨炔基-(2-噁唑基)實施例32抗凝血酶試驗凝血酶(凝血因子Ⅱa)是一種凝血級聯(lián)中的因子。
本發(fā)明化合物的抗凝血酶活性通過分光光度測定由凝血酶對顯色底物s-2238的水解速率來評價。此在緩沖體系中的抗凝血酶活性試驗用來評價試驗化合物的IC50值。
試驗介質緩血酸胺-NaCl-聚乙二醇6000(TNP)緩沖液。參照化合物I2581(Kabi)載體TNP緩沖液。增溶作用可以借助于二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙腈或叔丁醇，它們在終反應混合物濃度達2.5％時無不利作用。技術試劑*1．緩血酸胺-NaCl(TN)緩沖液。該緩沖液組成如下緩血酸胺(Tris)6.057g(50mmol),NaCl 5.844g(100mmol)，水至1升。溶液的pH在37℃用HCl(10mmol/l)調節(jié)至7.4。2．TNP緩沖液聚乙二醇6000溶解于TN緩沖液中，給出3g/l的濃度。3．S-2238溶液一小瓶的S-2238(25mg,Kabi Diagnostica,瑞典)溶解于20ml TN緩沖液中，給出1.25mg/ml(2mmol/l)的濃度。4．凝血酶溶液人凝血酶(16000nKat/小瓶；Centraal Laboratorium voor Bloedtransfusie，阿姆斯特丹，荷蘭)溶解于TNP緩沖液中，給出835nKat/ml的備用溶液。在使用前一刻，將此溶液用TNP緩沖液稀釋，給出3.34nKat/ml的濃度。-*所用的成分均為分析級-對于水溶液，使用超純水(Milli-Q品級)試驗和參照化合物溶液的制備試驗和參照化合物溶解于Milli-Q水中，給出10-2mol/l的備用濃度。每一種濃度再逐級用載體稀釋，給出10-3、10-4和10-5mol/l的濃度。稀釋液，包括備用溶液，用于試驗(在反應混合物中的終濃度分別為3×10-3、10-3、3×10-4、10-4、3×10-5、10-5、3×10-6和10-6mol/l)。步驟在室溫下，將0.075ml和0.025ml試驗化合物或參照化合物的溶液或載體分別移液至微量滴定板的孔中，這些溶液分別用0.115ml和0.0165mlTNP緩沖液稀釋。向每一孔中加入一等分量的0.030ml S-2238溶液，并將此滴定板在37℃下溫箱(Amersham)中預熱和振蕩下預溫育10分鐘。預溫育之后，通過向每孔中加入0.030ml凝血酶溶液來開始S-2238的水解。此滴定板在37℃下溫育(震蕩30秒鐘)。溫育1分鐘之后，使用動力學微量滴定板讀數(shù)器(Twinreader plus,Flow Laboratories)，每2分鐘測定一次每種樣品在405nm下的吸光度，持續(xù)90分鐘。
所有的數(shù)據(jù)使用LOTUS-MEASURE收集在IBM個人計算機中。對于每一化合物濃度(以mol/l反應混合物表達)和對于空白，相對于以分鐘計的反應時間畫出吸光度曲線圖。應答的評價對于每一終濃度，由試驗曲線圖計算出最大吸光率。根據(jù)Hafner等(Arzneim.-Forsch./Drug Res.1977；27(Ⅱ)；1871-3)的對數(shù)值變換，計算IC50-值(終濃度，以μmol/l表達，造成空白的最大吸光度的50％抑制)。
在下列表格中，列出本發(fā)明化合物的IC50-值
權利要求
1．一種式Ⅰ化合物
其中A是H、任選取代的D,Lα-羥基乙酰基、R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，其中R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基和(3-8C)環(huán)烷基，這些基團可任選由(3-8C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、氧代、OH、COOH、CF3或鹵素取代，和選自(6-14C)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳鏈烯基，它們中的芳基可以任選由(1-6C)烷基、(3-8C)環(huán)烷基、(1-6C)烷氧基、OH、COOH、CF3或鹵素取代；每個基團R2獨立地是H或具有與R1相同的含意；m是1、2或3；B是一個鍵，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-12C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-12C)鏈烯基)-CH2-CO-、-N((2-12C)炔基)-CH2-CO-、-N(芐基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水、堿性或中性側鏈的L-或D-氨基酸，這些氨基酸可以任選是N-(1-6C)烷基取代的；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中R3和R4獨立地是R1、R1-O-C(O)-、R1-C(O)-、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，或R3和R4之一與R5相連與它們鍵合的“N-C”一起形成5-或6-元環(huán)，這些環(huán)可以與脂族或芳族6-元環(huán)稠合；且R5是疏水、堿性或中性側鏈；X是帶有疏水側鏈的L-氨基酸、絲氨酸、蘇氨酸、任選含有另外的選自N、O或S的雜原子和任選由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代的環(huán)狀氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片斷
其中n是2、3或4，且W是CH或N；Y是H、-CHF2、-CF3、-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-6C)烷基、-CONR7R8且R7和R8獨立地是H或(1-6C)烷基或R7和R8一起是(3-6C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑，這些雜環(huán)可任選由(1-6C)烷基、苯基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代；且r是0、1、2或3；或者其前藥或者其可藥用的鹽。
2．權利要求1的化合物，其中X是帶有疏水側鏈的L-氨基酸、絲氨酸、蘇氨酸或-NR2-CH2-C(O)-。
3．權利要求1的化合物，其中A如前面所定義；B是一個鍵，式-NH-CH[(CH2)pC(O)OH]-C(O)-的氨基酸或其酯衍生物且p是0、1、2或3,-N((1-6C)烷基)-CH2-CO-、-N((2-6C)鏈烯基)-CH2-CO-、-N(芐基)-CH2-CO-、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸，這些氨基酸可以任選由N-(1-6C)烷基取代；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-；且X是任選含有另外的選自N、O或S的雜原子和任選由(1-6C)烷基、(1-6C)烷氧基、芐氧基或氧代取代的環(huán)狀氨基酸，或X是-NR2-CH2-C(O)-或片斷
4．權利要求3的化合物，其中A是H、2-羥基-3-環(huán)己基-丙酰基-、9-羥基-芴-9-羧基、R1、R1-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-SO2-、R2OOC-(CHR2)m-、H2NCO-(CHR2)m-、或N-保護基團，其中R1選自(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(6-14)芳基、(7-15C)芳烷基和(8-16C)芳鏈烯基；每個基團R2獨立地是H或具有與R1相同的含意；B是一個鍵，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸，這些氨基酸可以任選是N-(1-6C)烷基取代的；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-；Y是-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6、-CONR7R8，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-噻唑啉、2-苯并噻唑、2-噁唑、2-噁唑啉和2-苯并噁唑。
5．權利要求4的化合物，其中A是H、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；B是一個鍵，D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-或R1-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基、(2-12C)鏈烯基、(2-12C)炔基、(3-8C)環(huán)烷基、(7-15C)芳烷基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-，且R5是疏水側鏈；Y是-CO-NH-(1-6C)亞烷基-C6H5、-COOR6且R6是H或(1-3C)烷基、-CONR7R8,R7和R8獨立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
6．權利要求5的化合物，其中A是R2OOC-(CHR2)m-；B是具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R2OOC-(CHR2)m-，且另一個獨立地是(1-12C)烷基、(2-6C)鏈烯基、(3-8C)環(huán)烷基、芐基、R1-SO2-或R2OOC-(CHR2)m-；和X是2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸、2-八氫吲哚羧酸或-[N(3-8C)環(huán)烷基]-CH2-C(O)-。
7．權利要求6的化合物，其中A是HOOC-CH2-；B是D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是HOOC-CH2-，另一個獨立地是(1-4C)烷基、(1-4C)烷基-SO2-或HOOC-CH2-，且R5是(3-8C)環(huán)烷基、(3-8C)環(huán)烷基(1-4C)烷基、苯基、芐基、任選由氯或(1-4C)烷氧基取代。
8．權利要求7的化合物，其中Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
9．權利要求5的化合物，其中A是R1-SO2-；B是一個鍵、D-1-Tiq、D-3-Tiq、D-Atc、Aic、D-1-Piq、D-3-Piq或具有疏水側鏈的D-氨基酸；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是R1-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-；X是2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶酸、4-噻唑烷羧酸、3,4-脫氫-脯氨酸、2-八氫吲哚羧酸、-[N(環(huán)戊基)]-CH2-C(O)-或片斷
10．權利要求9的化合物，其中A是乙基-SO2-或芐基-SO2-；B是一個鍵、D-Phe、D-Cha、D-Coa、D-Dpa、p-Cl-D-Phe、p-OMethyl-D-Phe、p-OEthyl-D-Phe、D-Nle、m-Cl-D-Phe、3,4-二-OMe-D-Phe、D-Chg；或A與B一起是殘基R3R4N-CHR5-C(O)-，其中至少R3和R4之一是乙基-SO2-或芐基-SO2-，另一個獨立地是(1-12C)烷基或R1-SO2-，且R5是(3-8C)環(huán)烷基、(3-8C)環(huán)烷基(1-4C)烷基、苯基、芐基、二苯基次甲基，這些基團任選由氯或(1-4C)烷氧基取代。
11．權利要求10的化合物，其中Y是-CO-NH-CH2-C6H5、-CO-NH-CH2CH2-C6H5或-CONR7R8,R7和R8獨立地是H或(1-3C)烷基或R7和R8一起是(3-5C)亞烷基，或Y是選自下列的雜環(huán)2-噻唑、2-苯并噻唑、2-噁唑或2-苯并噁唑。
12．權利要求1至11中任一項的化合物，其中r是1。
13．一種藥物組合物，它包含權利要求1至12中任一項的化合物和可藥用的載體。
14．用于治療的權利要求1至12中任一項的化合物。
15．權利要求1至12中任一項的化合物用于生產用于治療或防止凝血酶相關疾病的藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(Ⅰ)的化合物,其中A、B、X、Y和r如說明書中所定義,或其前藥或其可藥用的鹽。本發(fā)明的化合物具有抗凝血活性,且可以用于治療或防止與凝血酶相關的疾病。
文檔編號A61K38/05GK1212704SQ97192682
公開日1999年3月31日 申請日期1997年2月26日 優(yōu)先權日1996年3月1日
發(fā)明者A·E·P·阿丹 申請人:阿克佐諾貝爾公司