專利名稱：杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域,涉及以杠板歸polygonum perfolatum L.的全草為原料，制備杠板歸提取物，以及該提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化并不是獨立的疾病，而是肝臟受到炎癥損害的一種表現(xiàn)狀態(tài)，是由肝炎發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段。因此阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，對防治肝硬化和肝癌具有重要意義。肝纖維化的治療方法有很多，比如西藥，雖然西藥治療肝纖維化的速度快，但是容易給肝臟造成負擔，治標不治本。近年來，國內(nèi)外大量研究表明中藥在治療肝纖維化方面顯示出顯著療效，因此采用從中藥中提取開發(fā)抗肝纖維化的藥物具有重要意義。中藥杠板歸系寥科寥屬植物杠板歸polygonum perfolatum L.的全草，又名貫葉寥、河白草、蛇見退等，全國均有分布。據(jù)古代中草藥和民間藥方記載，杠板歸用途十分廣泛，常用來治療癤腫、乳腺炎、百日咳、灣痢、黃疸、腎炎水腫、跌打腫痛、吐血便血、慢性濕疹、毒蛇咬傷等疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杠板歸具有抗菌、抗病毒、抗誘變、降血壓、抗腫瘤、止血等作用。至今，已公開的與杠板歸有關(guān)的文章有60多篇，但以中藥杠板歸提取物在制備抗肝纖維化的藥物中的應(yīng)用，以及對該藥物進行抗肝纖維化動物實驗的方法和結(jié)果，則未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供中藥杠板歸提取物在抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種杠板歸提取物的新用途，用于抗肝纖維化，即是將從杠板歸中提取出的杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液等劑型以治療肝纖維化疾病，其使用劑量為以60kg成人計，杠板歸提取物每日總攝取量不少于0. 36g。本發(fā)明所述的杠板歸提取物通過采用現(xiàn)有制備工藝制備將杠板歸全草陰干粉碎，得到粗粉，用70 % 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附，用70 %乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏或稠
膏即可。本發(fā)明的積極效果是提供一種高效低毒、副作用小、藥源廣的治療肝纖維化疾病的新藥。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步的說明，但不是對本發(fā)明的限定。實施例一、杠板歸提取物的制備I、將新鮮采集的杠板歸全草陰干粉碎，得到杠板歸粗粉，用20倍量70%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小時，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附12h，用70%乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏。稀膏中藥材濃縮液=3:1，ff/Vo2、將新鮮采集的杠板歸全草陰干粉碎，得到杠板歸粗粉，用20倍量85%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小時，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附12h，用70 %乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稠膏，稠膏烘干，打成80目細粉。稠膏中藥材濃縮液=5:1,W/V。二、將杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液劑型
I、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物干膏細粉，約重24g，加淀粉至總量133g，制粒，壓成片劑，素片重0. 5g，每片含杠板歸提取物0. 09g。成人每天I次，一次4片。所述片劑藥物中每片杠板歸提取物百分含量為0. 18%，余量為藥劑成型輔料。2、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物干膏細粉，約重24g,加鹿糖粉與糊精的混合物至總量330g,制粒,得顆粒劑,分裝,每小包5g,每小包含杠板歸提取物0. 36g。成人每天I次，一次I包。所述顆粒劑藥物中每粒杠板歸提取物百分含量為0. 072%，余量為藥劑成型輔料。3、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物稀膏，體積335ml，加白砂糖300g,食用白酒50mL,加熱溶解,最后加水到660ml,過濾,得口服液,分裝，每支10ml，每支含杠板歸提取物0. 36g。成人每天I次，一次I支。所述口服液藥物中每支杠板歸提取物百分含量0. 036%，余量為藥劑成型輔料。三、本發(fā)明的杠板歸提取物抗肝纖維化藥效學(xué)實驗。I、材料I. I 動物SPF級SD大鼠80只，體重175_225g，雌雄各半，由桂林醫(yī)學(xué)院SPF實驗動物中心提供(許可證號SCXK2007-0001)。I. 2藥品與試劑取5000g杠板歸藥材，加20倍量70%乙醇回流提取2次，濃縮提取液，加水溶解，SAB-S大孔樹脂柱，得供試藥品，得率2. 40%，由桂林醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供；質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C)試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所；二甲基亞硝胺(DMN，純度99%)，購于天津市化學(xué)試劑研究所；秋水仙堿粉劑，serva公司產(chǎn)品；兔抗鼠TGF- P :多克隆抗體(1:100稀釋)，購于武漢博士德有限公司。I. 3 儀器TLL-C臺式冷凍離心機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TSN_695B型放免測量儀，上海日環(huán)儀器一廠；AU600全自動生化檢測儀,奧林巴斯生產(chǎn)；752型分光光度計,上海第三分析儀器廠；01ymPus BX51顯微鏡,奧林巴斯生產(chǎn)；BS1105電子天平,德國sartorius公司。2、方法2. I分組和給藥80只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、杠板歸高劑量組、中、低劑量組和秋水仙堿組共6組，每組15只，雌雄各半。除正常對照組以外，其余各組大鼠均以0. 5% DMN溶液(I. 6mL. kg—1)腹腔注射，每周連續(xù)3天，每天I次，第I周用2/3劑量，以后用全量。秋水仙堿組劑量為0. lmg. kg'杠板歸高、中、低劑量組分別為7. 5，5. 0，2. 5g. kg_\除空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水外，各組均灌胃給藥，I次/d，連續(xù)4周。4周末摘大鼠眼球取血，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C);免疫組化檢測轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-^1)02. 2檢測指標嚴格按照試劑盒的要求規(guī)范操作，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C);取肝組織，做病理切片，HE染色，觀察HF的形成；免疫組化檢測轉(zhuǎn)化生長因子P 以大鼠肝組織TG F-P1陽性表達密度(面積)計算。依據(jù)2000年西安全國肝病會議通過的標準，將肝炎病變依纖維化程度分為4期，見表I。表I纖維化程度分期標準
Im 纖維化程度
b0無
SI匯管區(qū)纖維化擴大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化S2匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留
53纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化
54早期肝硬化2. 3數(shù)據(jù)處理各組實驗數(shù)據(jù)均以T 土 s表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 13. 0進行方差分析，P < 0. 05有統(tǒng)計學(xué)意義。3、結(jié)果3. I藥物對肝纖維化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影響模型組大鼠血清中HA，LN, PC III，IV -C水平明顯高于正常組，具有顯著性差異(均p〈0. 01)，說明造模成功；杠板歸高、中劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中HA，LN, PCIII，IV -C水平均明顯低于模型組，具有顯著性差異(P〈0. 05或p〈0. 01);杠板歸低劑量組大鼠血清中HA, PC III，IV -C水平與模型組比較，無顯著性差異(p>0. 05)，見表2。表2杠板歸對DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影響(7士s)組別 N 劑量/呵.kg '~HA/ng, L—1LNTTgT1PCIII/ u g, L—1 IV-C/ u g. L—1 ~
正常 15二97.55 + 12.89^ 70.99±77. W 50.23+15.35n 31.66+6.1121
模型 8- 389.37. ±1UU 0 281.25土45. 17 72.14±27.98 138.00±22. 38
75. 30 + 22. 87
IRIl 10 0.1 192. 35±98. 31 =) 128. 65± 87 . 792 ) 52. 13± 12. 11
2、
高劑量 11 7500 165. 69±81.01 —’ 123. M±44. 35 2; 53. 91±22. Ol2' 70. 54±65. 33中劑量 11 5000 188.96±65.25 :) 120.68±13.2,i58. 20±46.31° 80. 12±23.39::)低劑量 9 2500 368. 12±55.64 151. 29土 11. 35” 70. 56±61.54 118. 20土 17. 31注與模型組比較DpCO. 05，2)p〈0. 01。3. 2病理形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)與正常組相比，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，小葉內(nèi)肝細胞廣泛水腫，可見大量脂質(zhì)空泡形成；匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞大量增生，膠原纖維形成，形成粗大的纖維間隔，并將增生的肝細胞團分隔成大小不等的假小葉，提示造模成功。與模型組比較，杠板歸高、中劑量組、秋水仙堿組大鼠肝臟炎癥程度和纖維化程度均明顯降低，尤其杠板歸高、中劑量組肝組織病變改善效果更為明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，極少有假小葉形成，膠原沉積明顯減少。3. 3肝組織TGF- ^ :表達正常組僅見于匯管區(qū)、肝竇內(nèi)皮細胞、中央靜脈周圍細胞且著色較淺，范圍較窄；模型組中主要表達于匯管區(qū)周圍細胞、竇內(nèi)皮細胞、中央靜脈周圍細胞、部分肝細胞及纖維間隔內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀，范圍廣；杠板歸高、中劑量組、秋水仙堿組陽性表達明顯下降，多見于中央靜脈周圍細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、匯管周圍細胞；杠板歸低劑量組中表達于匯管區(qū)周圍細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、中央靜脈周圍細胞、部分肝細胞及纖維間隔內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀，范圍廣(p〈0. 05或p〈0. 01);杠板歸低劑量組TGF-P丨表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0. 05)。見表3。表3杠板歸對大鼠肝纖維化模型TGF- ^ :表達的影響SDN 劑量/mg. kg'TGF-1面密度
正常組15二0.025 ±0.004 ~
模型組8-0.201 ±0.083
秋水仙堿組100. I0.059±0.0172)
杠板歸高劑量組1175000. 055±30. 068
杠板歸中劑量組1150000.088±0.052 a 杠板歸低劑量組925000. 151 ±0.092注與模型組比較DpCO. 05,2)p<0. 01。將大鼠肝組織病理結(jié)果分級，經(jīng)秩和檢驗，與模型對照組比較，秋水仙堿組和杠板歸高、中劑量組均存在統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05或P < 0. 01)，見表4。表4肝纖維化大鼠病理檢查結(jié)果
組別(n)劑量/mg. kg 1 b b^Fi5
正常(15)115~0 0 0 0 <0.01 ~
模型(8)-0 0 1 3 4 -
r^co1 秋水仙堿(10) 0. I2 7 I 0 0 <0.01
L0053」
杠扳歸(11)7o0018200<0.01
CiI J5000154 I0<0.01
(y)250000234>0.05 綜上所述，本發(fā)明首次對杠板歸提取物進行了抗肝纖維化的研究，通過動物實驗表明，杠板歸提取物具有較好的的抗肝纖維化的藥理作用，作用機制與杠板歸通過保肝，降低TGF-P i表達從而抑制肝纖維化的啟動密切相關(guān)?？捎糜谥苽淦瑒?、口服液、顆粒劑等劑型的治療肝纖維化的中藥制劑。
權(quán)利要求
1.杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征是所述杠板歸提取物是通過將杠板歸全草陰干粉碎，得到粗粉，用70% 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附，用70%乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏或稠膏制備得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征是將杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用，通過動物實驗表明，杠板歸提取物具有較好的抗肝纖維化的藥理作用，作用機制與杠板歸通過保肝，降低TGF-β1表達從而抑制肝纖維化的啟動密切相關(guān)，對肝纖維化有很好的抑制作用。本藥高效低毒，副作用小，藥源廣，開發(fā)成本低。
文檔編號A61P1/16GK102764306SQ20121029015
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者張可鋒, 段小群, 高雅 申請人:桂林醫(yī)學(xué)院