專利名稱：一種新型的人源化抗cd22抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種新型的人源化抗⑶22抗體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)是一組起源于淋巴結(jié)和其他淋巴組織的惡性腫瘤,是淋巴瘤的一大類型(除霍奇金淋巴瘤以外)。主要臨床表現(xiàn)可歸納如下:1、淺表淋巴結(jié)腫大或形成結(jié)節(jié)腫塊；2、體內(nèi)深部淋巴結(jié)腫塊；3、結(jié)外淋巴組織的增生和腫塊；4、全身癥狀，包括發(fā)熱、盜汗、乏力和體重減輕。在美國(guó)該病是增長(zhǎng)第二快的癌癥，以每年新增約55，000例的速度增加。近年來(lái)，我國(guó)惡性淋巴瘤發(fā)病率上升加快，已進(jìn)入十大高發(fā)腫瘤行列，我國(guó)NHL的發(fā)病率從上個(gè)世紀(jì)的2/10萬(wàn)已快速上升至7/10萬(wàn)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種彌漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)還可以累及肺、心臟、血液等多個(gè)器官和系統(tǒng)，有多種臨床表現(xiàn)；血清中可以檢測(cè)到自身抗體和免疫學(xué)異常。全球SLE患病率為48/10萬(wàn)-117/10萬(wàn)，發(fā)病率達(dá)1.5/10萬(wàn)-7.6/10萬(wàn)；多發(fā)生于20 40歲的育齡女性，男女發(fā)病率之比約為1: 7 1: 10，其高患病率、高病死率嚴(yán)重威脅著各國(guó)人群的身心健康。過(guò)去幾十年里，非霍奇金淋巴瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的主要治療方法為放療和化療，然而單克隆抗體藥物的開發(fā)為我們提供了新的治療方案，可以使病人有效避免對(duì)放療化療的依賴和毒副作用。美國(guó)FDA批準(zhǔn)抗⑶20抗體美羅華(Rituximab)上市是一個(gè)歷史性的里程碑。盡管美羅華對(duì)NHL有效且毒性可以控制，但不是所有的病人都對(duì)它有治療反應(yīng)，其實(shí)每一個(gè)有治療反應(yīng)的病人最后部會(huì)復(fù)發(fā)，然而美羅華鼓勵(lì)研究者們?nèi)ふ倚碌陌悬c(diǎn)(路萍萍等，中國(guó)實(shí)驗(yàn)而液學(xué)雜志，2006 ；14(6):1258-1261)，這些靶點(diǎn)的表達(dá)方式和生理特點(diǎn)與CD20不同 ，但是可能比美羅華更有效或能夠治療美羅華無(wú)效的B細(xì)胞淋巴瘤病人。⑶22抗原是眾多淋巴細(xì)胞表面靶點(diǎn)中的一個(gè)，大約60-80%的B細(xì)胞惡性腫瘤表達(dá)CD22，由此使其成為被動(dòng)免疫療法的潛在靶標(biāo)(Cesano，A.，Gayko, U.(2003) Semin.0ncol.30:253-257)。⑶22抗原，又稱唾液酸結(jié)合的免疫球蛋白樣凝集素2 (SIGLEC2)，是一種B細(xì)胞的II型跨膜糖蛋白，存在α，β兩種不同的亞型，分子量約為140KD左右。⑶22的胞外區(qū)由7個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，其N端結(jié)構(gòu)域?yàn)閂-免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與a 2，6Sia配體相結(jié)合；從功能角度講也是免疫球蛋白超家族的一員，限制性表達(dá)于成熟B細(xì)胞和大多數(shù)B細(xì)胞NHL的表面，與B細(xì)胞的發(fā)展、分化和功能有著密切的關(guān)系。⑶22分子的生物學(xué)功能是通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對(duì)B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的抑制性調(diào)節(jié)，直接參與B細(xì)胞向骨髓的歸巢等方面來(lái)達(dá)到抗瘤效果。其特點(diǎn)為減弱免疫源性和加強(qiáng)效應(yīng)因子的相互作用。經(jīng)過(guò)近20年的艱苦努力，抗⑶22抗體治療NHL已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。
目前,處于臨床研究階段的以⑶22抗原為祀點(diǎn)的抗體藥物有:Immunomedics公司
的人源化抗體-依帕珠單抗(Epratuzumab);惠氏的Inotuzumab ozogamicin是與化學(xué)
毒素偶聯(lián)的人源化單抗；NIH的BL22是在鼠抗體的基礎(chǔ)上融合了 PE38的免疫毒素；以及深圳龍瑞藥業(yè)的SM03嵌合抗體等。Epratuzumab是人源化單克隆抗體LL2的IgGl類，直接祀向0)22抗原，能通過(guò)CD 2 2介導(dǎo)胞漿內(nèi)相應(yīng)蛋白磷酸化，促進(jìn)Ra j i細(xì)胞系凋亡，抑制其分化，從而達(dá)到治療Burkitt' s淋巴瘤的目的。Inotuzumab Ozogamicin(CMC-544)是一種抗體革巴向化療劑，由人源化抗⑶22抗體共價(jià)連接腫瘤抗生素calicheamicin(烯二炔類高效抗腫瘤抗生素)組成，是一種強(qiáng)效細(xì)胞毒性劑，可有效對(duì)抗CD22B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤，主要不良反應(yīng)為可逆性血小板減少。BL22 (RFB4 (dsFv)-PE38)是重組免疫毒素。BL22為RFB4通過(guò)半胱氨酸殘基的二硫鍵與可變區(qū)重鏈的連接物，再與PE38融合成為RFB4(dsFv)-PE38。BL22是第一個(gè)在嘌呤同系物抑制的毛細(xì)胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)病人中產(chǎn)生高完全反應(yīng)率的免疫毒素。Kreitman等研究HCL病人的臨床I期實(shí)驗(yàn)證明BL22是可以耐受和高度有效的。雖然HCL對(duì)BL22產(chǎn)生完全反應(yīng)，但BL22對(duì)⑶22抗原表達(dá)低的病人療效較低。研究者希望在補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)發(fā)生突變以增加抗體親和能力和療效，但沒有成功。SM03嵌合抗體是分別克隆鼠抗人CD22單抗輕/重鏈可變區(qū)基因VL/VH，構(gòu)建重組SM03嵌合抗體。SM03嵌合抗體特異于B細(xì)胞CD22抗原，對(duì)惡性淋巴瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，為惡性B細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，研制出一種新型的人源化抗CD22單抗。以鼠源RFB4為親本抗體，采用CDR移植技術(shù)對(duì)其進(jìn)行人源化，將親本抗體的CDR區(qū)移植到人IgGl中，并應(yīng)用計(jì)算機(jī)大分子模擬技術(shù)對(duì) 人源化后的CD22抗體的蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析，最終確定進(jìn)行突變的6個(gè)氨基酸位點(diǎn)，如序列中斜體字部分所示，通過(guò)合成兼并性引物的方法，構(gòu)建包含64種多態(tài)性的人源化抗體hRFB4噬菌體抗體庫(kù)。對(duì)該噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行展示并篩選出5種親和力較高的抗體DNA序列，并根據(jù)核苷酸序列翻譯得到相應(yīng)的氨基酸序列。通過(guò)序列分析比較發(fā)現(xiàn)這5個(gè)人源化hRFB4抗體的基因序列分別在4個(gè)不同的氨基酸位點(diǎn)存在差異，但是它們都可以與CD22抗原結(jié)合，表現(xiàn)出較高的抗體親和力，具有相似的生物學(xué)功能。將5個(gè)人源化的⑶22抗體——hRFB4,分別命名為YQ22-1至YQ22-5，五個(gè)抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列均為SEQ ID NO:1，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:2，3，4，5，6所示，具體如下:YQ22-1:vh:evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs ^ydmsI'
WVRQAPGKGLEffVS IyISSGGGTTYYPDTVKGI RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
JhSC^Iygssygvlf^1 Wgqgtlytyss [seq id no:i]Vl:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINC ![RasqdiSNYLNI WYQQKPGKAPKLLIY @|TSILHS|<GVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYFC jQQGNTLPWlI FGQGT [SEQ ID NO:2]
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合人CD22的單克隆抗體，由可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成，可變區(qū)包含鼠源的CDR和人源的框架區(qū)，其特征在于，所述抗體的重鏈可變區(qū)如SEQ ID NO:1組成，所述抗體的輕鏈可變區(qū)分別由SEQ ID NO:2，3，4，5，6組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區(qū)為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區(qū)為人IgGl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的抗體是CDR移植的人源化抗體。
5.多核苷酸序列，其編碼如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
6.—種表達(dá)載體,所述載體包含權(quán)利要求5所述的多核苷酸序列，所述的載體是PCDNA3.1。
7.—種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞經(jīng)由權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)染而來(lái)。
8.一種制備權(quán)利要求1_3、4所述單克隆抗體的制備方法，所述方法包括:使用編碼所述單克隆抗體的DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，獲得含有所述抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并經(jīng)Protien A柱純化制備目的蛋白。
9.權(quán)利要求1_3、4中任一項(xiàng)的單克隆抗體用于制備治療由表達(dá)CD22的細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的單克隆抗體的用途，所述的疾病是惡性淋巴瘤和自身免疫性疾病，具體指非霍奇金淋巴瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，更具體的涉及一種新型的人源化抗CD22抗體。本發(fā)明以鼠源抗體RFB4為親本抗體，采用CDR移植技術(shù)進(jìn)行人源化，人源化后的新抗體hRFB4具有與親本抗體相近的親和力，同時(shí)保持了親本抗體與CD22抗原的結(jié)合能力，以及抗體引起的抗原抗體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化活性。與親本抗體比較，人源化hRFB4抗體中人源蛋白序列比例達(dá)到90％以上，大大降低了免疫原性，避免了HAMA反應(yīng)的發(fā)生。
文檔編號(hào)A61P37/02GK103214578SQ20131017000
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者尹琪, 王康, 郭晶晶, 高震, 孟艷敏, 劉志剛 申請(qǐng)人:北京東方百泰生物科技有限公司