專利名稱：一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
養(yǎng)陰降糖片記載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-0984-91，由黃芪250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g 、知母110g、牡丹皮110g、川彎145g、虎杖180g、五味子70g作為原料藥制成,能養(yǎng)陰益氣,清熱活血。用于糖尿病?，F(xiàn)有技術(shù)中，尚未有養(yǎng)陰降糖片在提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報道，而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種養(yǎng)陰降糖片在制備抑制人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過如下的方案實現(xiàn)的—種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，由黃苗250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川彎145g、虎杖180g、五味子70g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取川芎，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，C02流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。上述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。上述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。上述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥· min,萃取時間 160min。 上述養(yǎng)陰降糖片在制備抑制人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)中，養(yǎng)陰降糖片每片0.5g，每次8片，一日3次，采用本發(fā)明制備成的養(yǎng)陰降糖片每片0. 5g，每次僅需4片，一日服用3次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過下述試驗證明。試驗一、不同方法制備的養(yǎng)陰降糖片中丹皮酚含量的比較
1、儀器及試藥本發(fā)明養(yǎng)陰降糖片按實施例3方法制備，使用1665g原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。原養(yǎng)陰降糖片，按部頒標(biāo)準(zhǔn)方法制備，使用1665g原料藥，經(jīng)提取制成1000片，每片重O. 5g。Agilent 1200高效液相色譜儀；METTLERAE240電子分析天平；丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所)。2、方法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數(shù)按丹皮酚峰計算，應(yīng)不低于3000。對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的丹皮酚對照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。供試品溶液的制備取本發(fā)明養(yǎng)陰降糖片和原養(yǎng)陰降糖片，研細(xì)，混勻，取lg，精密稱定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，即得。3、結(jié)果結(jié)果表明，本發(fā)明養(yǎng)陰降糖片中丹皮酚的含量為1.24mg/片；而原養(yǎng)陰降糖片中丹皮酚的含量為O. 18mg/片，在服用量減少的情況下，丹皮酚含量有很大提高。上述研究表明，采用本發(fā)明制備的養(yǎng)陰降糖片，有效成分含量高于部頒標(biāo)準(zhǔn)法制備的養(yǎng)陰降糖片。
具體實施例方式以下通過實施例形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1取黃芪250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，將川芎，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥·π η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。經(jīng)檢測，成品中丹皮酚的含量為1. 29mg/片。實施例2取黃芪250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，將川芎，加入到CO2超臨界萃取器·中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥·π η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，力口入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重O. 5g。經(jīng)檢測，成品中丹皮酚的含量為1. 37mg/片。實施例3
取黃芪250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，將川芎，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，CCV流量2ml/g生藥·π η，萃取時間160min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，力口入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。經(jīng)檢測，成品中丹皮酚的含量為1. 24mg/片。實施例4 :養(yǎng)陰降糖片抑制HL-60細(xì)胞增殖的實驗研究資料I實驗材料1.1實驗用細(xì)胞株人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞，南京正寬醫(yī)藥科技有限公司實驗室細(xì)胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。1. 2實驗藥物研究藥物本發(fā)明養(yǎng)陰降糖片按實施例3方法制備。藥液儲液稱取IOOmg養(yǎng)陰降糖片，溶于5ml無水乙醇中，0. 2 μ m濾器過濾，500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時0. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。1. 3實驗試劑DMEM (GIBC0 公司 Cat. No. 12100_061Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419)；NaHC03 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810_033Lot.No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10);Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0 公司批號2010242);Str 印 tomycin Su I fat e( AMRE SCO公司批號2010382);無水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司批號080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ;PBS (實驗室自配)；1. 4實驗器材萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型號SPECTRAMAX 190) ;C02培養(yǎng)箱(FORMA型號3111);超凈臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S);全自動高壓滅菌鍋(日本SANK)公司型號MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號DHG9123A);冰箱(西門子公司型號KG18V21TI);液氮罐(CBS型號2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號SLGP033RB) ;10cm培養(yǎng)皿(NEST公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
2實驗方法I) HL-60 細(xì)胞用 DMEM+10%FBS 于 37 °C、5%C02 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm 培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml O. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X 104個/ml。2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ I,培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 °C，5%C02 )常規(guī)培養(yǎng)。3)根據(jù)細(xì)胞生長情況，一般長至50%_70%，加入養(yǎng)陰降糖片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖 床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。6)同時設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個復(fù)孔。7)結(jié)果以藥物對細(xì)胞的抑制率表示細(xì)胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復(fù)3次。3統(tǒng)計處理采用Microsoft Excel 2003軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)以mean + S. D.表不。4實驗結(jié)果MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時，對HL-60細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0· 001)。表I養(yǎng)陰降糖片對HL-60細(xì)胞增殖抑制影響研充(X士SD)
illil藥.1' mg··'ml >WM τ:
照il丨υ
Iri；ili, S± 1:1
U]<；!*JH.1!, s [*
/<15H::t Hi +
I3-1ti IT,注與對照組比較，*Ρ〈0·01 ;#Ρ〈0· 0015實驗結(jié)論養(yǎng)陰降糖片可以抑制HL-60細(xì)胞增殖，減少HL-60細(xì)胞的細(xì)胞生長數(shù)目，該作用呈劑量依賴性。
權(quán)利要求
1.一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，由黃苗250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川彎145g、虎杖180g、五味子70g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取川芎，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥· min，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成1000片，每片重0. 5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率500W,每次萃取6分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種養(yǎng)陰降糖片在制備抑制人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種養(yǎng)陰降糖片的制備方法，由黃芪250g、黨參110g、葛根145g、枸杞子110g、玄參145g、玉竹110g、地黃180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得丹皮酚含量有很大提高，本發(fā)明還提供了養(yǎng)陰降糖片在制備抑制人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K9/20GK102988748SQ20121037695
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:卞毓平