專利名稱：一種黃斑藍子魚l-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基 因全序列及其用途
背景技術(shù)：
隨著海水漁業(yè)集約化養(yǎng)殖程度逐漸提高，養(yǎng)殖密度增大，養(yǎng)殖環(huán)境逐漸惡化，導致 病害日益嚴重?？股睾瓦`禁藥品的大量使用，這給食品安全造成嚴重威脅，因此開發(fā)新型 藥物迫在眉睫。黃斑藍子魚(Siganus oramin)屬于鱸形目(Perciformes)、刺尾魚亞目 (Acanthuroidei)、藍子魚科(Siganidae)、藍子魚屬(Siganus)，是近海暖水性小型魚類。 它適宜生長的水溫和鹽度較廣，在我國東南沿海數(shù)量較多。本發(fā)明從黃斑藍子魚血清中分離純化得到一種對多種病原具有抗性和殺滅作用 的活性蛋白。通過對該活性蛋白N端測序，質(zhì)譜測序分析，設計兼并引物進行PCR，利用RACE 技術(shù)最終獲得了該活性蛋白基因的全長序列，并確認該活性蛋白是一種黃斑藍子魚L-氨
基酸氧化酶。L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一種以FAD為輔基的黃素蛋白酶，在有氧條件下，其能 催化L-氨基酸的氧化脫氨反應，產(chǎn)生相應的α-酮酸、氨和H202。LAAO在生物體內(nèi)有廣泛 的分布(如細菌、真菌、藻類、動植物體內(nèi))并可參與L-氨基酸的代謝過程。該酶在細胞凋 亡、細胞毒性、浮腫、溶血、出血、血小板凝集、殺寄生蟲和抗微生物等方面都具有活性。該 蛋白家族中的蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAO)在蝰科、響尾蛇科及眼鏡蛇科中具有廣泛分 布，并因其含量高、酶活性強、易于純化，成為該類酶中研究最多的一類。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因全序列(見實施例一)和 該L-氨基酸氧化酶的用途(見實施例二)。本發(fā)明提供上述黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因序列全長，該基因全序列長度 為172^p，開放閱讀框長度為1584bp，其具體位置在43-16 區(qū)域，編碼527個氨基酸(見 實施例一)。本發(fā)明從黃斑藍子魚血清中分離純化得到該L-氨基酸氧化酶，通過試驗證明，該 純化的L-氨基酸氧化酶對刺激隱核蟲具有殺滅作用，對代表性革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄 球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有殺菌作用(見實施例二)。本發(fā)明還提供上述的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因序列的克隆方法，其特征 在于獲得該黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶ORF的核苷酸序列，所設計的特異性引物序列見實 施例三。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
具體實施例方式實施例一黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因全序列本發(fā)明人從黃斑藍子魚血清中分離純化得到該活性蛋白，測定該活性蛋白N端15 個氨基酸的序列，同時進行了質(zhì)譜測序分析，根據(jù)N端和質(zhì)譜測序結(jié)果設計兼并引物，獲得 該活性蛋白基因的部分序列，根據(jù)獲得的該活性蛋白的部分序列，利用RACE技術(shù)，獲得了 該活性蛋白基因全長序列，通過Blast分析確認該活性蛋白為L-氨基酸氧化酶。黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因序列全長為172^p，開放閱讀框(ORF)長度為 1584bp，其具體位置在43-1626區(qū)域，編碼527個氨基酸的蛋白，結(jié)果見圖1。實施例二 黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的殺蟲和殺菌功能驗證以及最小作用濃 度測定本發(fā)明人采用硫酸銨沉淀，陽離子交換層析，反相高效液相色譜，二次反相高效液 相色譜，得到了黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶，該純化的L-氨基酸氧化酶對刺激隱核蟲具有 殺滅作用，對代表性革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有 殺菌作用，本發(fā)明人對純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶進行了殺蟲和殺菌最小蛋白濃 度測定。1.黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶殺蟲功能驗證以及殺蟲最小蛋白濃度的測定將純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶對刺激隱核蟲的殺滅作用，進行了激光共 聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見圖2。參照Bradford protein Quantitation Reagent (上海博彩生物科技有限公司， K4000)試劑盒的操作說明進行。分光光度計測量OD595值，繪制標準曲線并推導方程，計算 目的蛋白的濃度。采用阻動試驗的方法，在96孔組織培養(yǎng)板中，每孔先加入100 μ L滅菌海 水，然后于第一孔加入100 μ L純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶蛋白樣品，混勻，再從中 吸取100 μ L加入第2孔，混勻后再從中吸取100 μ L加入第3孔，依此類推，以連續(xù)2倍數(shù) 稀釋純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶蛋白樣品。最后每孔同時加入IOOyL幼蟲液(含 200個活躍的幼蟲)，室溫孵育Ih后，用倒置顯微鏡(Olympus 1X70)觀察，結(jié)果表明，純化 蛋白對于刺激隱核蟲的最小殺蟲濃度為0. 088mg/mL。2.黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶殺菌功能驗證以及殺菌最小蛋白濃度測定利用生物自顯影方法對所純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶對代表性革蘭氏陽 性菌和革蘭氏陰性菌的作用效果進行驗證。將所純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶蛋白 樣品進行非變性蛋白凝膠電泳，將電泳結(jié)束后的凝膠放入含有TritonX-100(V/V)的 PBS溶液中溫和搖動20min，棄去TritonX-100 (v/v) PBS溶液，水洗2次，以0. lmol/LpH7. 2 磷酸緩沖液平衡30min，棄去緩沖液。取LB固體培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至45°C左右，加入新 培養(yǎng)至指數(shù)期的指示菌Escherichiacoli或Maphylococcus aureus (終濃度約IO6CFU/ mL)，搖勻后平鋪于一次性無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基完全凝固后將蛋白凝膠平鋪于培養(yǎng)基表 面，除去中間的氣泡，置37°C培養(yǎng)過夜，觀察抑菌結(jié)果，直接拍照，結(jié)果見圖3。采用梯度稀釋的方法測定純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶對金黃色葡萄球菌 和大腸桿菌的最小殺菌濃度。實驗于96孔培養(yǎng)板內(nèi)進行，將純化的黃斑藍子魚L-氨基 酸氧化酶蛋白樣品溶于無菌生理鹽水，并作梯度二倍稀釋。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的兩種細 菌分別取50 μ L加入到每個稀釋孔內(nèi)使其終濃度分別為2. 5Χ 105CFU/mL和7. 8 X IO5CFU/mL，以單純培養(yǎng)基作為空白對照，空白培養(yǎng)基中加入PBS作為陰性對照。37°C培養(yǎng)過夜， microtiter plate reader (ThermoLabsystems MuLtisKan MK3,Finland)測定 OD 值，同時 將每個孔中取出IOyL點種于空白培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，沒有長出菌落的對應樣 品的終濃度即為該樣品對該菌的最低殺菌濃度。結(jié)果表明，利用純化黃斑藍子魚L-氨基 酸氧化酶測定其對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小殺菌濃度分別為5. 493 μ g/mL和 0. 352mg/mL。實施例三編碼黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因序列的高保真克隆本發(fā)明人設計了一對特異性引物，在經(jīng)過優(yōu)化的高保真酶PCR反應體系中，以黃 斑藍子魚脾臟總cDNA為模板，可快速準確克隆出編碼黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因 序列，用于后續(xù)基因工程。1.用于擴增編碼黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因序列的特異性引物Sense Primer 5' -GGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAAC-3‘Anti-sense Primer 5' -AACAACATTGTGCTGACAGTGGC-3‘2.高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 反應體系5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ LdNTP Mixture (2. 5mM)4 μ LSense Primer1 μ LAnti-sense PrimerIyL脾臟總cDNA1 μ LPrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 5 μ LH2O32. 5 μ L總計50 μ L反應條件為98°Cfor Imin ；30 cycles of 98°C for 10s，68°C forl5s and 72°C for 3min。結(jié)果見圖4瓊脂糖凝膠電泳圖譜，將PCR產(chǎn)物回收與純化，放入_80°C冰箱 保存，用于后續(xù)基因工程。


圖1.殺滅刺激隱核蟲的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因和蛋白序列。(注 方框內(nèi)的氨基酸序列與N端測序序列和質(zhì)譜測序序列匹配，橫線區(qū)域為信號肽序列)圖2.純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶作用于刺激隱核蟲幼蟲的激光共聚焦顯 微鏡觀察。(A)未處理的正常蟲體。(B)黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶與刺激隱核蟲幼蟲 作用后顯示該蛋白主要分布在蟲體的細胞膜和細胞核膜上。(C)刺激隱核蟲幼蟲經(jīng)黃斑藍 子魚L-氨基酸氧化酶處理后導致蟲體大核破裂，核內(nèi)容物釋放并彌散分布，最終導致細胞 崩解。(Scale bar = 30 μ m)圖3.純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶蛋白樣品的生物自顯影結(jié)果。(A)純 化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶蛋白樣品經(jīng)非變性凝膠電泳后的考馬斯亮藍染色結(jié)果。 (B)純化的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶對大腸桿菌的抑菌效果。(C)純化的黃斑藍子魚 L-氨基酸氧化酶對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。圖4.采用I^rimeSTAR HS DNA Polymerase擴增PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
權(quán)利要求
1. 一種黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因全序列GACTGTAAACAGCAGGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAACCTGGGATGGATCT50GCACCGGGCACCGTGGAAATCATCTGCCGCCGCCGCCGTGCTGCTGCTTG100CTCTGTTCTCCGGTGCGGCAGCTTCCAGCGTGGAGAAAAATCTGGCCGCC150TGTCTGCGGGACAACGACTACGACCAGCTGCTGCAGACGGTGCAGGACGG200CCTCCCACACATCAACACATCCAACCACGTCGTGATCGTCGGAGCCGGCG250TGGCCGGACTGACGGCCGCCAAGCTGCTGCAAGACGCCGGGCACAGGGTC300ACCATAGTGGAGGCCAACAGTCGCATCGGTGGACGGGTGGAGACCTACAG350GAACAAAGAGGAAGGCTGGTACGCTGACCTGGGCGCCATGAGAATCCCAA400GTGACCACAGCATCTTCCGCTGGTTCGCTAAAACACTGGGCGTCAAGCTC450AACCCGTTCATCATGGACGACCACAACACGTTTTACTTTGTGAACGGGCT500GCTGAAAAGAACGTACACGGTGGAAGCCAACCCTGACATACTGAACTACA550AGGTGAGGAGCAGCGAGAAGGGAAAGTCGGCCAACACCCTCTTCCAGGAC600GCTCTGCAGAAGGTAAAAGATGAAGTGGAAGCTCACGGCTGCAGAGCTGC650GCTGATGAAATATGACAAATACTCTGCAAAGGAGTACCTGAAGGAAGTAG700CAGGTCTGAGCTCCGAGGCCCTGAGAATGATCGGAGACCTGCTCAACGAA750CAGAGTCTGATGTACACAGCGCTGAGTGAGATGATCTACGACCAGGCCGA800CGTCAACGACAACGTCCAGTACGATGAAGTGACCGGAGGAACCGACCTGT850TCCCCAGAGCATTCCTCTCCGTCCTCGACGTCCCCATTCTTCTCAACTCC900AAAGTCCAGCGCATCCGTCGCTCTAGAGACGGGGTGACCGTGTCGTTCAA950GGAGAGCCAGCGCTCCTCTCTGACGGACCTCCACGCTGACATGGTCCTGG1000TCACAACCACAGCCAAAGCAGCCCTCTACATGGACTTTGAGCCCAGTCTC1050TCGATCAGAAAGATGGAGGCCCTGAGGGCGGTCCACTACGACAGCTCCAC1100CAAAATCATCCTCACTTTCAGCAGCAGATTCTGGGAGGAGGACGGGATCC1150GAGGAGGAAAGAGCATCACGGACCGGCCCTCGCGTTACATCTACTACCCC1200AGCCACACGTTCCCCGCCAACTCCAGCGTCGGCGTCCTCCTGGCGTCCTA1250CACCTGGTCCGACGACTCCCTGCTCCTCCAGGCCGCCAGCGACGAGGAGC1300TGAAGGAGATGGCTCTGAGGGATCTGGTGAAGATCCATGGCGAGCGTGTC1350CGGGCGCTGTGCACTGGAGTGGTGGTGAAGAAGTGGAGCCTGGATCCCTA1400CAGCTTCGGCGCCTTCGCCCTCTTCACGCCGTACCAGCACCTGGAGTACG1450CCAAGGAGCTCTTCAGGAGCGAGGGCCGGGTTCACTTCGCCGGCGAACAC1500ACGGCGTTCCCTCACGCTTGGATGGAGTCGGCCATGAAGTCTGCAATCAG1550AGCCGCCACCAACATCAACAAACAGACGCTGCTCAACGAAGGAATGAACG1600AATGTCCAGCTCCAGACGAGCTGTAGAAACCAAAGAAAACCAAAGACTCA1650GAGCAGTTAGTGATTCACATGATGAACGCTGCCACTGTCAGCACAATGTT1700GTTCAATAGA ACTCACATGC ACAAA該基因序列全長包括5' UTR, 3' UTR和開放閱讀框(ORF)。
2. —種權(quán)利要求1所述的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶氨基酸序列全長MDLHRAPffKS SAAAAVLLLA LFSGAAASSV EKNLAACLRD NDYDQLLQTV 50QDGLPHINTSNHVVIVGAGVAGLTAAKLLQDAGHRVTIVE ANSRIGGRVE100TYRNKEEGffYADLGAMRIPSDHSIFRffFAKTLGVKLNPFI MDDHNTFYFV150NGLLKRTYTVEANPDILNYKVRSSEKGKSANTLFQDALQK VKDEVEAHGC200RAALMKYDKYSAKEYLKEVAGLSSEALRMI⑶LLNEQSLM YTALSEMIYD250QADVNDNVQYDEVTGGTDLFPRAFLSVLDVPILLNSKVQR IRRSRDGVTV300SFKESQRSSLTDLHADMVLVTTTAKAALYMDFEPSLSIRK MEALRAVHYD350SSTKIILTFSSRFffEEDGIRGGKSITDRPSRYIYYPSHTF PANSSVGVLL400ASYTffSDDSLLLQAASDEELKEMALRDLVKIHGERVRALC TGVVVKKffSL450DPYSFGAFALFTPYQHLEYAKELFRSEGRVHFAGEHTAFP HAWMESAMKS500AIRAATNINKQTLLNEGMNECPAPDEL
3.—種權(quán)利要求1，2所述的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因序列的克隆方法，其特征 在于獲得權(quán)利要求1，2所述的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶ORF的核苷酸序列，所設計的引 物序列如下Sense Primer 5' -GGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAAC-3‘ Anti-sense Primer 5' -AACAACATTGTGCTGACAGTGGC-3‘
4.一種權(quán)利要求1，2，3所述的黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的用途，該L-氨基酸氧化 酶從黃斑藍子魚血清中分離純化得到，對刺激隱核蟲具有殺滅作用，對代表性革蘭氏陽性 菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有殺菌活性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途。黃斑藍子魚L-氨基酸氧化酶基因全序列長度為1725bp，開放閱讀框長度為1584bp，其具體位置在43-1626區(qū)域，編碼527個氨基酸。該L-氨基酸氧化酶從黃斑藍子魚血清中分離純化得到，對刺激隱核蟲具有殺滅作用，對代表性革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)具有殺菌活性。在經(jīng)過優(yōu)化的高保真酶PCR反應體系中，以黃斑藍子魚脾臟總cDNA為模板，采用設計的一對特異性引物，可快速準確克隆出編碼該蛋白的基因序列，用于后續(xù)基因工程。
文檔編號A61K38/44GK102121020SQ20101057787
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者李安興, 王方華, 黎睿君 申請人:中山大學