專利名稱：防治魚類水霉病的中草藥復(fù)方制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治水生動物疾病的藥物，尤其是防治魚類真菌性疾病的藥物。
背景技術(shù)：
魚類細菌性和真菌性疾病是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中危害最大的兩類魚病，據(jù)統(tǒng)計，北京地區(qū)近年來真菌性、細菌性疾病發(fā)病率占全年總發(fā)病率的65%，直接造成經(jīng)濟損失2000多萬元。由于這兩類疾病發(fā)病廣危害大，而目前國內(nèi)外針對細菌性、真菌性魚病并發(fā)癥的有效藥物不多，多年來一直采用孔雀石綠等化學(xué)藥物進行治療。特別是孔雀石綠，因其價格低廉，具有殺菌等作用，曾廣泛用于水產(chǎn)動物的真菌、細菌性(往往出現(xiàn)真菌性疾病并發(fā)癥) 等疾病的防治?？兹甘G是一種合成的三苯甲烷類工業(yè)染料，自1933年證實孔雀石綠具有抗菌、 殺蟲等藥效以來，許多國家曾將其廣泛用作驅(qū)蟲劑和殺菌劑，以殺滅水產(chǎn)動物體外的寄生蟲、原生動物和魚卵中的霉菌等，是藥用染料中抗菌效力較強的一類。從1990年代開始，國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時間長，被確證具有致癌、致畸、致突變等毒副作用。鑒于此，美國、加拿大、日本、歐盟等許多國家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。我國于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，但由于孔雀石綠抗菌效果好、價格低廉、對其毒副作用的宣傳力度不夠等原因，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍有違規(guī)使用的情況。2005年6月5日在英國超市出售的鮭魚體內(nèi)檢出孔雀石綠后，許多國家和地區(qū)也相繼在水生動物中發(fā)現(xiàn)其殘留，并迅速做出反應(yīng)， 孔雀石綠成為繼“蘇丹紅1號”之后食品安全的又一熱點問題。因此研究代替孔雀石綠防治水生動物疾病效果的藥物迫在眉睫。目前市場上的硫脒殺星和霉病力克雖然對真菌病有一定的療效，但都不太理想。 因此，研發(fā)可代替孔雀石綠的藥物勢在必行。中草藥取自天然的動植物，資源豐富，價格低廉，加工簡易方便，無毒無副作用，被作為“綠色漁藥”日益廣泛地應(yīng)用在水生動物病害防治上，發(fā)展前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于當(dāng)前魚類水霉病防治中化學(xué)藥物所帶來的不良影響，提供一種具有 “綠色藥品”的中草藥配方制劑，其成分質(zhì)量比為黃芩22-28%、苦參 22-28%、麻黃 22-28%、辣蓼 22-28%。本發(fā)明中采用的中草藥均具有殺蟲、抑菌、消炎和清熱解毒等作用，常用于真菌性疾病的防治。本發(fā)明采用將各中草藥混合，粉碎，過80目篩網(wǎng)，制成粉劑。使用方法，制成藥餌或煎煮后潑灑。用量可以將制劑混入飼料中，按飼料質(zhì)量的1-2%添加，建議采用1-1. 5%添加， 因為這樣成本低且效果不會明顯下降；或按照濃度為1. 5-2ppm，計算好制劑重量，加3倍水煎煮，在水開后再煎煮20分鐘后，將藥液和藥渣混合物直接潑灑到水體中，這樣成本低且有較好的防治效果。其中2ppm即藥劑與水體質(zhì)量比為2 1000000(百萬分之二)。本發(fā)明與化學(xué)藥物相比，具有下列優(yōu)點一是無毒，使用后無毒副作用；二是由于中草藥抗菌作用的協(xié)同性和廣譜性，所以不會對病菌產(chǎn)生抗藥性。
具體實施例方式急性毒力試驗取150g的該制劑用蒸餾水浸泡4h，用大火燒開后用中火煎20min，過濾藥液后，再煎第二劑，兩劑合并經(jīng)滅菌200目篩絹過濾除去藥渣，用三角錐瓶濃縮成100ml，制成濃度為1. 5g/ml的藥液。于滅菌的容器內(nèi)4°C保存?zhèn)溆?。試驗魚選用體質(zhì)健康，沒有疾病體重為75士5g的錦鯉，每組10尾，共260尾魚。試驗魚暫養(yǎng)7天，無死亡出現(xiàn)。在120L的水族箱內(nèi)注入81L水，曝氣48h，試驗在20°C恒溫下進行。于背鰭基部注射，注射深度為0.2cm左右。在注射后的4d內(nèi)停食，停氣，停水。觀察記錄24h、48h、72h、96h魚的死亡情況。制劑設(shè)0. 5mlUmlU. 5ml、2ml四個濃度梯度，外加一個注射滅菌生理鹽水作為對照組，同時設(shè)平行組。試驗結(jié)果取重復(fù)組的平均值，試驗組出現(xiàn)死亡時死亡率根據(jù)Abbott公式修正P = (Pl-C)/(I-C)試驗結(jié)果表明制劑的安全濃度為0. 13g/L，即130ppm。制劑浸泡對鯽魚非特異免疫力的影響1)實驗設(shè)計將實驗魚分成五個組，正式實驗時，將制劑按質(zhì)量分數(shù)加入飼料，配制成0 (對照組)、0.5% (A組)、1.0% (B組)、2.0% (C組)。實驗期間的進行虹吸、投飼等管理，在試驗進行的第3、7、14、21、28d采血進行非特異性免疫指標的測定，采血方式為魚尾靜脈采血。2)測定指標和方法分別于實驗后第3、7、14、21、^d各取樣一次，每次每組隨機取鯽5條，先用MS-222 快速麻醉，然后用注射器于尾靜脈處采血。將每尾魚的血液分為2份，1份加肝素抗凝，供測定白細胞吞噬活性和NBT陽性細胞檢測；1份置于室溫下，待凝血后分離血清，供測定血清殺菌、溶菌酶活性測定，同時解剖取脾臟并稱重。血清溶菌酶活性溶菌酶活性的測定采取Parry等的方法。用0. 067mol/L PBS(pH = 6. 4)將溶壁微球菌配成0. 2mg/mL的菌懸液，每個樣品取3mL菌懸液，吸取40 μ L血清加入到3mL菌懸液中，混合后立即在540nm下測定AO值，然后在水浴中溫浴30min，取出后置于4°C水浴終止反應(yīng)，再測定A值，按U = (AO-A) /A計算溶菌酶活力。血清殺菌活性參照Ainsworth等方法。利用計數(shù)板，將嗜水氣單胞菌用生理鹽水配制成IO6Cfu/ mL的菌懸液。將50 μ L血清加入到等量菌懸液中，22°C孵育證之后，將混合液倍比稀釋，不同稀釋度各取10 μ L加于平板培養(yǎng)基上，孵育過夜，計數(shù)平板菌落數(shù)。用50 μ L生理鹽水代替50 μ L血清加入等量菌懸液作為陽性對照。結(jié)果用殺菌百分率表示。殺菌百分率(<%) = (!-試驗組CFU/對照組CFU) X 100%
NBT陽性細胞檢測主要根據(jù)修改后的Anderson的方法進行。取50 μ L血細胞滴于蓋玻片上，于溫和中培養(yǎng)30min后，在0.067mol/L PBS (pH = 6. 4)中輕輕洗滌蓋玻片以完全去除紅細胞，然后在載玻片上滴50 μ L0. 2g/L NBT溶液，將蓋玻片反扣在NBT溶液上，于溫盒中溫育30min， 直接于40 X 10的顯微鏡下觀察結(jié)果，計數(shù)100各細胞，記錄陽性細胞數(shù)，呈棕黑色者為陽性細胞，并計算出陽性細胞比率。血液白細胞吞噬活性參照Chen等的方法，在0. 5mL抗凝血中加入0. 2mL金黃色葡萄球菌液液(含菌量為3. OX 109Cfu/mL)，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，3000r/min離心15min，取沉淀底層物抹片，甲醇固定，姬姆薩氏染液染色，鏡檢，計數(shù)并計算白細胞的吞噬活性。白細胞吞噬百分比(PP)=吞噬葡萄球菌的白細胞數(shù)/白細胞總數(shù)X 100%脾臟質(zhì)量指數(shù)每次采血后取試驗魚的脾臟，測定其臟器系數(shù)。先用吸水紙吸干魚體表的液體，稱量試驗魚體重，再摘取脾臟，用吸水紙吸干表面液體，立即在電子秤上稱重。脾臟重量與體重之比即為脾臟質(zhì)量指數(shù)。血清皮質(zhì)醇濃度采用放射免疫法(RIA)，用試劑盒測定。試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。實驗數(shù)據(jù)處理采用了SPSS 13. 0 和 EXCEL 2007 軟件。3)試驗結(jié)果血清溶菌酶活性實驗開始后第3d，實驗組的血清溶菌酶活性顯著高于對照組(P < 0. 05)，而實驗組間轉(zhuǎn)移不顯著(P >0.05)，在第7d，各實驗組間差異顯著(P <0.05)，隨著時間的推移，對照組血清溶菌酶活性維持在穩(wěn)定水平，實驗組均有不同程度的上升，其中C組上升最明顯，B組次之，A組最小。整個實驗期間，實驗組的血清溶菌酶活性顯著高于對照組(P
<0. 05)。血清殺菌活性實驗的第3d，實驗組的血清殺菌活性均高于對照組，只有C組顯著高于對照組 (P <0.05)，各實驗組間差異不顯著(P >0.05)；在第7d，各實驗組顯著高于對照組(P
<0. 05)，C組顯著高于A組(P < 0. 05)而與B組差異不顯著(P > 0. 05)，A組與B組差異不顯著(P > 0. 05)第14d差異顯著性與第7d相同。NBT陽性細胞數(shù)目整個實驗期間，對照組的NBT白細胞數(shù)目幾乎沒有變化，各實驗組的NBT陽性細胞數(shù)目是顯著高于對照組的(P < 0. 05)，并且隨著時間推移，各實驗組的NBT陽性細胞數(shù)目呈上升趨勢，濃度越高越明顯。在第3d，A組與B組無顯著差異(P >0.05)，C組顯著高于A 組(P < 0. 05)；在第7d，各實驗組間均差異顯著(P < 0. 05)；第14d的顯著性水平和第7d 相同。白細胞吞噬活性從實驗第3d起，實驗組的白細胞吞噬活性顯著高于對照組(P < 0. 05)，隨著實驗的推移，對照組白細胞吞噬活性沒有明顯變化，各實驗組白細胞吞噬活性水平在一定時期內(nèi)事不斷上升的，在21d后有所下降。在第3d，各實驗組間差異顯著(P <0.05)；在第7d， A組與B組差異不顯著(P > 0. 05)，C組顯著高于A組和B組；第14d顯著性水平與第7d 相同。脾臟指數(shù)各實驗組間無顯著性差異。從上可以得出制劑用量可以將制劑混入飼料中，按飼料質(zhì)量的1-2%添加，更好采用1-1. 5%添加，因為這樣成本低且效果不會明顯下降。4、中草藥配方中各藥物質(zhì)量比為黃芩25%、苦參25%、麻黃25%、辣蓼25%。投加方式直接潑灑到水體中，濃度為2ppm。在北京市通州區(qū)選取池塘分別為對照組393畝、預(yù)防組400畝、治療組407畝。 在同一個養(yǎng)殖場分別設(shè)置對照組、預(yù)防組和治療組。對照組和預(yù)防組分別選在疾病高發(fā)季節(jié)尚未發(fā)病的池塘。治療組在試驗前進行采樣，通過肉眼診斷和鏡檢確定為真菌性水霉病， 且選取發(fā)病率在40-60%以上的池塘。試驗結(jié)果表明，對照池塘在疾病高發(fā)季節(jié)，平均發(fā)病率為45-60%，死亡率為 16-58% ；預(yù)防池塘在疾病高發(fā)季節(jié)，平均發(fā)病率為10%，死亡率為0 ；治療池塘經(jīng)過兩次藥物潑灑后，癥狀基本消失，體表水霉菌消退恢復(fù)為正常的體色，治愈率達到86. 5%以上，有效率100%。預(yù)防組的發(fā)病率和死亡率低于對照組，治療組則有顯著的治療效果。5、中草藥配方中各藥物質(zhì)量比為黃芩22%、苦參22%、麻黃觀％、辣蓼觀％。投加方式按照潑灑使用方法，經(jīng)煎煮后直接潑灑到水體中，濃度為2ppm。在北京市順義區(qū)選取精養(yǎng)草魚池塘分別為對照組100畝、治療組120畝。在同一個養(yǎng)殖場分別設(shè)置對照組和治療組。對照組選在疾病高發(fā)季節(jié)尚未發(fā)病的池塘。治療組在試驗前進行采樣，通過肉眼診斷和鏡檢確定為真菌性水霉病，且選取發(fā)病率在40%以上的池塘。試驗結(jié)果表明，對照池塘在疾病高發(fā)季節(jié)，平均發(fā)病率為45-55%，死亡率為 18-45% ；治療池塘經(jīng)過兩次藥物潑灑后，癥狀基本消失，體表水霉菌消退恢復(fù)為正常的體色，治愈率達到80%以上，有效率100%。另外本發(fā)明應(yīng)用到多個區(qū)都取得了良好治療效果，產(chǎn)生了很好的經(jīng)濟效益，甚至對水質(zhì)改善有一定好處。
權(quán)利要求
1.一種防治魚類水霉病的中草藥復(fù)方制劑，其特征在于由以下中草藥配制而成黃芩、苦參、麻黃、辣蓼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述防治魚類水霉病的中草藥復(fù)方制劑，其中草藥各成分含量質(zhì)量比為黃芩22-28%、苦參22-28%、麻黃22-28%、辣蓼22-28%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述防治魚類水霉病的中草藥復(fù)方制劑的應(yīng)用，其特征在于將上述各中草藥混合，粉碎，過80目篩網(wǎng)，制成粉劑，然后將制劑混入飼料中或經(jīng)過煎煮后潑灑到水體中；將制劑混入飼料中，按飼料質(zhì)量的1-2%添加， 或?qū)⒅苿┙?jīng)過煎煮潑灑到水體中，潑灑濃度為1. 5-2ppm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治魚類水霉病的中草藥復(fù)方制劑及其應(yīng)用，其各成分質(zhì)量比為黃芩22-28％、苦參22-28％、麻黃22-28％、辣蓼22-28％。本發(fā)明與化學(xué)藥物相比，具有下列優(yōu)點一是無毒，使用后無毒副作用；二是由于中草藥抗菌作用的協(xié)同性和廣譜性，所以不會對病菌產(chǎn)生抗藥性。
文檔編號A61K36/704GK102283905SQ20111019158
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者何川, 楊華蓮, 殷守仁, 沈欽一, 盛竹梅, 賈麗, 黃文 申請人:北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站