專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明光敏劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑。
背景技術(shù)：
光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy, F1DT)是近20年發(fā)展起來(lái)的一種新的治療惡性腫瘤的方法。它是利用外加光敏劑或光敏劑前體，增加腫瘤內(nèi)光敏劑的聚集，隨后給予特定波長(zhǎng)的激發(fā)光激活光敏劑，從而引發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)造成腫瘤細(xì)胞的死亡。與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療相比，它具有相對(duì)的選擇特異性，毒副作用小，非侵入性，無(wú)累加毒性等特點(diǎn)。近年來(lái)美國(guó)、日本、荷蘭和加拿大等國(guó)的衛(wèi)生部門(mén)已相繼確認(rèn)了這一腫瘤新療法的合法性。同時(shí)，PDT療法在非腫瘤的治療中也受到了重視，用于移除有害的細(xì)胞或組織。
5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是一種常用的被美國(guó)FDA認(rèn)證的光敏劑，它由于代謝快、毒副作用小被臨床病人和基礎(chǔ)研究者所青睞。然而其親水性的分子結(jié)構(gòu)限制了對(duì)細(xì)胞膜的穿透力，從而限制了 5-ALA對(duì)于結(jié)節(jié)狀腫瘤的治療。所以，改善5-ALA對(duì)細(xì)胞膜的穿透力不僅可以提高5-ALA對(duì)腫瘤的殺傷效率，還能加大其在臨床上的應(yīng)用范圍。從1995年便有人通過(guò)制備5-ALA的脂類(lèi)衍生物來(lái)改善其親脂性能以增加其對(duì)細(xì)胞膜的通透性，到目前為止關(guān)于這方面的研究很多，但是沒(méi)有一種方法讓人們感到滿(mǎn)意和普遍接受。近年來(lái)，隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究已成為一個(gè)很有生命力的新方向。使用納米材料運(yùn)載藥物，不僅可以使藥物具備新的特性，如改善藥物的溶解性、增強(qiáng)藥物的靶向性、增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的穿透力等，還能利用納米微粒本身特殊的物理和化學(xué)特性，在一些疾病的診斷和治療中發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法，通過(guò)納米技術(shù)對(duì)5-ALA進(jìn)行改進(jìn)，提高5-ALA對(duì)細(xì)胞膜的穿透性，從而提高光動(dòng)力學(xué)療法療效。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，在pH為7. 20 7. 45的溶液中，5_氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金通過(guò)靜電力結(jié)合，其質(zhì)量比為5-氨基乙酰丙酸陽(yáng)離子膠體金=3 10: I。所述的陽(yáng)離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的直徑為10 50nm的膠體金顆粒。其中5-氨基乙酰丙酸的濃度為0. 5 10mM。還含有pH緩沖劑和穩(wěn)定劑。所述的pH緩沖劑為HEPES，其在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;所述的穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨，其在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟
I)陽(yáng)離子膠體金的制備在聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液加入其質(zhì)量0. I 5%的氯金酸，攪拌混勻，然后加入乙醇并攪拌混勻，調(diào)節(jié)pH為8. 0 8. 5，加熱至沸騰后冷卻至室溫，得到陽(yáng)離子膠體金溶液；2)將陽(yáng)離子膠體金溶液過(guò)濾后注入到pH為7. 20 7. 45的5_氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸與陽(yáng)離子膠體金的質(zhì)量比為3 10:1，超聲分散，并加入pH緩沖劑和穩(wěn)定劑，避光冷藏保存。所述的pH緩沖劑為HEPES，穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨。所述的HEPES在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;四辛基溴化銨在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。所述的超聲分散中超聲功率為250 300W，頻率為50 90Hz。 所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑在制備用于光動(dòng)力治療的藥物的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，利用納米膠體金的穿透力，通過(guò)靜電吸引力將5-ALA和陽(yáng)離子納米金(GNPs)結(jié)合，從而提高5-ALA對(duì)細(xì)胞膜的穿透性，從而提高光動(dòng)力學(xué)療法中對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。本發(fā)明提供的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，通過(guò)不同的光譜來(lái)進(jìn)行表征分析，最后用細(xì)胞試驗(yàn)驗(yàn)證了這種5-ALA和陽(yáng)離子納米金結(jié)合的新型光敏劑5-ALA-GNPs在光動(dòng)力療法中的可行性。具體的以人類(lèi)白血病慢性粒細(xì)胞K562用來(lái)作為光動(dòng)力療法的治療對(duì)象。與單獨(dú)的納米金和5-ALA相比，結(jié)合體的殺傷效果明顯提高，對(duì)K562細(xì)胞活性的抑制效果從單獨(dú)5-ALA的60%提升至71%左右。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了這種新型光敏劑良好的光動(dòng)力治療效果和它在光動(dòng)力學(xué)療法中的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為納米金的電鏡照片；圖2為納米金與5-ALA結(jié)合后的電鏡照片；圖3為Au+5-ALA與5-ALA的細(xì)胞的光動(dòng)力學(xué)療法效果對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明提供基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，是將5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金結(jié)合形成結(jié)合體，以改善其細(xì)胞穿透性。其中作為改性的陽(yáng)離子納米金(GNPs)為具有能夠提供靜電吸引力的陽(yáng)離子的納米金即可，一旦吸附形成結(jié)合體之后，陽(yáng)離子納米金就可發(fā)揮其增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的穿透力的能力，從而協(xié)助5-氨基乙酰丙酸穿過(guò)細(xì)胞膜。下面通過(guò)具體的制備實(shí)施例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明，實(shí)施例中所選擇的陽(yáng)離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的膠體金顆粒，這并不是對(duì)技術(shù)方案中陽(yáng)離子膠體金與5-ALA結(jié)合的限定，也不排除其他陽(yáng)離子膠體金與5-ALA的結(jié)合，比如市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)的多種陽(yáng)離子膠體金。所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。實(shí)施例I基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽(yáng)離子膠體金的制備取0.Ig聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethylammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至lOOmL。將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸3mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無(wú)水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至8. 5。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結(jié)合分別將ImM、IOmM和IOOmM三種不同濃度的5-ALA調(diào)節(jié)pH值到7. 4左右。將新制備的膠體金溶液用220 的注射濾器過(guò)濾，分別與不同濃度的5-氨基乙酰丙酸按體積比
I I混合，超聲分散5分鐘(功率285W，頻率59Hz )；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為20mM作為，使PH值保持恒定，根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為2mM以保持5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金結(jié)合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆谩⒁?jiàn)圖I所示的納米金的電鏡照片，圖2所示的納米金與5-ALA結(jié)合后的電鏡照片，圖I與圖2相比結(jié)合5-ALA后的結(jié)合體5-ALA-Au明顯比未結(jié)合前變大。實(shí)施例2基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽(yáng)離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至100mL。將IOOmL I3DDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無(wú)水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結(jié)合分別將濃度為IOmM的5-ALA調(diào)節(jié)pH值到7. 2左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過(guò)濾，調(diào)節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽(yáng)離子膠體金的質(zhì)量比為4. 5:1，超聲分散3分鐘(功率285W，頻率75Hz )；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金結(jié)合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆?。?shí)施例3基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽(yáng)離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至100mL。
將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無(wú)水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結(jié)合分別將濃度為IOmM的5-ALA調(diào)節(jié)pH值到7. 2左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過(guò)濾，調(diào)節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽(yáng)離子膠體金的質(zhì)量比為8:1，超聲分散10分鐘(功率300W，頻率80Hz)；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金結(jié)合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆谩?實(shí)施例4基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，包括以下步驟I)陽(yáng)離子膠體金的制備取0. Ig 聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(Poly diallyl dimethy lammonium chloridePDDA)置于50mL燒杯中，用玻璃棒攪拌均勻，定容至lOOmL。將IOOmL PDDA溶液移至250mL燒杯中，磁力攪拌10分鐘，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的氯金酸5mL,磁力攪拌10分鐘使之充分混勻。加入2mL無(wú)水乙醇,磁力攪拌2分鐘后,用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至8. O。最后，用微波爐加熱至沸騰，冷卻至室溫后放入4°C冰箱保存。2)納米金與5-ALA的結(jié)合分別將濃度為IOmM的5-ALA調(diào)節(jié)pH值到7. 45左右，將新制備的膠體金溶液用220 u m的注射濾器過(guò)濾，調(diào)節(jié)注入的膠體金溶液，使5-氨基乙酰丙酸與陽(yáng)離子膠體金的質(zhì)量比為5:1，超聲分散10分鐘(功率300W，頻率90Hz)；根據(jù)溶液量加入HEPES作為pH緩沖劑，使其在溶液中的最終濃度為IOOmM,使pH值保持恒定；pH緩沖劑也可以為其他緩沖劑；根據(jù)溶液量加入相穩(wěn)定劑四辛基溴化銨，使其在溶液中的最終濃度為5mM，以保持5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金結(jié)合體的穩(wěn)定，在4°C避光冷藏保存?zhèn)溆?。?jīng)過(guò)改性可以提高5-ALA對(duì)細(xì)胞膜的穿透性，從而提高光動(dòng)力學(xué)療法中對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。具體人類(lèi)白血病慢性粒細(xì)胞K562用來(lái)作為光動(dòng)力療法的治療對(duì)象來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。當(dāng)K562細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度到大約5X IO5左右，將細(xì)胞和制備好的新型光敏劑放置于96孔板中孵育4小時(shí)后，用汞燈照射系統(tǒng)以3. 6J/cm2的能量密度于暗室中照射I小時(shí)。光照后，將光照組和空白對(duì)照組的96孔板中各實(shí)驗(yàn)孔都加入10iilCCK-8(CellCounting Kit-8)試劑(試劑中主要成分WTS-8，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4- 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，一種常用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的試劑)，再次放入培養(yǎng)箱孵育。分別在不同的時(shí)間段，利用酶標(biāo)儀以450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)量各實(shí)驗(yàn)孔OD值，檢測(cè)細(xì)胞活性。
檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，分別給出了對(duì)照組(即不加入任何物質(zhì)的細(xì)胞)，細(xì)胞納米金混合培養(yǎng)液，細(xì)胞5-ALA混合培養(yǎng)液以及細(xì)胞5-ALA-Au混合培養(yǎng)液在激光照射下的細(xì)胞的活性分析結(jié)果。通過(guò)分析可知，與單獨(dú)的納米金和5-ALA相比，改性后的5-ALA結(jié)合體的殺傷效果明顯提高，對(duì)K562細(xì)胞活性的抑制效果從單獨(dú)5-ALA的60%提升至71%左右。效果的提高是由于納米金增加了 5-ALA對(duì)細(xì)胞的穿透能力，從而增加了細(xì)胞對(duì)結(jié)合體的攝入。 細(xì)胞攝入結(jié)合體越多，5-ALA在細(xì)胞中的堆積越多，轉(zhuǎn)化的原卟啉IX就越多。原卟啉IX正是光動(dòng)力學(xué)療法中殺傷細(xì)胞的光敏物質(zhì)，因此，會(huì)有更多的細(xì)胞被殺傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了改性后的光敏劑良好的光動(dòng)力治療效果和它在光動(dòng)力學(xué)療法中的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，在pH為7. 20 7. 45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金通過(guò)靜電力結(jié)合，其質(zhì)量比為5-氨基乙酰丙酸陽(yáng)離子膠體金=3 10: I。
2.如權(quán)利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，所述的陽(yáng)離子膠體金為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽所形成的直徑為10 50nm的膠體金顆粒。
3.如權(quán)利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，其中5-氨基乙酰丙酸的濃度為O. 5 10mM。
4.如權(quán)利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，還含有pH緩沖劑和穩(wěn)定劑。
5.如權(quán)利要求4所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑，其特征在于，所述的pH緩沖劑為HEPES，其在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;所述的穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨，其在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。
6.一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，包括以下步驟 1)陽(yáng)離子膠體金的制備 在聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽溶液加入氯金酸后，攪拌混勻，然后加入乙醇并攪拌混勻，調(diào)節(jié)PH為8. O 8. 5，加熱至沸騰后冷卻至室溫，得到陽(yáng)離子膠體金溶液； 2)將陽(yáng)離子膠體金溶液過(guò)濾后注入到pH為7.20 7. 45的5-氨基乙酰丙酸溶液中，其中5-氨基乙酰丙酸與陽(yáng)離子膠體金的質(zhì)量比為3 10:1，超聲分散，并加入pH緩沖劑和穩(wěn)定劑，避光冷藏保存。
7.如權(quán)利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的PH緩沖劑為HEPES，穩(wěn)定劑為四辛基溴化銨。
8.如權(quán)利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的HEPES在改性光敏劑中的最終濃度為10 50mM ;四辛基溴化銨在改性光敏劑中的最終濃度為I 10mM。
9.如如權(quán)利要求6所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑的制備，其特征在于，所述的超聲分散中超聲功率為250 300W，頻率為50 90Hz。
10.權(quán)利要求I所述的基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑在制備用于光動(dòng)力治療的藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于5-氨基乙酰丙酸的改性光敏劑及其制備方法，在pH為7.20～7.45的溶液中，5-氨基乙酰丙酸和陽(yáng)離子膠體金通過(guò)靜電力結(jié)合。利用納米膠體金的穿透力，通過(guò)靜電吸引力將5-ALA和陽(yáng)離子納米金(GNPs)結(jié)合，從而提高5-ALA對(duì)細(xì)胞膜的穿透性，從而提高光動(dòng)力學(xué)療法中對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。與單獨(dú)的納米金和5-ALA相比，結(jié)合體的殺傷效果明顯提高，對(duì)K562細(xì)胞活性的抑制效果從單獨(dú)5-ALA的60%提升至71%左右。證明了這種新型光敏劑良好的光動(dòng)力治療效果和它在光動(dòng)力學(xué)療法中的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102727891SQ201210192480
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者姚翠萍, 張鎮(zhèn)西, 李政, 梅建生, 王斯佳, 王晶, 許澔, 韓玉龍 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)