專利名稱：一種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及一種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的其制備方法。
背景技術(shù)：
紫杉烷類藥物(如紫杉醇、多烯紫杉醇等)是目前臨床上所使用的最有效的抗腫瘤藥物之一。紫杉醇為七十年代發(fā)現(xiàn)的從紅豆杉或其種屬的樹皮或針葉中分離得到的天然產(chǎn)物多烯紫杉醇為半合成產(chǎn)物，之后發(fā)現(xiàn)這是一類具有特殊抗腫瘤作用機(jī)制的抗腫瘤劑。紫杉烷類藥物的抗腫瘤作用機(jī)制是促進(jìn)微管聚合，降低微管的解聚速度，從而使微管處于穩(wěn)定的非功能性狀態(tài)，從而達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞有絲分裂和增殖的目的。且臨床前研究表明多烯紫杉醇與紫杉醇相比，對微管的親和力更強(qiáng)、血漿半衰期更長及細(xì)胞內(nèi)滯留時間更長。盡管紫杉烷類藥物具有良好的抗腫瘤作用，但是其水溶性均較低(約lOug/ml)， 因此臨床上所使用的紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液均需要分別使用表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80 (吐溫-80)以及助溶劑乙醇來到溶解紫杉醇藥物的目的。紫杉醇注射液和多烯紫杉醇注射液則最早分別是由美國百時美施貴寶公司和法國賽諾菲-安萬特公司成功開發(fā)上市的產(chǎn)品。雖然使用表面活性劑聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨酯80后可以配制成注射液，但是其在臨床應(yīng)用中的毒副作用較大，容易引起較多的并發(fā)癥，較為常見的包括過敏反應(yīng)、骨髓抑制(主要表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞減少)、液體潴留、神經(jīng)毒性、脫發(fā)等不良反應(yīng)。大量的研究顯示聚氧乙烯蓖麻油在體內(nèi)可促進(jìn)大量組織胺釋放，進(jìn)而產(chǎn)生過敏反應(yīng)，還可導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)延遲感覺神經(jīng)病變。此外，聚氧乙烯蓖麻油還可以在血液中形成微小顆粒包囊紫杉醇分子，影響了藥物分子向組織的擴(kuò)散，從而影響了其抗腫瘤效應(yīng)。還有研究表明聚氧乙烯蓖麻油可溶解PVC輸液器中的二乙烯己基鄰苯二甲酸鹽(Diethylehexy Phthalate)。而聚山梨酯80 (吐溫-80)具有溶血性，且黏度大，臨床用藥很不方便。上述注射液制劑在毒副作用、給藥方便性以及穩(wěn)定性等方面均存在一定的問題，因此開發(fā)新的紫杉烷類藥物給藥劑型成為必要。許多生物相容性的聚合物可以用來制備聚合物外殼，包裹在不溶于水的藥理活性藥物的外部。實際上任何一種聚合物，天然的或是人工合成的，只要能根據(jù)需要在其結(jié)構(gòu)內(nèi)含有巰基或二硫鍵，就可以用于在實際上不溶于水的藥理活性藥物的周圍形成一層二硫鍵交聯(lián)外殼。含有半胱氨酸和/或二硫鍵的蛋白質(zhì)是藥學(xué)上可接受的生物學(xué)載體，本專利以人血清白蛋白為例。人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)由585個氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量66. 5kDa，是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)(占人體血漿總蛋白的 50% -60% )，具有化學(xué)性能穩(wěn)定、安全無毒、無免疫原性、生物相容性好、生物可降解、體內(nèi)長循環(huán)(半衰期長達(dá)19天)的特點。
HSA作為抗腫瘤藥物載體材料，具有很多優(yōu)點，主要包括①優(yōu)越的藥物負(fù)載潛力HSA多肽鏈上帶有較多的極性基團(tuán)及疏水性氨基酸，對 70%的小分子藥物、特別是難溶性藥物具有高度的親和力，且可發(fā)生可逆結(jié)合，為其有效負(fù)載和釋藥提供可能；白蛋白二級結(jié)構(gòu)中含有約48%的α-螺旋結(jié)構(gòu)，15% β-折疊片結(jié)構(gòu)， 其余為無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)，因此具有很多的網(wǎng)狀空隙，為攜帶藥物創(chuàng)造了有利的空間條件。②廣譜腫瘤靶向白蛋白是腫瘤細(xì)胞的重要氮源，快速生長的腫瘤具有很強(qiáng)的攝取和儲備白蛋白能力。HSA作為抗腫瘤藥物載體，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的白蛋白受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜上的窯蛋白，從而將抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞間質(zhì)中。腫瘤細(xì)胞間質(zhì)和腫瘤細(xì)胞表面富含大量的半胱胺酸酸性分泌性蛋白，該蛋白功能類似于白蛋白受體，能專門吸引和粘附白蛋白，而半胱胺酸酸性分泌性蛋白在幾乎所有的腫瘤組織(膀胱、肝臟、卵巢、腎、消化道、乳腺等)都過度表達(dá)，這就形成了腫瘤組織中的藥物儲藏池，為載有抗腫瘤藥物的白蛋白納米載體的廣譜靶向殺傷提供了可能。③結(jié)構(gòu)可修飾性HSA結(jié)構(gòu)中含有大量的反應(yīng)活性基團(tuán)，如游離氨基、羧基、巰基等，可與抗腫瘤藥物通過化學(xué)鍵偶聯(lián)，改善藥物溶解性、提高體內(nèi)循環(huán)時間以及腫瘤靶向性；也可與抗體或配體等“靶分子”偶聯(lián)，進(jìn)一步提高HSA納米載體的腫瘤靶向性能。近年來，也有報道將HSA和葡聚糖、己醛醣或聚異丙基丙烯酰胺等高分子材料相偶聯(lián)以改善HSA 作為藥物載體材料的理化性質(zhì)。鑒于HSA作為藥物載體材料具有獨特優(yōu)勢，目前國內(nèi)外對基于白蛋白的藥物遞送系統(tǒng)研究主要集中于兩個方向①前體藥物利用HSA大量的反應(yīng)活性基團(tuán)，將藥物、尤其是抗腫瘤藥物(阿霉素、 紫杉醇、多烯紫杉醇、甲氨喋呤、絲裂霉素、5-氟尿嘧啶)化學(xué)偶聯(lián)于HSA的游離氨基、羧基或巰基，以改善藥物溶解性、提高體內(nèi)循環(huán)時間以及腫瘤靶向性，國外已有較多報道。然而通過將HSA和藥物直接化學(xué)偶聯(lián)，存在以下問題1)藥物可選擇范圍窄藥物需有一定的反應(yīng)活性基團(tuán)，且在化學(xué)偶聯(lián)過程中藥物易失效；2)療效發(fā)揮的不定性藥物與HSA之間化學(xué)鍵斷裂的容易程度決定了藥物療效的發(fā)揮，過快斷裂，HSA失去作為載體材料的優(yōu)勢，過慢斷裂，藥物則無法發(fā)揮療效；3)成本高，載藥量低偶聯(lián)過程中，藥物投料量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于HSA，而偶聯(lián)藥物量有限，造成制備成本大(特別是抗腫瘤藥物原料價格昂貴)，體系載藥量低的缺陷。②納米遞藥體系物理包封藥物可顯著提高載體材料對藥物的負(fù)載。目前，國內(nèi)外報道的白蛋白納米粒制備或載藥工藝主要有乳化凝聚法、去溶劑化法、PH凝聚法以及Nab 技術(shù)。前三種方法雖然研究應(yīng)用時間最長，報道最多，但仍存在很多問題1)粒徑大。納米粒粒徑0. 5-10 μ m，且易受操作條件影響，小于200nm的白蛋白納米粒幾無報道，過大的粒徑不利于納米載體通過腫瘤的EI^R效應(yīng)蓄積于腫瘤；2)需固化。由于HSA高度水溶，所制得的納米粒子需要固化操作，S卩加入化學(xué)交聯(lián)劑使白蛋白發(fā)生交聯(lián)或加熱使蛋白發(fā)生變性，前者毒性較大，且易使藥物同時發(fā)生交聯(lián)而失去療效，后者則不適合溫度敏感藥物的負(fù)載；另外，還有人認(rèn)為采用交聯(lián)或加熱固化的方法會減少HSA納米粒表面的親水性，從而減少在血液中循環(huán)時間，不利于腫瘤靶向；3)后處理工藝復(fù)雜。由于工 藝中使用了表面活性劑、油、化學(xué)交聯(lián)劑等有毒添加齊IJ，需以大量有機(jī)溶劑清洗純化，但是少量殘留仍將給用藥安全帶來隱患；采用高速離心分離(16000-2(KKK)g)收集納米粒，不僅對儀器要求高，而且在水中重分散性差；4)適用藥物范圍小。僅適合于水溶性藥 物的負(fù)載，而相當(dāng)一部分抗腫瘤藥物為難溶性藥物。Nab技術(shù)是美國生物科學(xué)公司近年來建立的藥物結(jié)合白蛋白納米技術(shù)。該技術(shù)僅適合于血漿蛋白結(jié)合率比較高的脂溶性藥物的包裹。2005年，以該技術(shù)制備的紫杉醇結(jié)合白蛋白納米粒(凱素 )獲得FDA批準(zhǔn)上市，主要用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌聯(lián)合化療失敗后或輔助化療6個月內(nèi)復(fù)發(fā)的乳腺癌。該制劑相對于傳統(tǒng)的聚氧乙烯蓖麻油制劑(泰素 )具有更低的毒性、更好的療效，但是也存在不少缺陷，包括1)毒性溶劑的使用。采用氯仿為溶媒，雖有真空蒸發(fā)操作， 但增加了工藝難度，并且產(chǎn)品可能有溶劑殘留；2)載藥量低。僅能控制在2-10wt%，需消耗大量的HSA ;3)體內(nèi)外穩(wěn)定性差。該制劑在pH>5.8條件下，藥物在幾小時內(nèi)極易析出，因此制劑PH值需控制在pH5. 4-5. 8范圍內(nèi)(在此范圍也僅穩(wěn)定24h)。而人體內(nèi)環(huán)境pH值為7. 4，該制劑進(jìn)入血液循環(huán)以后，預(yù)計藥物短時間將從載體析出而不利于腫瘤的特異性攝取，目前臨床上用藥劑量是泰素 制劑的1. 5倍。由于超聲波技術(shù)等制備方法均不能用于工業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)，并且其得到的微粒粒徑太大，這使其不合適和不能用于病人給藥使用。因此美國生物科學(xué)有限公司在專利 US2007082838以及CN98808225和CN97199720中記載了并要求分別保護(hù)用高壓勻化方法制備可以重制的多烯紫杉醇/紫杉醇和人血清白蛋白的冷凍干燥制劑，且所得重構(gòu)后混懸液的穩(wěn)定性超過24小時。高剪切技術(shù)具有超強(qiáng)的混合、粉碎、分散、乳化等功能，對于SBS、SBR等高分子彈性材料有特別顯著的粉碎效果，能有效解決各類物料的粉碎、乳化難題，取代了傳統(tǒng)的膠體磨設(shè)備。與傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝相比，具有能耗低、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量高、超細(xì)化等優(yōu)勢。在CN98808225和CN97199720專利中記載并要求保護(hù)含有水不溶性藥物以及蛋白質(zhì)包衣顆粒的藥物輸送系統(tǒng)及其制備方法，其中所述的顆粒平均直徑為10-200nm。其所述藥物組合系統(tǒng)的制備方法為將含所述水不溶性藥物并在其中分散的有機(jī)相和含蛋白質(zhì)的水性介質(zhì)組成的混合物置于3000-30000Psi的高壓勻漿器內(nèi)，使其接受高剪切處理，產(chǎn)生上述顆粒，并且該組合物不含有表面活性劑。本發(fā)明人曾多次重復(fù)上述專利的實施例，特別是CN97199720的實施例1、5和6，不曾得到在此專利的實施例和權(quán)利要求中所說明的結(jié)果。本發(fā)明人制備了所公開的混合物， 然后在其所推薦的壓力范圍內(nèi)用Avestin高壓均質(zhì)機(jī)對混合物進(jìn)行處理，得到pH = 6. 8的納米乳劑，并且按照專利中所述的用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)除去溶劑，可產(chǎn)生平均粒徑約為220nm 的納米顆粒，在進(jìn)行冷凍干燥后加入生理鹽水后很容易重制成為混懸液，但是其納米顆粒大小較冷凍干燥前明顯增加，平均粒徑由冷凍干燥之前的220nm增大為390nm，且在4h內(nèi)即出現(xiàn)納米顆粒的沉淀。此外，以專利CN97199720中所記載的微孔濾膜進(jìn)行過濾，但結(jié)果是濾器很容易出現(xiàn)堵塞，且藥物產(chǎn)率低于30%，這與專利中所陳述的70-100%的產(chǎn)率結(jié)果不同。在US2007082838專利中記載并要求保護(hù)加入穩(wěn)定劑檸檬酸鈉和/或氯化鈉的包含多烯紫杉醇藥物的白蛋白納米粒，其平均粒徑< 200nm，并且如專利中所述，這些用高于勻化方法得到的納米乳劑據(jù)稱有很高的穩(wěn)定性，此處術(shù)語“穩(wěn)定性”的意義既表示平均粒徑不隨時間或冷凍干燥過程而變化，也表示不出現(xiàn)納米顆粒的藥物沉淀(US200708283，實施例 12)。本發(fā)明人曾多次重復(fù)上述專利的實施例，特別是US200708283的實施例11，16，和 18，不曾得到在此專利實施例和權(quán)利要求書中所公開的結(jié)果。本發(fā)明人制備了所公開的混合物，然后在其推薦的壓力范圍內(nèi)用Avestin高壓均質(zhì)機(jī)對其處理，得到pH = 7. 2的納米乳劑，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后，產(chǎn)生平均粒徑約280nm的納米顆粒。但是很快出現(xiàn)納米顆粒的沉淀，在進(jìn)行所述的微孔濾膜過濾(1. 2um，0. 8um，0. 45um和0. 22um)時較難，濾膜容易出現(xiàn)堵塞的情況，且其凍干物在生理溶液中重制后形成的納米混懸液不穩(wěn)定， 約8小時內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的沉淀，這些與專利中聲稱的穩(wěn)定性大于24小時的結(jié)果截然不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述問題和缺點，本發(fā)明提供一種制備工藝更簡單、性質(zhì)更穩(wěn)定以及更佳的臨床應(yīng)用性質(zhì)的蛋白納米顆粒。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白納米顆粒的制備方法。本發(fā)明人在制備蛋白納米顆粒的過程中無意中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將水溶性載體材料(如， 聚乙二醇，甘露醇，PVP，等)加入蛋白質(zhì)體系后，包載紫杉烷類藥物的蛋白質(zhì)納米顆粒更易形成，同時粒徑均勻，穩(wěn)定性提高。為了考察此水溶性載體材料在體系中的作用，本發(fā)明人研究了水溶性載體材料與蛋白質(zhì)類之間的關(guān)系，令人驚奇的是，透射電鏡和差示掃描量熱的結(jié)果均反映出，此二者并不是簡單的混合體系，而是通過相互作用形成了一種新的復(fù)合體系。我們推測由于此新的復(fù)合體系的形成，使得紫杉烷類藥物可以更好的被包載，從而使得制備工藝的可操作性顯著提升，同時使得納米顆粒更穩(wěn)定與更均勻。由于此新復(fù)合體系的顯著優(yōu)勢，本發(fā)明人繼而嘗試將此水溶性載體與紫杉烷類藥物先混合，使紫杉烷類藥物以分子分散的形式存在于水溶性載體中，二者以固體分散體的形式加入蛋白質(zhì)類溶液中，混合并經(jīng)過高剪切力的作用形成紫杉烷類藥物的蛋白質(zhì)納米顆粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)納米顆粒更易形成，穩(wěn)定性更佳；同時，該納米顆粒具有明顯的血液長循環(huán)和組織、器官靶向性，具有更優(yōu)良的藥效學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明提供一種將紫杉烷類藥物(如紫杉醇，多烯紫杉醇，等)以分子分散狀態(tài)的形式加入到一個納米級別載體的制備方法。該方法比nab技術(shù)更易獲得紫杉烷類藥物納米顆粒(平均直徑小于200納米)，且不需加入任何有毒的有機(jī)溶劑(如，二氯甲烷，氯仿，等等)，避免了有機(jī)溶劑在制劑中的殘留，大大提高臨床用藥的安全性。同時，本發(fā)明提供一種蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒對紫杉烷類藥物載藥量高， 可以顯著降低蛋白質(zhì)類物質(zhì)的用量；該蛋白納米顆粒還具備良好的體內(nèi)外穩(wěn)定性，液體制劑在室溫條件下可長時間穩(wěn)定保存，提高用藥方便性和安全性。該方法所獲得的紫杉烷類藥物的納米顆粒具有明顯的血液長循環(huán)和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學(xué)性質(zhì)。綜上所述，本發(fā)明提供一種制備工藝更簡單、性質(zhì)更穩(wěn)定以及更佳的臨床應(yīng)用性質(zhì)的蛋白納米顆粒。該蛋白納米顆粒具有粒徑均勻、穩(wěn)定性好、安全性好高等特征。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的
—種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒的配方含有下列重量百分比的物質(zhì)0. 1 10%紫杉烷類藥物，0. 1 40%水溶性載體材料，50 90%蛋白質(zhì)類物質(zhì)。所述的蛋白納米顆粒，其中紫杉烷類藥物選自下列物質(zhì)中的一種或多種紫杉醇， 多烯紫杉醇，或者它們的衍生物。所述的蛋白納米顆粒，其中所述水溶性載體材料選自下列物質(zhì)中的一種或多種 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、甘露醇、尿素、海藻酸鈉、羥丙基纖維素鈉、聚丙烯酸樹脂、明膠、羧甲基纖維素鈉。本發(fā)明所稱的蛋白質(zhì)類物質(zhì)是指能夠通過巰基和/或二硫鍵交聯(lián)的下列物質(zhì)天然存在或合成的蛋白質(zhì)及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的類蛋白及其衍生物，或者它們的混合物。所述天然存在的蛋白質(zhì)包括白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物選自含有游離巰基和/或二硫基修飾的下列物質(zhì)中的一種或多種聚乙醇、聚乙基惡唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸內(nèi)酯或其共聚物、合成聚氨基酸。 所述的蛋白納米顆粒的制備方法，該方法包括下列步驟a.將紫杉烷類藥物與水溶性載體材料制成含有紫杉烷類藥物的水溶性載體固體分散體；b.將所得的固體分散體加入含蛋白質(zhì)類物質(zhì)的水性介質(zhì)中，混合均勻，混合物經(jīng)高剪切條件處理得到包裹了紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；c.將混懸液進(jìn)行干燥或先經(jīng)過無菌過濾再干燥，按所需劑型制成包裹了紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的固體制劑、半固體制劑或氣體制劑；或者將步驟b得到混懸液直接作為液體制劑或進(jìn)一步制備成其他類型的液體制劑、或?qū)⒒鞈乙焊稍锘蛳冉?jīng)過無菌過濾再干燥后再復(fù)溶制成液體制劑。所述的制備方法，其中水性介質(zhì)選自注射用水，純水，甘露醇溶液，磷酸鹽水溶液， 右旋糖酐溶液，葡萄糖水溶液，氯化鈉水溶液，氨基酸溶液，維生素溶液，碳水化合物溶液， 或它們的任意兩種或兩種以上的混合物。所述的制備方法，其中制備含有紫杉烷類藥物的水溶性載體固體分散體的方法為熔融法、溶劑法、溶劑_熔融法、溶劑_噴霧(冷凍)干燥法、研磨法、或雙螺旋擠壓法；且這些方法不引入任何有機(jī)溶劑或者任何除乙醇之外的其他有機(jī)溶劑；優(yōu)選采用溶劑-熔融法；(熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法等方法是制備固體分散體的常規(guī)方法。例如，將藥物用乙醇溶解(溶劑)，水溶性載體加熱熔融(熔融)，兩者混合，此即溶劑-熔融法。再例如， 將藥物加熱熔融，水溶性載體加熱熔融，兩者混合，此即熔融法。如果是溶劑_熔融法，則為 “不需要引入任何除乙醇之外的其他有機(jī)溶劑”即，只用乙醇。如果是熔融法，則為“不需要引入任何有機(jī)溶劑”。本發(fā)明優(yōu)選采用的是溶劑-熔融法，溶劑-熔融法相較熔融法的優(yōu)勢是有些藥物直接熔融，會導(dǎo)致溫度過高，發(fā)生降解，穩(wěn)定性不能保證，因此本專利主要采用溶劑-熔融法，具體采用何種方法可以根據(jù)選用的藥物及載體的性質(zhì)決定。)
所述高剪切條件是指應(yīng)用同時具備高壓和高切變力的設(shè)備，使混合物達(dá)到高效的混合、粉碎、分散及乳化目的；其中，高壓是指壓力范圍在5000至30000磅/英寸2，優(yōu)選 6000 25000磅/英寸2。所述的制備方法，其中該蛋白納米顆粒的平均粒徑為20 lOOOnm，優(yōu)選為20 200nmo 所述的制備方法，其中干燥方法采用冷凍干燥或噴霧干燥；無菌過濾采用 0. 22 μ m濾器過濾。詳細(xì)地說，本發(fā)明是提供一種將紫杉烷類藥物(如紫杉醇，多烯紫杉醇，等)以分子分散狀態(tài)的形式加入到一個納米級別載體的制備方法。該方法比nab技術(shù)更易獲得紫杉烷類藥物小納米顆粒(平均直徑小于200納米)，且不需加入任何有毒的有機(jī)溶劑(如，二氯甲烷，氯仿，等)。該方法所獲得的紫杉烷類藥物的納米顆粒更加穩(wěn)定，并且載藥量高，具有明顯的血液長循環(huán)和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學(xué)性質(zhì)。該方法提供一種通過去溶劑技術(shù)形成紫杉烷類藥物的納米顆粒的方法，比如，高剪切力(如超聲，高壓勻漿作用或類似條件)可被用來在缺乏任何常規(guī)表面活性劑和任何聚合核心物質(zhì)的條件下形成納米顆粒的基質(zhì)。該方法提供一種可重復(fù)使用的小納米顆粒(直徑小于200納米)的制備方法，該顆粒可通過0. 22微米濾器無菌過濾。這種可通過0. 22微米濾器過濾的一定大小的納米顆粒的制備意義重大，因為含有大量任何蛋白質(zhì)(如白蛋白)的制劑均不能用常規(guī)的方法如高壓滅菌進(jìn)行消毒，因為熱可使蛋白變性。當(dāng)然，如果采用孔徑更大的濾器也可將顆粒的平均粒徑控制在IOOOnm左右，但本發(fā)明優(yōu)選將顆粒的平均粒徑控制在20 200nm。在水性介質(zhì)中加入蛋白質(zhì)類物質(zhì)(例如，人血清白蛋白)的濃度范圍約為 0. 05-25% (w/v, g/ml，下同)，范圍在0. 5%-10% (w/v)內(nèi)更好。這些水性介質(zhì)有生理鹽水、緩沖生理鹽水、水、緩沖的水性介質(zhì)、氨基酸溶液、維生素溶液、碳水化合物溶液或類似的介質(zhì)，以及任何2種以上這些介質(zhì)的混合物。與常規(guī)的納米顆粒形成方法不同，混合物內(nèi)不需要加入表面活性劑(例如，十二烷基硫酸鈉、卵磷脂、吐溫80、多聚醇F68和類似化合物等)或有毒有機(jī)溶劑(例如，二氯甲烷、氯仿等)。將紫杉烷類藥物(紫杉醇、多烯紫杉醇等)與水溶性載體(如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆等)通過熔融法、溶劑法或熔融溶劑法等方法制備成一種紫杉烷類藥物和水溶性載體的固體分散體(粉末)。該固體分散體的形成不需要引入任何除乙醇之外的其他有機(jī)溶劑，甚至根本不需要引入有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)溶劑(如氯仿，二氯甲烷等) 在制劑中的殘留，大大提高臨床用藥的安全性。于低剪切力下經(jīng)均化作用形成一種由微米和納米小滴組成的混合物。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式來完成，例如，采用一種操作范圍在大約2，000至大約15，000
轉(zhuǎn)/分鐘的常規(guī)實驗室均漿器。載藥納米顆粒是在高剪切力條件下經(jīng)均化作用形成的。這種均化作用通常在高壓均漿器內(nèi)進(jìn)行，典型的操作壓力在5，000至30，000磅/英寸2的范圍內(nèi)，此過程在6，000至 25，000磅/英寸2范圍內(nèi)進(jìn)行更好。生成的乳劑含極細(xì)微的水性載體納米小滴(含溶解的藥理活性物質(zhì)等)和極細(xì)微的蛋白質(zhì)納米小滴?？山邮艿木椒ò少x予高剪切和空化作用，如高壓均漿器、超聲處理器、高剪切攪拌器，和類似設(shè)備。
液體混懸物可經(jīng)干燥得到包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的粉末。生成的粉末可于任何合適的時間和在適宜的水性介質(zhì)中再分散得到能對哺乳動物給藥的混懸液。這些水性介質(zhì)有生理鹽水、緩沖生理鹽水、水、緩沖的水性介質(zhì)、氨基酸溶液、維生素溶液、碳水化合物溶液或類似的介質(zhì)，以及任何2種以上這些介質(zhì)的混合物。為得到這種粉末所采用的方法包括冷凍干燥、噴霧干燥，和類似的技術(shù)。通過除去其內(nèi)含的水分，例如，在適宜的溫度-時間范圍內(nèi)用真空冷凍干燥方法即可進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成粉末形式。蛋白質(zhì)(例如，人血清白蛋白)本身起冷凍保護(hù)劑作用，不需要使用常規(guī)冷凍保護(hù)劑如甘露醇、蔗糖、甘油，和類似的化合物，并且這種粉末通過加入水、 生理鹽水或緩沖液可以容易地重組。盡管不需要，但當(dāng)然可以理解為如十分必要，這些常規(guī)的冷凍保護(hù)劑可以加入到本發(fā)明的配方中。

根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，提供了一個形成極為細(xì)小的亞微米顆粒(納米顆粒)， 即直徑小于200納米的顆粒的方法。這種顆粒在以液體混懸液方式使用之前能進(jìn)行無菌過濾。本發(fā)明配制過程所得最終產(chǎn)品(即藥物顆粒)能無菌過濾是有重要意義的，因為不可能用常規(guī)方法如壓熱器對含高濃度蛋白質(zhì)(例如，人血清白蛋白)的混懸液進(jìn)行滅菌。所述包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒在制藥中的應(yīng)用，該蛋白納米顆粒可以用于胃腸道給藥和非胃腸道給藥所用。該蛋白納米顆粒的制劑形式可以是固體劑型、半固體劑型、液體劑型以及氣體劑型，包括凍干粉、膠囊劑、顆粒劑、軟膏劑、糊劑、混懸劑、注射劑、 噴霧劑、吸入劑等。本項發(fā)明的實施中，許多生物相容性的蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以用來制備蛋白納米顆粒的載體外殼，包裹于紫杉烷類藥物的外部。實際上任何一種蛋白質(zhì)類物質(zhì)，天然的或是人工合成的，只要能根據(jù)需要在其結(jié)構(gòu)內(nèi)含有巰基或二硫鍵，就可以用于在紫杉烷類藥物的周圍形成一層二硫鍵交聯(lián)外殼。巰基或二硫鍵可預(yù)先存在于聚合物結(jié)構(gòu)中或可以通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾導(dǎo)入，例如天然存在的聚合物如蛋白質(zhì)、肽、多核苷酸、多聚糖(如淀粉、纖維素、 葡聚糖、褐藻膠、脫乙酰殼多糖、果膠、透明質(zhì)酸等)、蛋白多糖、脂蛋白等均是用這種修飾的候選者。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)類包括白蛋白(含有35個半胱氨酸)、免疫球蛋白、酪蛋白、月旨蛋白、血紅蛋白(每一個α 2β2單位含有6個半胱氨酸殘基)、溶菌酶(含有8個半胱氨酸殘基)、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶等。其中蛋白質(zhì)、肽、酶、抗體及其它們的混合物是本發(fā)明常規(guī)應(yīng)用的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。目前用于本發(fā)明的優(yōu)選的蛋白質(zhì)類物質(zhì)是白蛋白。例如α-2-巨球蛋白(一種周知的調(diào)理素)，可以用于增強(qiáng)巨噬樣細(xì)胞對載體包裹的紫杉烷類藥物的攝取，或可以促進(jìn)這種載體包裹的紫杉烷類藥物進(jìn)入到肝臟和脾臟。同樣，含有半胱氨酸殘基的合成多肽也是在紫杉烷類藥物的外周形成外殼的蛋白質(zhì)類物質(zhì)的良好的候選者。另外，聚乙烯醇、聚羥乙基異丁烯酸酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等均是化學(xué)修飾(如引入巰基和/或二硫鍵)，和形成外殼(如引起交聯(lián))的良好候選者。所以，計劃用于本發(fā)明實施的這些材料的例子是，含有半胱氨酸殘基和/或二硫鍵的合成多氨基酸；聚乙烯醇，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚羥乙基異丁烯酸酯，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚丙烯酸，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚乙噁唑啉，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚丙烯酰胺，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚乙烯吡咯烷酮，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚二醇，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；聚交酯、聚乙交酯、聚己酸內(nèi)酯，或它們共聚物，經(jīng)修飾后含有自由巰基和/或二硫鍵；以及上述 材料的任何兩種或多種的混合物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供一種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的制備方法，該方法將混懸的紫杉烷類藥物顆粒包封于一種由可生物相容的復(fù)合聚合物殼體內(nèi)，其直徑為納米級。該方法不需要引入任何除乙醇之外的其他有機(jī)溶劑，甚至根本不需要引入有機(jī)溶劑，避免了有機(jī)溶劑(如氯仿，二氯甲烷等)在制劑中的殘留，并且不會產(chǎn)生因添加助溶劑或乳化劑而引起的過敏反應(yīng)，大大提高臨床用藥的安全性；該方法也不需要使用常規(guī)的表面活性劑。該方法提供一種更易形成和更加穩(wěn)定的紫杉烷類藥物納米顆粒，該方法工藝簡單、成本低、操作性強(qiáng)。該方法本發(fā)明同時提供一種能無菌過濾的納米顆粒的制備方法。同時，本發(fā)明提供一種蛋白納米顆粒，該蛋白納米顆粒對于紫杉烷類藥物的載藥量高，可以顯著降低蛋白質(zhì)類物質(zhì)的用量；該蛋白納米顆粒還具備良好的體內(nèi)外穩(wěn)定性，液體制劑在室溫條件下可長時間穩(wěn)定保存，提高用藥方便性和安全性。該方法所獲得的紫杉烷類藥物的納米顆粒具有明顯的血液長循環(huán)和組織、器官靶向性，因此具備更加良好的藥效學(xué)性質(zhì)。綜上所述，本發(fā)明提供一種制備工藝更簡單、性質(zhì)更穩(wěn)定以及更佳的臨床應(yīng)用性質(zhì)的蛋白納米顆粒。該蛋白納米顆粒具有載藥量高、粒徑均勻、穩(wěn)定性好、安全性高等特征。


圖1是熔融法制備紫杉醇白蛋白納米制劑強(qiáng)度粒徑分布圖。(縱坐標(biāo)是強(qiáng)度百分比(％ )，橫坐標(biāo)是粒徑(nm)，圖2、圖7-圖11均類同。)圖2是熔融-溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇白蛋白納米制劑強(qiáng)度粒徑分布圖。圖3是WAXD圖。其中樣品a 紫杉醇粉末，樣品b 凍干人血清白蛋白粉末，樣品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物，樣品d 紫杉醇制劑樣品。圖4是DSC圖。其中樣品a 凍干人血清白蛋白粉末，樣品b 紫杉醇粉末；樣品 c 紫杉醇和白蛋白的物理混合物；樣品d 紫杉醇制劑樣品。圖5是透射電鏡圖。其中樣品a:人血清白蛋白凍干粉末，樣品b:聚乙二醇白蛋白粉末，樣品c 紫杉醇白蛋白納米制劑凍干粉末。圖6是熒光掃描圖。圖中隨著曲線a —h方向，聚乙二醇濃度增加。圖7是多烯紫杉醇白蛋白納米制劑強(qiáng)度粒徑分布圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實施例1通過熔融法作用制備紫杉醇白蛋白納米顆粒將500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。1200毫克聚乙二醇于60°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后， 在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入85毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5% w/v, g/ml，下同)?；旌衔锝?jīng)高速分散器(XHF-1，上海金達(dá)生化儀器廠)預(yù)混1分鐘以形成粗乳，然后轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。高壓均質(zhì)在5000-30，000磅/英寸2的條件下進(jìn)行，將乳劑重復(fù)循環(huán)至少5次，得蛋白納米顆?；鞈乙?，獲得的產(chǎn)品有較濃的乳光。經(jīng)激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結(jié)果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在130-220納米，結(jié)果如圖1所示。蛋白納米顆?；鞈乙涸诓惶砑尤魏卫鋬霰Ｗo(hù)劑的情況下進(jìn)一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構(gòu)成蛋白納米顆?；鞈乙?。重構(gòu)后顆粒的大小與凍干前大致相同。實施例2通過熔融_溶劑揮發(fā)法制備紫杉醇白蛋白納米顆粒將300毫克紫杉醇溶解于6. 0毫升乙醇。900毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升無水乙醇，在45°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入 65毫升人血清白蛋白水溶液中(4.5%w/v)?；旌衔锝?jīng)高速分散器(XHF-1，上海金達(dá)生化儀器廠)預(yù)混1分鐘以形成粗乳，然后轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin 公司)中。乳化在5000-30，000磅/英寸2的條件下進(jìn)行，將乳劑重復(fù)循環(huán)至少6次，得蛋白納米顆粒混懸液，獲得的產(chǎn)品有較濃的乳光，經(jīng)激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結(jié)果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在120-200納米，結(jié)果如圖2所示。蛋白納米顆?；鞈乙涸诓惶砑尤魏卫鋬霰Ｗo(hù)劑的情況下進(jìn)一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構(gòu)成蛋白納米顆?；鞈乙骸Ｖ貥?gòu)后顆粒的大小與凍干前大致相同。實施例3小于200納米的可無菌過濾的紫杉醇白蛋白納米顆粒的制備將500毫克紫杉醇溶解于9. 0毫升乙醇。800毫克聚乙二醇溶于1. 5毫升無水乙醇，在45°C油浴加熱完全熔融后，將紫杉醇溶液加入其中，磁力攪拌直至其完全混合均勻， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，在劇烈攪拌條件下迅速冷卻。真空干燥過夜后，將固體分散體加入97 毫升人血清白蛋白水溶液中(4. 5 % w/v)?；旌衔锝?jīng)高速分散器(XHF-1，上海金達(dá)生化儀器廠)預(yù)混1分鐘以形成粗乳，然后轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)(EmulsiFlex-05，加拿大Avestin公司)中。乳化在10000-40，000磅/英寸2的條件下進(jìn)行，將乳劑重復(fù)循環(huán)至少6次，得蛋白納米顆粒混懸液，獲得的產(chǎn)品有較濃的乳光，經(jīng)激光粒徑儀(NanO-ZS90，英國Malvern公司)測定，結(jié)果得到的紫杉醇白蛋白納米顆粒一般直徑在120-170納米。蛋白納米顆?；鞈乙和ㄟ^一個0. 22微米的微孔濾器進(jìn)行過濾，混濁性或顆粒大小沒有任何改變。紫杉醇含量的HPLC分析顯示超過95%的紫杉醇過濾后可回收，結(jié)果如表 1所示。此方法可提供一種無菌的紫杉醇白蛋白納米混懸液。無菌混懸液在不添加任何冷凍保護(hù)劑的情況下進(jìn)一步凍干48小時，得到的粉狀物可通過添加無菌水或生理鹽水很容易重構(gòu)成蛋白納米顆?；鞈乙?。重構(gòu)后顆粒的大小與凍干前大致相同。表 權(quán)利要求
1.一種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒，其特征在于該蛋白納米顆粒的配方含有下列重量百分比的物質(zhì)0. 1 10%紫杉烷類藥物，0. 1 40%水溶性載體材料，50 90%蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白納米顆粒，其特征在于紫杉烷類藥物選自下列物質(zhì)中的一種或多種紫杉醇，多烯紫杉醇，或者它們的衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白納米顆粒，其特征在于所述水溶性載體材料選自下列物質(zhì)中的一種或多種聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚乙烯氧化物、混合脂肪酸酯、 甘露醇、尿素、海藻酸鈉、羥丙基纖維素鈉、聚丙烯酸樹脂、明膠、羧甲基纖維素鈉；所述蛋白質(zhì)類物質(zhì)是能夠通過巰基和/或二硫鍵交聯(lián)的下列物質(zhì)天然存在或合成的蛋白質(zhì)及其衍生物、合成的蛋白聚合物及其衍生物、天然的或合成的類蛋白及其衍生物，或者它們的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白納米顆粒，其特征在于所述天然存在的蛋白質(zhì)包括白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶；所述合成的蛋白聚合物選自含有游離巰基和/或二硫基修飾的下列物質(zhì)中的一種或多種聚乙醇、聚乙基惡唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚二醇、聚乙交酯、聚己酸內(nèi)酯或其共聚物、合成聚氨基酸。
5.如權(quán)利要求1所述的蛋白納米顆粒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟a.將紫杉烷類藥物與水溶性載體材料制成含有紫杉烷類藥物的水溶性載體固體分散體；b.將所得的固體分散體加入含蛋白質(zhì)類物質(zhì)的水性介質(zhì)中，混合均勻，混合物經(jīng)高剪切條件處理得到包裹了紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；c.將混懸液進(jìn)行干燥或先經(jīng)過無菌過濾再干燥，按所需劑型制成包裹了紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒的固體制劑、半固體制劑或氣體制劑；或者將步驟b得到混懸液直接作為液體制劑或進(jìn)一步制備成其他類型的液體制劑、或?qū)⒒鞈乙焊稍锘蛳冉?jīng)過無菌過濾再干燥后再復(fù)溶制成液體制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述水性介質(zhì)選自注射用水，純水，甘露醇溶液，磷酸鹽水溶液，右旋糖酐溶液，葡萄糖水溶液，氯化鈉水溶液，氨基酸溶液，維生素溶液，碳水化合物溶液，或它們的任意兩種或兩種以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于制備含有紫杉烷類藥物的水溶性載體固體分散體的方法為熔融法、溶劑法、溶劑_熔融法、溶劑_噴霧(冷凍)干燥法、研磨法、 或雙螺旋擠壓法；且這些方法不引入任何有機(jī)溶劑或者任何除乙醇之外的其他有機(jī)溶劑； 優(yōu)選采用溶劑_熔融法；所述高剪切條件是指應(yīng)用同時具備高壓和高切變力的設(shè)備，使混合物達(dá)到高效的混合、粉碎、分散及乳化目的；其中，高壓是指壓力范圍在5000至30000磅 /英寸2，優(yōu)選6000 25000磅/英寸2。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于該蛋白納米顆粒的平均粒徑為20 lOOOnm，優(yōu)選為 20 200nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于干燥方法采用冷凍干燥或噴霧干燥； 無菌過濾采用0. 22 μ m濾器過濾。
全文摘要
本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，公開了一種包裹紫杉烷類藥物的蛋白納米顆粒及其制備方法。該顆粒的配方含有下列重量百分比的物質(zhì)0.1～10％紫杉烷類藥物，0.1～40％水溶性載體材料，50～90％蛋白質(zhì)類物質(zhì)。該方法先將紫杉烷類藥物與水溶性載體材料制成含有紫杉烷類藥物的水溶性載體固體分散體；再將所得的固體分散體加入含蛋白質(zhì)類物質(zhì)的水性介質(zhì)中，混合均勻，混合物經(jīng)高剪切條件處理得到包裹了難溶性藥物的蛋白納米顆粒的混懸液；然后進(jìn)一步制成所需劑型。該蛋白納米顆粒具有載藥量高、粒徑均勻、穩(wěn)定性好、安全性高等優(yōu)點，該方法避免了有毒的有機(jī)溶劑殘留，提高臨床用藥的安全性，且工藝簡單、成本低、操作性強(qiáng)。
文檔編號A61P35/00GK102327230SQ20111029978
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者周建平, 崔蓓, 霍美蓉 申請人:中國藥科大學(xué)