專利名稱：一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌毒素可分為兩類，一類為外毒素(Exotoxin)，它是一種毒性蛋白質(zhì)，是細(xì)菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質(zhì)，產(chǎn)生外毒素的細(xì)菌主要是革蘭氏陽性菌，如白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌；另一類為內(nèi)毒素 (Endotoxin)，它是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的一種脂多糖(Lipoply Saccharide, LPS)和微量蛋白的復(fù)合物，它的特殊性不是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來的一種具有內(nèi)毒素生物活性的物質(zhì)，其化學(xué)成份主要是由0-特異性鏈、核心多糖、類脂A三部分組成。許多生物工程制品由革蘭氏陰性細(xì)菌如E. coli表達(dá)，細(xì)菌破碎后，樣品中會(huì)含有大量的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素對哺乳類動(dòng)物有顯著的致熱性，當(dāng)內(nèi)毒素含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，可能導(dǎo)致較嚴(yán)重的發(fā)熱及過敏性紫癜等副反應(yīng)，因此各國藥審部門均對生物制品中的內(nèi)毒素含量有嚴(yán)格的規(guī)定。由于革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素是一種脂多糖，與細(xì)菌莢膜多糖結(jié)構(gòu)很相似，因此從細(xì)菌性疫苗特別是革蘭氏陰性菌為基礎(chǔ)的莢膜多糖疫苗制品生產(chǎn)中去除內(nèi)毒素十分困難， 目前，常用的分離細(xì)菌莢膜多糖和內(nèi)毒素的方法包括親和層析法、活性炭吸附法、微孔膜分離法，這些方法都難以達(dá)到分離細(xì)菌莢膜多糖和內(nèi)毒素的目的，世界衛(wèi)生組織推薦的在革蘭氏陰性細(xì)菌多糖產(chǎn)品中的內(nèi)毒素的去除工藝為在IOOOOOg離心力的條件下超速離心4到 6個(gè)小時(shí)，但該工藝不但需要價(jià)格昂貴的超速冷凍離心機(jī)，而且一次處理的樣品量受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用莢膜多糖的親水性和內(nèi)毒素的疏水性，采用TritonX-114作為萃取劑，對b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素進(jìn)行進(jìn)行一次或多次萃取，較好地去除莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素含量下降90%，莢膜多糖回收率在85%以上，可有效、簡便地降低細(xì)菌莢膜多糖產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量的一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8 1. 2%v/v，攪拌混合25 35分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于50 60°C條件下，5 15分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動(dòng)離心裝置內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)離心，自動(dòng)離心裝置的轉(zhuǎn)速為3000 5000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為8 12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃?。?br> (4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時(shí)間20 觀小時(shí)，透析去除殘余的 TritonX-114。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，利用莢膜多糖的親水性和內(nèi)毒素的疏水性，采用TritonX-114作為萃取劑，對b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素進(jìn)行一次或多次萃取，較好地去除莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素，采用TritonX-114萃取法，一次萃取使b型流感嗜血桿菌莢膜多糖溶液中的內(nèi)毒素含量下降 90%，莢膜多糖回收率在85%以上，可有效、簡便地降低細(xì)菌莢膜多糖產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。實(shí)施例1
一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為1. 2%v/v，攪拌混合35分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于50°C條件下，15分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動(dòng)離心裝置內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)離心，自動(dòng)離心裝置的轉(zhuǎn)速為3000 轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時(shí)間20小時(shí)，透析去除殘余的 TritonX-114。實(shí)施例2:
一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8%v/v，攪拌混合25分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于60°C條件下，5分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動(dòng)離心裝置內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)離心，自動(dòng)離心裝置的轉(zhuǎn)速為5000 轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為8分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時(shí)間觀小時(shí)，透析去除殘余的 TritonX-114。實(shí)施例3:
一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟
(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為10%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為1. 0%ν/ν，攪拌混合30分鐘；
(2)攪拌混合均勻后，置于55°C條件下，10分鐘后觀察分層情況；
(3)待溶液分層后，置于自動(dòng)離心裝置內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)離心，自動(dòng)離心裝置的轉(zhuǎn)速為4000 轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為10分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃取；
(4)用凝膠法鱟試劑檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；
(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時(shí)間M小時(shí)，透析去除殘余的 TritonX-114。
權(quán)利要求
1. 一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中逐漸加入濃度為8 12%v/v的TritonX-114，直到混合溶液的終濃度為0. 8 1. 2%v/v，攪拌混合25 35分鐘；(2)攪拌混合均勻后，置于50 60°C條件下，5 15分鐘后觀察分層情況；(3)待溶液分層后，置于自動(dòng)離心裝置內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)離心，自動(dòng)離心裝置的轉(zhuǎn)速為 3000 5000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為8 12分鐘，離心完成后收集上清液，完成一次萃??；(4)用凝膠法檢測(3)中所得上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)以上萃取步驟，直至內(nèi)毒素含量小于50 EU/ μ g ；(5)用無熱原的注射用水透析(4)中所得上清液，透析時(shí)間20 28小時(shí)，透析去除殘余的 TritonX-114。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，它包括以下步驟(1)在細(xì)菌莢膜多糖溶液中加入濃度為8～12%v/v的TritonX-114，直到終濃度為0.8～1.2%v/v；(2)混合后置于50～60℃下5～15分鐘；(3)溶液分層后，在轉(zhuǎn)速為3000～5000轉(zhuǎn)/分的裝置內(nèi)離心，收集上清液，完成一次萃取；(4)用凝膠法檢測上清液中內(nèi)毒素含量，重復(fù)萃取，直至內(nèi)毒素含量小于50EU/μg；(5)透析去除殘余的TritonX-114。本發(fā)明提供一種去除細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素的方法，采用TritonX-114，具有萃取后細(xì)菌莢膜多糖中內(nèi)毒素含量下降90%，莢膜多糖回收率在85%以上等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/04GK102504042SQ201110365650
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者關(guān)曉峰, 吳強(qiáng), 張麗鶯, 李靖, 王子龍, 羅力心, 趙丹, 陳庚, 韓煉, 魏新 申請人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司