專利名稱：表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織工程皮膚技術領域，尤其涉及一種以幾丁質膜作為支架培養(yǎng)表皮干細胞構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途。
背景技術：
大面積創(chuàng)面處理離不開覆蓋物，有時甚至需要進行皮膚移植，但自體皮源不足而限制了手術實施?，F有技術的人工皮膚研究中，通常使用表皮細胞、成纖維細胞等終末細胞加入支架材料，以構成有一定生物活性的復合皮，但這類終末細胞，增殖能力較弱，影響修復效果。以往組織工程皮膚的種子細胞中，表皮成分主要是來源于自體或異體的表皮細胞， 雖然不斷改進培養(yǎng)體系，縮短周期或建立表皮細胞株，但尚無突破性進展。真皮種子細胞主要來源于成纖維細胞，取材方便生長速度較快，但功能單一，對構建皮膚附屬器無明顯優(yōu)勢。由于表皮干細胞(印idermis stem cells, ESCs)具有很大的可塑性，是潛在的多能干細胞，在合適條件下可誘導形成汗腺、毛發(fā)和毛囊等皮膚附屬器，從而在解決表皮成分的種子細胞上具有優(yōu)勢。而ESCs的培養(yǎng)及其與載體的結合，是構建組織工程皮膚的關鍵所在。幾丁質膜作為一種生物材料，除了具有良好的組織相容性和生物學性能外，還具有來源廣泛、價格低廉、性質穩(wěn)定及重復性好等優(yōu)點，是構建組織工程皮膚的較好選擇。本發(fā)明人以幾丁質膜作為介質支架，體外與ESCs共同培養(yǎng)，取得了突破性進展，ESCs在幾丁質膜纖維1 2w上形成集落，為ESCs作為種子細胞構建仿生覆蓋物并實現誘導組織再生、功能重建提供了基礎。但仍然存在著以下缺陷幾丁質生物膜材料孔徑較大(500 IOOOnm)、網格不均勻、致密性差，僅適合用于傷口的暫時性覆蓋，不利于細胞的貼附及立體生長，細胞容易遺漏，細胞貼附量有限，從而影響了表皮干細胞分化為表皮細胞的能力，不能很好地促進創(chuàng)面愈合，難以獲得理想的創(chuàng)面修復效果。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種對幾丁質膜進行表面修飾改性后與表皮干細胞共同培養(yǎng)構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，使表皮干細胞在支架材料上均勻地、充分鋪展并具有良好的生長狀態(tài)，以利于表皮干細胞在創(chuàng)面中從毛囊干細胞向表皮細胞分化，并產生毛囊等附屬器，從而獲得理想的創(chuàng)面修復效果，實現病損組織的形態(tài)和結構再生、功能重建。本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現本發(fā)明提供的一種表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法， 采用來源于成體皮膚組織的表皮干細胞與修飾幾丁質膜共同培養(yǎng)制備，包括以下步驟a)表皮干細胞的分離和培養(yǎng)取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預包被的培養(yǎng)瓶內，37°C下靜置10 15min，貼壁細胞即為表皮干細胞(ESCs)；棄去未貼壁的細胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細胞用于實驗；b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質膜b-i)膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮IN NaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原10XPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，無菌蒸溜水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 3mg/ml ；為減少或避免產生氣泡，混合采用吸管上下吸勻的方式進行，如出現氣泡采用離心方式去除；放置15min獲得膠原混合液；b-2)修飾幾丁質膜根據模具，幾丁質膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液，膠原混合液的添加量為0. 2 0. 4ml/cm2幾丁質膜面積，冰上放置30min lh，然后放置在37°C孵育箱45min lh，促進膠體形成；之后在溫度-70 -80°C下預冷20h或過夜，-30 -40°C冷凍真空干燥20 25h ；Co60 5 IOKgy輻照，連續(xù)3 5次交聯并滅菌而獲得修飾幾丁質膜；所述修飾幾丁質膜具有圖案式的均勻網格結構，網格孔徑為2 IOnm ；c)表皮干細胞-修飾幾丁質膜共培養(yǎng)修飾幾丁質膜使用時用培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的表皮干細胞消化后制成細胞懸液，細胞密度為1 X IO6 2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 2 0. 5ml細胞懸液，滴加在修飾幾丁質膜表面，靜置30min Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得表皮干細胞-修飾幾丁質膜仿生皮膚覆蓋物。本發(fā)明可采取如下進一步措施所述步驟b-Ι)中，平衡液的pH為6. 9 7.2 ;1 型膠原可以采用從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原；混合后I型膠原的終濃度為 0. 25 0. 5mg/ml。所述步驟b_2)中，采用Co60 5Kgy輻照，連續(xù)4 5次交聯并滅菌。本發(fā)明以幾丁質膜作為支架材料，經膠原混合液對其進行表面親水性改性，并獲得圖案化表面修飾，材料孔徑較小、網格均勻。與表皮干細胞共培養(yǎng)，細胞貼附量大且密，并且能夠有效調控表皮干細胞的定向分化，從而激發(fā)和誘導組織的自身修復、再生能力，實現病損組織的形態(tài)和結構再生、功能重建。


下面將結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述圖1是本發(fā)明實施例分離ESCs形態(tài)與細胞集落顯微鏡觀察結果；圖2免疫細胞化學檢測表皮干細胞的表面標志CK5、CK19、p63 ；圖3是流式細胞儀檢測ESCs表面標志結果⑶四、CD49d、CD71、CD34 ；圖4是幾丁質膜修飾前后激光共聚焦顯微鏡觀察結果；圖5是修飾幾丁質膜上細胞集落肉眼觀察情況；圖6是幾丁質膜其修飾前后用DiI染色和GFP標記細胞檢測貼附效果的觀察結果；
圖7是掃描電鏡觀察下修飾幾丁質膜上的孔徑及細胞生長情況；圖8是幾丁質膜空白材料在大鼠全厚層缺損動物模型上的體內降解試驗結果；圖9是幾丁質膜以及ESCs-修飾幾丁質膜在裸鼠全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合外觀對照；圖10是幾丁質膜以及ESCs-修飾幾丁質膜修復創(chuàng)面的表皮巢形成對照；圖11是免疫組織化學檢測體內早期表皮干細胞標志⑶34、⑶200表達變化；圖12是免疫組織化學檢測體內早期表皮巢毛囊干細胞主要部位標志⑶34、 CD200 ；圖13是體內實驗表皮干細胞早期標志的蛋白水平0^9、p63、VEGF、DSg3 ；圖14是體內實驗短暫增殖細胞(TAC)標志的蛋白水平CK5、CK10、CK14、CK15 ；圖 15 是定量 PCR 檢測 CD29、p63、VEGF、CK15mRNA 水平及調控因子 micro-203mRNA 水平。
具體實施例方式圖1 圖15所示為本發(fā)明一種表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法的實施例，對幾丁質膜進行表面修飾改性后獲得具有較好相容性的生物材料， 通過體外與表皮干細胞共同培養(yǎng)，構建成類生物仿生皮膚覆蓋物并進行鑒定檢測；然后以此為暫時性敷料進行體內實驗，在裸鼠全層皮膚缺損動物模型上進行原位誘導組織再生， 并定期取材進行各項指標檢測。具體方法如下主要材料來源Defined keratindly SFM培養(yǎng)液(Gibco，10785，美國)；IV型膠原(Sigma，美國)； 小鼠抗大鼠β 1整合素(⑶29)單克隆抗體、小鼠抗大鼠角蛋白CK5、CK10、CK14、CK15、 CK19、小鼠抗大鼠 p63、vEGF、Dsg (均來源于 Canta Cruz，美國)；CD34、CD200 (ABCam，英國)；氨基聯苯胺顯色試劑(DAB，武漢博士德生物有限公司)；幾丁質膜天然生物膜(捷舒美，湖南櫻花生物醫(yī)學有限公司)；定量PCR用酶STOR Green PCR Master Mix(T0Y0B0公司)；RNase-free d Rnase I (Promega) ；MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit (深圳邁新生物有限公司)。實時熒光定量PCR 儀(ABI PRISM 73OOkquence Detection System，美國)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 510META，日本)；掃描電鏡(XL-30型EnvironmentaBcanning Electron Microscope. Philips,荷蘭)。1體外構建表皮干細胞-修飾幾丁質膜仿生皮膚覆蓋物及鑒定檢測1-1表皮干細胞分離和培養(yǎng)清潔級1 3d SD幼大鼠(中山大學實驗動物中心)20只，雌雄不限，體質量15 25g，實驗過程的處置符合動物倫理學標準。取SD幼大鼠全層皮膚(或小兒包皮)，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預包被的培養(yǎng)瓶內，37°C下靜置10 15min，貼壁細胞即為表皮干細胞(ESCs)；棄去未貼壁的細胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細胞用于鑒定檢測和實驗。ESCs的鑒定檢測如下I-I-IESCs形態(tài)學觀察
IV型膠原快速貼附表皮干細胞，培養(yǎng)3 6d后，如圖1所示，倒置顯微鏡下表皮干細胞形成集落，細胞呈圓形或小的多角形，無成纖維細胞混雜(見圖1中a)。表皮干細胞培養(yǎng)1 2w已融合成片，呈鵝卵石樣鋪滿瓶底(見圖1中b相差顯微鏡觀察)。Acridine Orange染色，核漿比例大，細胞核大而圓、居中，呈亮綠色；胞漿少，呈橘紅色，可見集落和核分裂相(見圖1中c激光共聚焦顯微鏡觀察)。1-1-2免疫細胞化學檢測ESCs表面標志細胞CK15、CK19、p63陽性細胞表達采用鏈霉親和素.生物素復合物(SABC)法測定。將細胞爬片放入體積比為30% H2A 100%甲醇=1 10的混合液中，室溫浸泡 IOmin滅活內源性酶，PBS洗滌3次，熱修復抗原、破膜處理、羊血清封閉，分別加入CK15、 CK19、P63單克隆抗體，置濕盒內4°C過夜，次日加入生物素二抗、SABC，二氨基聯苯胺(DAB) 顯色，蘇木素復染封片。如圖2所示，CK15+、CK19+棕色顆粒在細胞質表達，p63+棕色顆粒在細胞核表達。 CK15和CK19是細胞早期分化過程表達的角蛋白。p63為轉錄因子，是p53基因家族成員， 對ESCs生物性能維持和增殖分化起著決定性作用。1-1-3流式細胞儀檢測ESCs表面標志及細胞周期用流式細胞儀檢測⑶29、⑶49d、⑶71、⑶34，取培養(yǎng)的ESCs，消化離心獲取細胞懸液，將細胞濃度調整為3X105/ml，分別與一抗室溫反應30min，PBS液洗滌兩次，分別與 FITC標記或PE標記的二抗避光作用30min，用PBS液重懸細胞置于冰上，然后進行流式細胞儀檢測。如圖3所示，其陽性表達率分別為β 1整合(⑶29)為99. 06 %、CD49d為87. 74 %、 CD71為23. 11%、⑶34為1.34%。當陽性細胞數低于30%時視為表達陰性，因此本實施例分離的ESCs表達⑶29、⑶49d，不表達⑶71、⑶34，是一組高增殖低分化的表皮干細胞群。 細胞周期檢測98%細胞留在GO-Gl期。1-2采用膠原混合液修飾幾丁質膜1-2-1膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮IN NaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原IOXPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，如 5mg/ml I 型膠原10XPBS IN NaOH = 1 0. 5 0. 1，無菌蒸餾水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 3mg/ml，以0. 25 0. 5mg/ml為宜，如0. 5mg/ml ；采用吸管上下吸勻的方式混合，如出現氣泡采用離心300gX IOmin去除；放置15min獲得膠原混合液；其中I型膠原可采用從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原，如鼠I型膠原。1-2-2修飾幾丁質膜幾丁質膜面積5cmX5cm，雙層十字型放置在同等面積的模具上，每個模具加入膠原混合液5ml ；冰上放置lh，然后放置在37°C孵育箱lh，促進膠體形成；之后在溫度_80°C 下預冷20h或過夜，-40°C真空干燥25h ；Co60 5Kgy輻照，連續(xù)4次交聯并滅菌而獲得修飾幾丁質膜。激光共聚焦顯微鏡下觀察，如圖4所示，幾丁質膜經鼠I型膠原混合液表面修飾后，孔徑有了根本變化，孔徑小而致密。經凍干消毒后，表面結粉較薄，網孔均勻，更適合細胞生長。掃描電鏡下可見修飾后的幾丁質膜形成圖案式的均勻網格結構，網格孔徑約2 IOnm (見圖 7A)。1-3表皮干細胞-修飾幾丁質膜共培養(yǎng)將修飾幾丁質膜裁制成IOmmX IOmm/塊，培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的ESCs消化后制成細胞懸液，細胞密度為2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 5ml細胞懸液，滴加在修飾幾丁質膜表面，靜置Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2 培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得ESCs-修飾幾丁質膜仿生皮膚覆蓋物，用于檢測或動物實驗。如圖5所示，1 2w在修飾幾丁質膜上形成肉眼可見棋盤樣細胞集落。如圖6所示，激光共聚焦顯微鏡觀察材料的孔徑發(fā)生了根本變化，修飾前幾丁質膜材料的孔徑大，細胞貼附少；而本實施例修飾幾丁質膜材料孔徑小，細胞密而均勻，表層掃描顯示材料已被細胞遮擋，中層可見原幾丁質膜纖維，顯示表皮干細胞具有良好的生長狀態(tài)。如圖7B所示，掃描電鏡下可見修飾后的幾丁質膜具有圖案式的均勻網格結構，網格孔徑為2 lOnm.，表皮干細胞直徑是15 20nm，在均勻網格上充分鋪展，分泌的細胞外基質與膠原網格交織成片(見圖7C)。2體內裸鼠全層皮膚缺損動物模型的原位誘導組織再生實驗2-1建立大鼠全厚層缺損動物模型以及幾丁質膜空白材料體內降解試驗選用健康大鼠動物12只(來源于廣東省實驗動物中心)，每時間點2只。以50mg/ kg 0.6%戊巴比妥鈉麻醉，剃去背部毛，稱重。消毒，用利刀在背脊柱的兩側肌肉豐滿處各切長約2cm的小口，深至皮下，形成機械損傷動物模型。3面切口呈“U”形，留一邊不切游離出皮膚。面積約2cmX2cm，距脊柱旁開1. 5cm，每只大鼠創(chuàng)面分左右兩側，左上側實驗組 幾丁質膜空白材料，每個傷口植入Icm2的幾丁質膜空白材料，三面縫合；右下側對照假手術組，沒有材料。上下創(chuàng)面間隔約3cm。造模后大鼠傷口暴露，單籠飼養(yǎng)。lw、2w、#、6w、8w、 IOw取材，石蠟包埋，H&E染色。如圖8所示，2 #幾丁質膜組有炎癥包塊，幾丁質膜纖維在6 8w被降解為短桿樣，被結締組織包裹，IOw時基本降解。與對照組比較，鏡下的差別不明顯。體外觀察及手感修復處有包塊，隨時間逐漸變軟。2-2表皮干細胞-修飾幾丁質膜在裸鼠全層皮膚缺損模型原位誘導表皮再生選用健康裸鼠動物12只，同上麻醉、消毒，距脊柱旁開1. 5cm，左右兩側左上側實驗，右下側對照，上下創(chuàng)面間隔約3cm，切口約IcmX Icm,全層皮膚切除，深至皮下，暴露筋膜，造成全層皮膚缺損模型。左上側每個傷口植入Icm2的ESCs-修飾幾丁質膜作為實驗組；右下側每個傷口植入Icm2的無細胞未修飾的幾丁質膜作為對照組。四角縫合，加壓包扎。術后單籠飼養(yǎng)，于 dl、d3Uw,2w,4w,6w取材H&E染色，觀察傷口修復的組織學變化。如圖9所示，裸鼠動物全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合顯示，對照組形成的創(chuàng)面修復較薄、淡紫色、容易破裂出血。實驗組形成的創(chuàng)面修復較厚、紅潤，有皮紋；組織包埋切片、H&E染色發(fā)現修復皮膚的結締組織中，表皮巢和小血管的形成有規(guī)律的增多假手術組 <幾丁質膜< ESCs-修飾幾丁質膜(見圖10)。2-3定期取材進行各項指標檢測2-3-1免疫組織化學檢測體內表皮干細胞標志表達
中性福爾馬林固定、石蠟包埋、常規(guī)組織切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化， 浸泡于蒸餾水中待用；PH6. 0檸檬酸緩沖液120°C高溫高壓修復2分鐘，取出自然冷卻至室溫，蒸餾水沖洗2次，PBS(pH = 7. 2 7. 4)沖洗;3minX3次；為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，每張切片加入50 μ L過氧化酶阻斷劑(Endogenous peroxidase blocking solution)室溫中孵育lOmin，蒸餾水沖洗，PBS沖洗3minX3次；除去PBS每張切片加1滴或50 μ L—抗工作液(1 100)，4°C下過夜。？85沖洗511^11\3次；滴加5(^1^ MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit 試劑室溫孵育 20 分鐘，PBS 沖洗，3minX3次；除去PBS液每張切片加入2滴或100 μ L新鮮配制的DAB顯色劑顯色3 15min ；自來水充分沖洗、蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封固。⑶34是血管內皮細胞的表型標記，人表皮干細胞在體外和體內實驗表達陰性，但在鼠表皮干細胞表達陽性，故也是鼠表皮干細胞和血管內皮細胞的標志之一。如圖11所示，實驗組⑶34陽性表達主要在基底層的濾泡性上皮，出現在手術后d3，從d5 #，保持高表達，到6w后減弱。而對照組(無ESCs的空白幾丁質膜)是出現在#后。結果顯示， 表皮干細胞在修飾幾丁質膜上生長良好，在^之前高度增殖，但未分化，維持其表皮干細胞的特征。⑶200是近年來發(fā)現的一個表皮干細胞的標志，大部分慢周期標記殘留細胞位于毛囊隆突(bluge)部，即豎毛肌毛囊附著處與皮脂腺開口之間的毛囊外根鞘(outer root sheath, 0RS)中。如圖11所示，實驗組⑶200陽性表達出現在手術后d3，定位在毛囊表皮干細胞，從d3持續(xù)6w，提示表型維持時間較長；對照組陽性出現在(17, 減弱，提示細胞分化開始，失去表型。表皮巢是毛囊細胞的不同橫切面，如圖12所示，⑶34表達在毛球部有較強的陽性，⑶200表達在外毛根鞘。2-3-2ffestern blot檢測ESCs-修飾幾丁質膜皮膚修復過程的表皮干細胞的早期蛋白表達維持蛋白質結構，需要穩(wěn)定的三維結構。⑶^、p63、VEGF、Dsg3是表皮干細胞早期標志，顯示未分化狀態(tài)。如圖13所示，本實施例VEGF-A在d7有高表達，提示早期有血管形成，dl4下降至正常，不會由于大量VEGF-A產生引起癌變。2-3-3ffestern blot檢測ESCs-修飾幾丁質膜皮膚修復過程的短暫增殖細胞 (TAC)的蛋白表達表皮干細胞在分化過程中，形成表皮干細胞-短暫增殖細胞(TAC)-角脘細胞的分化過程。TAC增多，說明表皮干細胞分化開始。如圖14所示，本實施例CK5、CK10、CK14、 CK15等短暫增殖細胞標志顯示實驗組與對照組(無ESCs的空白幾丁質膜)無顯著性差別， 表明ESCs在修飾幾丁質膜上顯示增殖未分化狀態(tài)，具有良好的生長狀態(tài)。2-3-4qRT-PCR 檢測 ESCs-修飾幾丁質膜皮膚修復過程的 CD29、CK15、p63、VEGFA mRNA表達水平以及調控因子microRNA-203變化(l)Q^9、CK15、p63、VEGFA mRNA 表達水平為了評估早期修復時ESCs-修飾幾丁質膜的基因水平變化，同上裸鼠動物全層皮膚缺損模型延長時間點dl-d42。術后定時取材，總RNA抽提；使用RNase-free 的DNaseI (Promega)去基因組，按說明書體系配置反應液，37 °C消化30min，65 V滅活IOmin ；總RNA純度和完整性檢測；逆轉錄后進行定量PCR 內參片段18SrRNA_112bp， 目的片段CD29-357bp CK15_271bp CK19_171bp p63_383bp VEGFA_240bp。 引物 設計CD29_F 5' acaagagtgccgtgacaa 和 qm_CD29-R 5' attggcactagcagtgtc ； CK15 — F 5 ‘ attcagcagtcaactggct 禾口 CK15 — R 5 ‘ gagctgagactgc ￡1 ￡1 C C ￡1 CK19-F 5 ‘ cagctcagcatgaaagct 禾口 CK19-R 5‘ gatgtccatgagctgctt ；p63_F 5 ‘ aagctgagcatgtcaccga 禾口 p63_R 5 ‘ tctgatgctgtcttcatctg ； qm-VEGFA-F 5，atgccggttccaaccagaa 禾口 VEGFA-R :5，gtggaggagcgagctgaa。 反應 體系 cDNA(l 25)5. 0 μ 1，10 μ M 上游引物 0.5 μ 1，10 μ M 下游引物 0.5 μ l，2x SYBR Green PCR Master Mix 10 μ 1, dH20 4. 0 μ 1，總體積為 20 μ 1。反應條件預變性 95°C lOmin，變性 95°C 15s，退火60°C 15s,延伸72°C 30s，循環(huán)40次后讀板，融解曲線分析溫度60°C -95°C， 每分鐘讀1次。 采用裸鼠自體對照，定量PCR檢測基因水平表皮干細胞在早期參與修復變化， ESCs-修飾幾丁質膜實驗組與沒有ESCs的空白幾丁質膜對照組比較，如圖lfe-e所示，d3 時，實驗組整合素⑶四、毛囊干細胞的標志CK15、轉錄因子p63、血管生長因子A(VEGFA) mRNA水平均有高表達。以CK15持續(xù)高表達最明顯d3升高3倍，d5升高4. 5倍，d28升高到40倍，d42還能保持2. 5倍。
(2) microRNA-203 變化同上方法同時取標本檢測microRNA-203變化，引物設計hsa-microRNA-203F :5， ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTAGGACCA 和 hsa-microRNA_203R :5’ CTCAACTGGTGTCGTGGA,內參片段U6-F :5，CTCGCTTCGGCAGCACA 和 U6-R :5，AACGCTTCACGAATTTGCGT。microRNA-203是表皮干細胞分化的調控基因，如表皮基底層細胞過表達 microRNA-203會導致基底層細胞過早分化并失去增殖潛能，microRNA-203調節(jié)p63是通過翻譯抑制，有較強抑制的P63蛋白表達。本實施例表明實驗組p63mRNA在d3時與對照組比較升高了 5倍，并維持到d28(見圖15b)；如圖15f所示，microRNA-203mRNA在d3時與對照組比較無差別，到業(yè)8時對照組micrORNA-203mRNA升高，比實驗組高出8. 7倍，顯示 microRNA-203在d28時ESCs-修飾幾丁質膜實驗組與無細胞的幾丁質膜組比較有明顯的統(tǒng)計學差異，P < 0. 05，提示對照組ESCs開始分化，而實驗組仍然維持ESCs增殖未分化狀態(tài)，表明ESCs在修飾幾丁質膜上具有良好的生長狀態(tài)，在創(chuàng)面修復中起著重要的作用。microRNA-203是在表皮分化和發(fā)育過程中大量表達并且進化保守的miRNA， microRNA-203是以ANp63mRNA為靶目標，在成體表皮細胞的角質形成細胞增殖和分化過程中充當開關，因此microRNA-203是一個關鍵分子，控制角質形成細胞從基態(tài)到基底層分化。microRNA-203缺失后，表皮上基部的p63翻譯將升高，microRNA-203過表達ΔΝρ63的 mRNA降低。統(tǒng)計學處理實驗數據采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件分析進行ANOVA Oneway方差分析， 以P <0.05為有統(tǒng)計學意義。3結論和效果生物誘導性材料通過表面或界面與細胞直接接觸，材料的表面特性是調控干細胞增殖與分化的重要因素。本實施例幾丁質膜經表面親水性改性的同時，獲得圖案化表面修飾，材料的孔徑較小、網格均勻，細胞貼附量大且密。圖案化表面修飾影響著細胞與細胞、細胞與細胞外基質、細胞與可溶性因子的相互作用，進而影響了干細胞分化，從而有效調控干細胞行為。本實施例通過材料在體內形成特殊的“生物仿生修飾表面”及局部微環(huán)境，實現細胞外基質、細胞因子等活性物質的分配和重組，從而介導材料與細胞的作用。體外實驗結果表明幾丁質膜經膠原混合液修飾后，表皮干細胞在膜表面高度鋪展，細胞外基質分泌旺盛，增殖速度明顯增大。體外培養(yǎng)2 3w后，90%表皮干細胞仍保持其表型的未分化狀態(tài)，并依然具有分化潛能。體內實驗表明在全層皮膚缺損部可見表皮層與真皮層的重建， 毛囊干細胞增多，修復創(chuàng)面皮膚較厚、紅潤、有皮紋。3 5d早期蛋白轉錄水平、蛋白合成比對照組高，短暫增殖細胞沒有增加，業(yè)8后無ESCs的空白幾丁質膜覆蓋的創(chuàng)面上的檢測 microRNA-203標志顯示細胞已經開始分化，失去增殖潛能，但有ESCs的修飾幾丁質膜覆蓋的創(chuàng)面還能繼續(xù)保持表皮干細胞增殖，最終修復的效果出現類正常皮膚的皮紋，并有類毛孔的結構出現。本實施例ESCs-修飾幾丁質膜適合早期表皮干細胞增殖。修飾幾丁質膜起誘導作用，表皮干細胞ESCs在修飾幾丁質膜生長是以毛囊干細胞生長為主，毛囊干細胞分化成表皮細胞及皮膚附屬組織，完成表皮與真皮修復，而不需要分開構建表皮層和真皮層的組織工程皮膚，用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復。本實施例通過對表皮干細胞所處微環(huán)境的結構和功能模擬實驗，構建仿細胞外基質和信息分子的生物誘導性材料，有效調控表皮干細胞的定向分化，從而激發(fā)和誘導組織的自身修復、再生能力，實現病損組織的形態(tài)和結構再生、功能重建，對臨床創(chuàng)面(如燒傷、 皮膚創(chuàng)傷、糖尿病足等)的修復具有重要意義。
權利要求
1.一種表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于采用來源于成體皮膚組織的表皮干細胞與修飾幾丁質膜共同培養(yǎng)制備，包括以下步驟a)表皮干細胞的分離和培養(yǎng)取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用IV型膠原預包被的培養(yǎng)瓶內，37°C下靜置10 15min，貼壁細胞即為表皮干細胞；棄去未貼壁的細胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細胞用于實驗；b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質膜b-Ι)膠原混合液的制備在冰上進行如下操作將無菌10XPBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮INNaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml I型膠原10XPBS IN NaOH = 0. 5 1. 5 0. 25 0. 75 0. 05 0. 15，無菌蒸溜水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 ;3mg/ml ；放置15min獲得膠原混合液；b-2)修飾幾丁質膜根據模具，幾丁質膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液， 膠原混合液的添加量為0. 2 0. 4ml/cm2幾丁質膜面積，冰上放置30min lh，然后放置在37°C孵育箱45min lh，促進膠體形成；之后在溫度_70 -80°C下預冷20h或過夜，-30 -40°C冷凍真空干燥20 25h ；Co60 5 IOKgy輻照，連續(xù)3 5次交聯并滅菌而獲得修飾幾丁質膜；c)表皮干細胞-修飾幾丁質膜共培養(yǎng)修飾幾丁質膜使用時用培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的表皮干細胞消化后制成細胞懸液，細胞密度為1 X IO6 2X IO6個/ml，表面種植濃縮為0. 2 0. 5ml細胞懸液，滴加在修飾幾丁質膜表面，靜置30min Ih后，加入含5 10%胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1 2w，隔天換液，獲得表皮干細胞-修飾幾丁質膜仿生皮膚覆蓋物。
2.根據權利要求1所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，所述平衡液的pH為6. 9 7. 2。
3.根據權利要求1所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，混合后I型膠原的終濃度為0. 25 0. 5mg/ml。
4.根據權利要求1或3所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，I型膠原為從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原。
5.根據權利要求1所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-Ι)中，I型膠原與平衡液的混合采用吸管上下吸勻的方式進行溫和混合，如有氣泡采用離心方式去除。
6.根據權利要求1所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-幻中，采用Co60 ^igy輻照，連續(xù)4 5次交聯并滅菌。
7.根據權利要求1所述的表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于所述步驟b-幻中，修飾幾丁質膜具有圖案式的均勻網格結構，網格孔徑為.2 10nm。
8.權利要求1-7之一所述表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建的仿生皮膚覆蓋物，其特征在于用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，采用來源于成體皮膚組織的表皮干細胞與修飾幾丁質膜共同培養(yǎng)制備，即對幾丁質膜支架材料進行表面修飾改性后與表皮干細胞共同培養(yǎng)，使表皮干細胞在修飾幾丁質膜上均勻地、充分鋪展并具有良好的生長狀態(tài)，以利于表皮干細胞在創(chuàng)面中從毛囊干細胞向表皮細胞分化、并產生毛囊等附屬器，完成表皮與真皮修復，從而獲得理想的創(chuàng)面修復效果，實現病損組織的形態(tài)和結構再生、功能重建，用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復，對臨床創(chuàng)面的修復具有重要意義。
文檔編號A61L27/60GK102294055SQ20111023234
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月15日 優(yōu)先權日2011年8月15日
發(fā)明者戴麗冰, 李孝建, 梁蓉, 沈雁 申請人:戴麗冰, 李孝建, 梁蓉, 沈雁