專利名稱：一種治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物靶標(biāo)及其抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白血病治療的藥物制備，更具體地講，涉及一種治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物靶標(biāo)及其抑制劑。
背景技術(shù)：
白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。其中，急性髓系白血病 (acute myeloid leukemia,AML)由于起病急、病死率高等特點(diǎn)而受到更為廣泛的重視。另一方面，由于白血病取材方便，并且易于觀察療效，有關(guān)AML發(fā)病學(xué)和治療學(xué)的研究在過去十多年中取得的進(jìn)展令人矚目。人們相信，未來腫瘤治療學(xué)上的突破很有可能首先源自于對白血病的研究。AML是以髓系前體細(xì)胞分化受阻在不同時期為特點(diǎn)，依法美英協(xié)作組診斷標(biāo)準(zhǔn)(FAB標(biāo)準(zhǔn))分為Ml M7幾個亞型。例如，M3型急性髓系白血病亦稱急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是一類以t (15 ；17)染色體易位和表達(dá)PML-RARa融合蛋白，并發(fā)育阻滯于粒系分化的早幼粒階段為特征的惡性腫瘤細(xì)胞。融合蛋白PML-RARa被認(rèn)為是APL發(fā)病的直接原因，也作為治療APL的重要的藥物靶點(diǎn)。
二十世紀(jì)80年代中期，我國學(xué)者在國際上首先成功地應(yīng)用ATRA治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病APL獲得成功，并成為當(dāng)今治療APL病人的首選策略。無疑，作為誘導(dǎo)分化治療的成功典范，它為惡性腫瘤的治療開辟了新的途徑。ATRA治療APL的分子機(jī)制是通過作用于致病融合蛋白PML-RARa，使之發(fā)生降解，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，清除白血病克隆，進(jìn)而達(dá)到治療APL的目的。雖然ATRA可誘導(dǎo)絕大多數(shù)APL病人達(dá)臨床完全緩解，但如僅用ATRA 維持治療幾乎所有病人在完全緩解后短期內(nèi)復(fù)發(fā)，并產(chǎn)生對ATRA的耐藥性。另一方面，目前誘導(dǎo)分化治療的成功實(shí)踐主要限于APL治療。因此，尋找新的藥物靶標(biāo)和新型的藥物來克服全反式維甲酸耐藥一直成為人們追求的目標(biāo)。
Peroxiredoxins (Prxs)是新近發(fā)現(xiàn)的抗氧化酶系,廣泛存在于各種生物體內(nèi)。哺乳動物的Prxs家族包括6個成員，即Prx1、I1、II1、IV、V和VI。它們除了共同的抗氧化功能外，還具有其他功能如參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與保護(hù)其他蛋白的氧化等。 Prxs與腫瘤關(guān)系密切，其在很多實(shí)體瘤及白血病中高表達(dá)，它作為一種腫瘤標(biāo)記物為腫瘤的治療提供了新的思路。同時Prxs也作為腫瘤治療的一個潛在的靶標(biāo)，引起廣泛的關(guān)注。
從我國云南一種稱為腺花香茶菜植物中，我們提取到一種小分子二萜類化合物， 腺花素(Adenanthin)。腺花素是一種植物中天然存在的化合物，具有較高的安全性。腺花素類的化合物如毛萼乙素、冬凌草甲素在以往的研究中已應(yīng)用在腫瘤、炎癥等方面疾病的防治中，因此容易為市場所接受。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物靶標(biāo)及其抑制劑。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案=Peroxiredoxin I或者II作為靶標(biāo)在體外篩選治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物的用途，所述急性早幼粒細(xì)胞白血病是指全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病。
腺花素及其衍生物用作制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物的用途，所述急性早幼粒細(xì)胞白血病是指全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病。
腺花素及其衍生物用作制備Peroxiredoxin I或者II抑制劑的用途。
所述衍生物是指C3羥基上氫的取代或者C3上羥基的取代，所述C3羥基上氫的取代用選自甲基(methyl)，乙?；?acetyl)，甲氧基甲基(MOM)，甲硫基甲基(MTM)，對甲氧基芐基(PMBM)，芐基(benzyl)，叔丁氧基甲基(t_Bu0CH2)，2-(三甲硅基)乙氧甲基(SEM)， 四氫吡喃基(THP)，烯丙基(allyl)，叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)，三乙基硅烷(TES)，三甲基硅烷(TMS)，對甲基苯磺酰氯(Ms)，叔丁基(t-Bu)，3，4-二甲氧基芐基(DMPM)，三苯甲基(Tr)，三異丙基硅基(TIPS)，二甲基異丙基硅(IPDMS)，二乙基異丙基硅(DEIPS)，1，1， 2-三甲基丙基二甲基硅(TDS)，叔丁基二苯基硅(TBDPS)，二苯甲基硅(DPMS)，三苯基硅 (TPS)，對甲苯磺酰基(Ts)或者對三氟甲磺基(Tf)中的一個基團(tuán)取代；所述C3上羥基的取代，用氨基(-NH2)取代,然后對于氨基用選自乙?；?acetyl),荷甲氧羰基(Fmoc),叔丁氧羰基(Boc)，對甲基苯磺酰氯(Ms)，對甲苯磺酰基(Ts)，對三氟甲磺基(Tf)或者丁酸 (butyricacid)基團(tuán)中的一個基團(tuán)取代。
提供Prx 1/11(本文中的“/”代表“或者”)在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用， 通過將Prx I/II作為藥物靶標(biāo)，來篩選抑制Prx I/II酶的活性、從而對白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。本發(fā)明篩選出腺花素用于實(shí)現(xiàn)對急性早幼粒白血病細(xì)胞的分化作用，從而表現(xiàn)出顯著的治療全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病的作用。所述急性早幼粒白血病細(xì)胞是指NB4細(xì)胞(全反式維甲酸敏感)，及全反式維甲酸耐藥的NB4來源細(xì)胞和 HL-60細(xì)胞(全反式維甲酸敏感)等。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的腺花素安全低毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。本發(fā)明的腺花素活性物質(zhì)具有容易吸收、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，更加適合作為新型藥物、食物、保健品或膳食添加劑進(jìn)行開發(fā)。


圖1A顯示NB4細(xì)胞在應(yīng)用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，通過相差顯微鏡、瑞氏吉姆薩染色檢測細(xì)胞形態(tài)及硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)反映分化狀態(tài)。*代表與無關(guān)序列敲除組比較，P <0.01 ;圖川顯示NB4細(xì)胞在應(yīng)用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后， 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分化抗原⑶llb/c。*代 表與無關(guān)序列敲除組比較，P < O. 01 ;圖1C顯示NB4細(xì)胞在應(yīng)用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染4天后,96孔板中接種相同細(xì)胞數(shù)， 48小時后CCK-8檢測細(xì)胞的增殖情況；圖1D顯示NB4細(xì)胞在應(yīng)用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的分布。*代表與無關(guān)序列敲除組比較，P <0.01 ； 圖1E顯示NB4細(xì)胞在應(yīng)用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染后，收取對應(yīng)時間點(diǎn)的細(xì)胞，免疫印跡法檢測C/ΕΒΡβ、Prx I和Prx II蛋白水平，以β -tubulin作為內(nèi)參。以上結(jié)果(圖 1A-E)提示敲除Prx I/II可以直接抑制細(xì)胞增殖并且促進(jìn)NB4細(xì)胞分化。
圖2A顯示全反式維甲酸耐藥的NB4-MR2和NB4-LR2細(xì)胞在利用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，瑞氏吉姆薩染色檢測細(xì)胞形態(tài)；圖2B顯示全反式維甲酸耐藥的 NB4-MR2和NB4-LR2細(xì)胞在利用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，細(xì)胞硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)檢測分化。*代表與無關(guān)序列敲除組比較，P < O. 01 ;圖2C顯示全反式維甲酸耐藥的NB4-MR2和NB4-LR2細(xì)胞在利用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，免疫印跡法檢測C/ΕΒΡβ、Prx I和Prx II蛋白水平，以β -tubulin作為內(nèi)參。以上結(jié)果(圖2A-C)提示敲除Prx I/II可以直接促進(jìn)全反式維甲酸耐藥的NB4-MR2和NB4-LR2細(xì)胞分化。
圖3A腺花素及其4個衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖3B利用體外重組的Prx I，建立Prx I 體外酶活性檢測系統(tǒng)篩選Prx I的抑制劑，不同濃度的腺花素預(yù)處理I個小時，100 μ M H2O2 處理20分鐘，340納米檢測底物NADPH的吸收峰，結(jié)果顯示腺花素呈劑量依賴性的抑制PrxI的活性；圖3C顯示腺花素及其4個衍生物5 μ M預(yù)處理I個小時，100 μ M H2O2處理20分鐘，340納米檢測底物NADPH的吸收峰，結(jié)果提示C (16) -C (17)為腺花素的活性中心，其參與腺花素抑制Prx I的活性，且C (3)的羥基修飾的衍生物仍然保留抑制Prx I的活性；圖3D 顯示2 μ M腺花素處理ΝΒ4細(xì)胞，不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平。結(jié)果提示腺花素在細(xì)胞內(nèi)也能抑制Prx I的活性進(jìn)一步上調(diào)H2O2的水平。
圖4Α顯示生物素標(biāo)記腺花素在體外與重組的Prx I和Prx II孵育30分鐘， 10倍濃度未標(biāo)記的腺花素作為冷探針競爭，經(jīng)SDS-PAGE電泳，免疫印跡法檢測生物素標(biāo)記腺花素、Prx I和Prx II，結(jié)果顯示生物素標(biāo)記腺花素在體外與重組的Prx I和Prx II能直接相互作用；圖48顯示10 μ M生物素標(biāo)記腺花素處理ΝΒ4細(xì)胞3個小時，利用 steptavidin-FITC和抗Prx I抗體檢測生物素標(biāo)記腺花素和Prx I突光共定位。結(jié)果提示生物素標(biāo)記腺花素與Prx I在細(xì)胞內(nèi)存在共定位；圖4C顯示重組的Prx I和腺花素體外反應(yīng)30分鐘，質(zhì)譜分析腺花素與Prx I的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果提示Hgevc173Pagwk肽段中的半胱氨酸被腺花素所修飾；圖4D體外重組Prx I的四個半胱氨酸突變體及Prx II的三個半胱氨酸突變體，生物素標(biāo)記腺花素體外與重組的Prx I和Prx II及其半胱氨酸突變體孵育30 分鐘，經(jīng)SDS-PAGE電泳，免疫印跡法檢測生物素標(biāo)記腺花素、Prx I和Prx II，提示生物素標(biāo)記腺花素在體外與重組的Prx I的C173和Prx II的C172能直接相互作用。
圖5Α顯示2 μ M腺花素，I μ M全反式全反式維甲酸處理ΝΒ4細(xì)胞5天，通過相差顯微鏡、瑞氏吉姆薩染色檢測細(xì)胞形態(tài)及硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)反映分化狀態(tài)；圖5Β顯示 2 μ M腺花素處理ΝΒ4細(xì)胞1-5天，I μ M全反式全反式維甲酸處理ΝΒ4細(xì)胞5天，流式細(xì)胞儀·檢測細(xì)胞表面分化抗原⑶Ilb/c ;圖5(顯示2 4 11腺花素處理他4細(xì)胞1-5天，I μ M全反式全反式維甲酸處理ΝΒ4細(xì)胞5天，real-time PCR檢測分化相關(guān)基因的表達(dá)。以上結(jié)果 (圖5A-C)提示Prx I/II的抑制劑腺花素可以模擬敲除Prx I/II誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化；圖顯示2 μ M腺花素，I μ M全反式全反式維甲酸處理全反式維甲酸耐藥的NB4-LR1、NB4-MR2 和NB4-LR2細(xì)胞5天，瑞氏吉姆薩染色后細(xì)胞形態(tài)；圖5Ε顯示2 μ M腺花素，I μ M全反式全反式維甲酸處理全反式全反式維甲酸耐藥的NB4-LR1、NB4-MR2和NB4-LR2細(xì)胞5天，以硝基藍(lán)四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)檢測細(xì)胞分化。以上結(jié)果(圖OT-E)提示Prx I/II的抑制劑腺花素可以模擬敲除Prx I/II誘導(dǎo)全反式維甲酸耐藥細(xì)胞分化；圖5F顯示2 μ M腺花素處理 ΝΒ4和NB4-LR2細(xì)胞5天，收取對應(yīng)時間點(diǎn)的細(xì)胞，免疫印跡法檢測C/EBP β蛋白水平，以 β-actin和β-tubulin作為內(nèi)參；圖5G顯示2 μ M腺花素處理NB4細(xì)胞5天，收取對應(yīng)時間點(diǎn)的細(xì)胞，real-time PCR檢測C/EBP β的mRNA水平。以上結(jié)果(圖5F-G)提示腺花素和敲除Prx I/II通過上調(diào)C/EBP β進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
圖6Α利用本實(shí)驗(yàn)室全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病(APL移植模型。白血病小鼠分為三組，移植后第二天分別給予試劑對照處理、5mg/kg 腺花素處理(靜脈給藥)和10mg/kg全反式維甲酸處理(腹腔給藥)。連續(xù)給藥5天，休息2天，當(dāng)試劑對照處理組小鼠開始死亡，停止給藥，所有組小鼠處死，外周血涂片，骨髓血涂片觀察白血病細(xì)胞浸潤的情況；圖6B處理同前，肝臟病理切片，HE染色。以上結(jié)果(圖 6A-B)提示腺花素處理能明顯減輕全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病細(xì)胞的浸潤；圖6C處理同前，每組小鼠的骨髓細(xì)胞，去除Seal，⑶45/B220，⑶19，⑶8， 和 CD4 陽性的細(xì)胞后，標(biāo)記 CD34，c-kit，F(xiàn)cyRIII/II, Gr_l，分析 CD34+，c_kit+(P2 區(qū))， CD34、c-kit-(P3 區(qū))中 Fe γ RII I/I I+，Gr-1int 細(xì)胞的表達(dá)情況，CD34+，c_kit+，F(xiàn)e Y RII I/ II+, Gr-1int 為 APL 起始細(xì)胞，CD34_，c_kit_，F(xiàn)e y RIII/II+，Gr-1int 為分化成熟的髓系細(xì)胞。 結(jié)果顯示腺花素處理能明顯減少APL起始細(xì)胞，并且誘導(dǎo)細(xì)胞向髓系成熟分化。箭頭指向的兩組P值標(biāo)在圖中；圖6D-EKaplan-Meier生存曲線顯示腺花素能明顯延長全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病小鼠的生存期。*代表與試劑對照組比較，P < O. 01。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明，實(shí)施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。
實(shí)施例1 :敲除Prx I/II直接抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化。
我們研究發(fā)現(xiàn)在NB4細(xì)胞利用Prx I/II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，NB4細(xì)胞明顯伸長、貼壁，瑞氏吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核漿比例明顯減小，呈現(xiàn)髓系分化表型，硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞明顯增多(圖1A)，進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分化抗原⑶llb/c，發(fā)現(xiàn)敲除Prx I/II顯著上調(diào)其表達(dá)(圖1B)。這些結(jié)果提示敲除Prx I/II 直接誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究顯示，敲除Prx I/II后細(xì)胞增殖明顯抑制(圖1C)，通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)敲除Prx I/II后細(xì)胞出現(xiàn)Gl期阻滯(圖1D)。通過免疫印跡法檢測Prx I/II的敲除效果及其分化相關(guān)基因C/ΕΒΡβ的表達(dá)(圖1E)。
實(shí)施例2 :敲除Prx I/II直接誘導(dǎo)全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病細(xì)胞分化。
全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病細(xì)胞(NB4-MR2和NB4-LR2)在應(yīng)用Prx I/ II逆轉(zhuǎn)錄敲除病毒感染6天后，瑞氏吉姆薩染色顯示細(xì)胞核漿比例明顯減小，呈現(xiàn)髓系分化表型(圖2A)。硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)顯示陽性細(xì)胞明顯增多(圖2B)。通過免疫印跡法檢測Prx I/II的敲除效果及其分化相關(guān)基因C/ΕΒΡβ的表達(dá)(圖2C)。實(shí)施例1、2結(jié)果表明Prx I/II可作為急性早幼粒白血病誘導(dǎo)分化治療的一個新的潛在靶標(biāo)并應(yīng)用于抗白血病藥物的篩選。
實(shí)施例3 :腺花素及其衍生物是新型的Prx I/II抑制劑。
我們在體外建立了 Prx I/II的酶活檢測平臺，包括體外重組Prx I/II,Trx/TrxR, 底物為NADPH，反應(yīng)起始物為H2O2, Prx I/II可以還原H2O2,而氧化的Prx I/II則被Trx/ TrxR利用NADPH還原。通過檢測NADPH的含量來反映Prx I/II的活性。利用此平臺篩選 Prx I/II抑制劑以期發(fā)現(xiàn)治療白血病的新型先導(dǎo)化合物。我們篩選發(fā)現(xiàn)腺花素(圖3A，I 號化合物)能劑量依賴 性的抑制Prx I的活性(圖3B)。這提示我們腺花素可能是Prx I/II抑制劑。為了進(jìn)一步闡述腺花素抑制Prx I/II活性的構(gòu)效關(guān)系，我們通過化學(xué)改造得到4個衍生物分別為C (16)-C (17)雙鍵還原的4號化合物，C (3)乙?；?號化合物，C (3) 羥基處連接一條鏈的10號化合物和2號的生物素標(biāo)記的腺花素(圖3A)。進(jìn)一步通過體外 Prx I酶活檢測，我們發(fā)現(xiàn)除了 4號化合物完全喪失Prx I抑制活性，其他的腺花素衍生物都具有Prx I抑制活性(圖3C)，這提示我們C(16)-C(17)雙鍵為腺花素的重要活性中心。 我們推測抑制Prx I后細(xì)胞內(nèi)的H2O2會累積，2 μ M腺花素處理ΝΒ4細(xì)胞，不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平。結(jié)果提示腺花素在細(xì)胞內(nèi)確實(shí)上調(diào)H2O2的水平(圖3D)。
實(shí)施例4 :腺花素與Prx Ι/ΙΙ直接相互作用分別通過其C173和C172位點(diǎn)。
為進(jìn)一步闡明腺花素與Prx Ι/ΙΙ的結(jié)合方式，我們利用了生物素標(biāo)記腺花素為探針在體外與重組的Prx Ι/ΙΙ反應(yīng)，同時利用未標(biāo)記腺花素作為冷探針競爭，我們發(fā)現(xiàn)腺花素在體外可直接與Prx Ι/ΙΙ結(jié)合(圖4Α)。為進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)證實(shí)腺花素可直接與Prx I/ II結(jié)合，利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)生物素標(biāo)記腺花素與Prx I存在共定位(圖 4Β)。前面結(jié)果提示C(16)-C(17)雙鍵為腺花素的重要活性中心，C(16)-C(17)雙鍵很可能與一些親核的基團(tuán)發(fā)生共價結(jié)合，為證實(shí)這一點(diǎn)，將腺花素與重組的Prx I在體外反應(yīng)后， 通過質(zhì)譜尋找被腺花素修飾的肽段，發(fā)現(xiàn)Hgevc173Pagwk肽段中的173位半胱氨酸被腺花素修飾(圖4C)。通過點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了體外重組Prx I的四個半胱氨酸突變體及Prx II 的三個半胱氨酸突變體，發(fā)現(xiàn)生物素標(biāo)記腺花素在體外與重組的Prx I的C173和Prx II的 C172能直接相互作用(圖4D)，進(jìn)一步證實(shí)了質(zhì)譜的結(jié)果。
實(shí)施例5 :腺花素能誘導(dǎo)N B4細(xì)胞及其全反式維甲酸耐藥的細(xì)胞發(fā)生分化。
基于Prx I/II可作為白血病誘導(dǎo)分化治療的一個新的潛在靶標(biāo)，而腺花素能夠且抑制劑Prx 1/11，我們進(jìn)一步檢測了腺花素的可能分化效應(yīng)。用腺花素(2μΜ)處理ΝΒ4細(xì)胞5天，細(xì)胞明顯伸長、貼壁，瑞氏吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核漿比例明顯減小，呈現(xiàn)髓系分化表型，硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞明顯增加(圖5Α)。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分化抗原⑶Ilb/c，發(fā)現(xiàn)腺花素呈時間依賴性顯著上調(diào)其表達(dá)(圖5B) ^eal-time PCR結(jié)果顯示腺花素呈時間依賴性顯著上調(diào)分化相關(guān)基因的表達(dá)(圖5C)。這些結(jié)果提示腺花素作為Prx I/II的抑制劑可以誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化。進(jìn)一步，腺花素也可以誘導(dǎo)全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病細(xì)胞分化(圖OT-E)。通過免疫印跡法和real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)腺花素顯著上調(diào)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子C/ΕΒΡβ的蛋白和mRNA表達(dá)(圖5F-G)。以上結(jié)果提示腺花素和敲除Prx I/II可能通過上調(diào)C/ΕΒΡβ進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
實(shí)施例6 :腺花素體內(nèi)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，減少白血病起始細(xì)胞，延長白血病小鼠的生存期。
利用本實(shí)驗(yàn)室全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病(APL 移植模型。白血病小鼠分為三組，移植后第二天分別給予試劑對照處理、5mg/kg腺花素處理 (靜脈給藥)和10mg/kg全反式維甲酸處理(腹腔給藥)。連續(xù)給藥5天,休息2天,當(dāng)試劑對照處理組小鼠開始死亡，停止給藥，所有組小鼠處死，外周血涂片，骨髓血涂片觀察，及其肝臟的白血病細(xì)胞浸潤，發(fā)現(xiàn)腺花素處理能明顯誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化并減輕全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病細(xì)胞的浸潤(圖5A-B)。進(jìn)一步檢測了對此型白血病發(fā)病至關(guān)重要的白血病起始細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腺花素能明顯減少APL白血病起始細(xì)胞 (圖5C，中間一列)，并且誘導(dǎo)細(xì)胞向髓系成熟分化(圖5C，右邊一列)。Kaplan-Meier生存曲線顯示腺花素能明顯延長全反式維甲酸敏感和全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病小鼠的生存期(圖OT-E)。綜上所述，發(fā)現(xiàn)并利用Prx I/II作為白血病治療的新藥物靶標(biāo)，篩選出腺花素用于現(xiàn)實(shí)對白血病細(xì)胞的分化作用，從而表現(xiàn)出顯著的治療全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病的作用。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn) 和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.Peroxiredoxin I或者II作為祀標(biāo)在體外篩選治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物的用途，所述急性早幼粒細(xì)胞白血病是指全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病。
2.腺花素及其衍生物用作制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物的用途，所述急性早幼粒細(xì)胞白血病是指全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腺花素及其衍生物用作制備治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物的用途，其特征在于，所述衍生物是指C3羥基上氫的取代或者C3上羥基的取代，所述C3羥基上氫的取代用選自甲基(methyl)，乙?；?acetyl)，甲氧基甲基(MOM)，甲硫基甲基(MTM)，對甲氧基芐基(PMBM)，芐基(benzyl)，叔丁氧基甲基(t_BuOCH2)，2-(三甲硅基)乙氧甲基(SEM)，四氫吡喃基(THP)，烯丙基(allyl)，叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)，三乙基硅烷(TES)，三甲基硅烷(TMS)，對甲基苯磺酰氯(Ms)，叔丁基(t-Bu)，3，4-二甲氧基芐基(DMPM)，三苯甲基(Tr)，三異丙基硅基(TIPS)，二甲基異丙基硅(IPDMS)，二乙基異丙基硅(DEIPS)，1，1，2-三甲基丙基二甲基硅(TDS)，叔丁基二苯基硅(TBDPS)，二苯甲基硅(DPMS)，三苯基硅(TPS)，對甲苯磺?；?Ts)或者對三氟甲磺基(Tf)中的一個基團(tuán)取代；所述C3上羥基的取代，用氨基(-NH2)取代，然后對于氨基用選自乙?；?acetyl)，芴甲氧羰基(Fmoc),叔丁氧羰基(Boc),對甲基苯磺酰氯(Ms),對甲苯磺?；?Ts),對三氟甲磺基(Tf)或者丁酸(butyric acid)基團(tuán)中的一個基團(tuán)取代。
4.腺花素及其衍生物用作制備PeroxiredoxinI或者II抑制劑的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腺花素及其衍生物用作制備PeroxiredoxinI或者II抑制劑的用途，其特征在于，所述衍生物是指C3羥基上氫的取代或者C3上羥基的取代，所述C3羥基上氫的取代用選自甲基(methyl)，乙?；?acetyl)，甲氧基甲基(MOM)，甲硫基甲基(MTM)，對甲氧基芐基(PMBM)，芐基(benzyl)，叔丁氧基甲基(t_BuOCH2)，2-(三甲硅基)乙氧甲基(SEM)，四氫吡喃基(THP)，烯丙基(allyl)，叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)，三乙基硅烷(TES)，三甲基硅烷(TMS)，對甲基苯磺酰氯(Ms)，叔丁基(t-Bu)，3，4-二甲氧基芐基(DMPM)，三苯甲基(Tr)，三異丙基硅基(TIPS)，二甲基異丙基硅(IPDMS)，二乙基異丙基硅(DEIPS)，1，1，2-三甲基丙基二甲基硅(TDS)，叔丁基二苯基硅(TBDPS)，二苯甲基硅(DPMS)，三苯基硅(TPS)，對甲苯磺酰基(Ts)或者對三氟甲磺基(Tf)中的一個基團(tuán)取代；所述C3上羥基的取代，用氨基(-NH2)取代，然后對于氨基用選自乙?；?acetyl)，芴甲氧羰基(Fmoc),叔丁氧羰基(Boc),對甲基苯磺酰氯(Ms),對甲苯磺?；?Ts),對三氟甲磺基(Tf)或者丁酸(butyric acid)基團(tuán)中的一個基團(tuán)取代。
全文摘要
本發(fā)明提供Prx I/II在治療白血病藥物的篩選中的應(yīng)用，通過將Prx I/II作為藥物靶標(biāo)，來篩選抑制Prx I/II酶的活性、從而對白血病細(xì)胞產(chǎn)生分化作用的藥物。本發(fā)明篩選出腺花素及其衍生物用于實(shí)現(xiàn)對急性早幼粒白血病細(xì)胞的分化作用，從而表現(xiàn)出顯著的治療全反式維甲酸敏感及全反式維甲酸耐藥白血病的作用。腺花素安全低毒，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。本發(fā)明的腺花素活性物質(zhì)具有容易吸收、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，更加適合作為新型藥物、食物、保健品或膳食添加劑進(jìn)行開發(fā)。
文檔編號A61P35/02GK103045715SQ201110305958
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者陳國強(qiáng), 孫漢董, 吳英理, 劉傳緒, 陰倩倩, 普建新, 肖偉烈 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 中國科學(xué)院昆明植物研究所