專利名稱：腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是引起嬰幼兒手足口病的 主要病原之一。EV71感染的主要癥狀是手、足、口等部位皮疹或皰疹，部分患兒可并發(fā)無(wú)菌 性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，呼吸道感染 和心肌炎等，可致殘、致死。自2008年安徽阜陽(yáng)爆發(fā)手足口病以來(lái)，EV71的感染呈加劇的 趨勢(shì)，已經(jīng)成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，但目前EV71的感染途徑、致病機(jī)制及流行規(guī)律 仍不明確，并且缺乏有效的治療藥物及疫苗。缺乏成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型是造成上述情況的最重要的原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外采 用的動(dòng)物模型都是4日齡以內(nèi)的乳鼠，但這種模型很不穩(wěn)定，給EV71致病機(jī)理、臨床治療及 疫苗研發(fā)帶來(lái)了很大困難。因此，穩(wěn)定的EV71感染動(dòng)物模型就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建 立方法，動(dòng)物模型的建立可加深對(duì)腸道病毒71型病原學(xué)的了解，促進(jìn)腸道病毒71型致病機(jī) 制的研究，用于高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法，包括以下步驟取7日齡 乳鼠，腦內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20 μ L，是通過(guò)以下方法制得的將EV71毒種，以 200 μ L/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C,5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變 情況；接種EV71后第2天，MA104細(xì)胞有約70%出現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心 取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒種，為現(xiàn)有技術(shù)中已有的，常規(guī)取得即可，本發(fā)明對(duì)此無(wú)限制，不再贅 述。所述乳鼠為7日齡BALB/c小鼠。所述建立方法，還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的 小鼠，兩天后，后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，四天后后肢癱瘓，七天后死亡的，即為感染成功的小鼠模 型。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型，其后肢癱瘓率 一般為70% 100%，死亡率為30 100%。本發(fā)明為科研人員研究腸道病毒71型病原 學(xué)、腸道病毒71型致病機(jī)制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，具有廣 闊的應(yīng)用前景。


圖1為臨床分離毒株的RT-PCR鑒定的電泳圖，其中，M = Maker (D2000)，N=陰性 細(xì)胞對(duì)照，B =空白試劑對(duì)照，1 =分離毒株。圖2為病毒組動(dòng)物后肢癱瘓示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1建立感染腸道病毒71型的小鼠模型步驟如下1、EV71的分離鑒定本發(fā)明所采用的EV71毒株是從臨床的重癥手足口病人的大便標(biāo)本中分離的，同 時(shí)采用人橫紋肌肉瘤細(xì)胞株(RD)、恒河猴腎細(xì)胞株(MA104)和非洲綠猴腎細(xì)胞株(Vero)三 種細(xì)胞對(duì)標(biāo)本中的病毒進(jìn)行分離，結(jié)果三種細(xì)胞上菌出現(xiàn)了細(xì)胞病變，傳代后凍存毒種。然 后提取分離到的EV71的基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用EV71國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物對(duì)分離毒株進(jìn) 行鑒定，結(jié)果表明分離毒株在226bp處出現(xiàn)了很亮的條帶(如圖1所示)，可證實(shí)從臨床手 足口重癥病人大便標(biāo)本中分離的毒株為EV71。2、EV71感染動(dòng)物模型的建立2.1小鼠的準(zhǔn)備購(gòu)買清潔級(jí)的新生BALB/C乳鼠(帶母鼠)兩組，每組乳鼠6只，25°C、濕度50%， 分格飼養(yǎng)在P2實(shí)驗(yàn)室的凈化動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，每天觀察動(dòng)物生長(zhǎng)情況。連續(xù)觀察至第7天， 兩組BALB/C乳鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。2. 2毒種的準(zhǔn)備將分離的EV71毒種，以200yL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞， 37°C、5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。接種EV71后第2天，MA104細(xì)胞有約70%出 現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染動(dòng)物模型的建立2. 3. 1動(dòng)物分組將兩組動(dòng)物分別設(shè)為病毒組和正常對(duì)照組，病毒組腦內(nèi)接種EV71病毒，正常對(duì)照 組腦內(nèi)接種含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液。2·3·2接種EV71采用無(wú)菌的微量進(jìn)樣器，病毒組每只BALB/C乳鼠腦內(nèi)注射病毒液20 μ L，正常對(duì) 照組每只BALB/C乳鼠腦內(nèi)注射含2%胎牛血清的1640培養(yǎng)液20 μ L。然后將動(dòng)物按相同 的條件飼養(yǎng)在凈化動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，每天觀察動(dòng)物。2. 3. 3接毒后的觀察前兩天病毒組和正常對(duì)照組均無(wú)異常；第3天病毒組動(dòng)物后肢出現(xiàn)反應(yīng)遲緩，正 常對(duì)照組無(wú)異常；第4天病毒組全部出現(xiàn)明顯后肢癱瘓，正常對(duì)照組無(wú)異常，取兩組動(dòng)物各 3只分別進(jìn)行解剖固定；第7天病毒組動(dòng)物均死亡，正常對(duì)照組無(wú)異常。病毒組動(dòng)物癱瘓的 情況如圖2所示，證明動(dòng)物模型建立成功。
權(quán)利要求
一種腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟取7日齡乳鼠，腦內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法，其特征在 于所述病毒液注射量為20 μ L，是通過(guò)以下方法制得的將EV71毒種，以200 μ L/100mL細(xì) 胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37°C、5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況；接種EV71 后第2天，MA104細(xì)胞有約70%出現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心取上清，即得到 EV71的病毒液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法，其特征在 于還包括以下小鼠模型的鑒定步驟飼養(yǎng)上述接種腸道病毒71型的小鼠，兩天后，后肢出 現(xiàn)反應(yīng)遲緩，四天后后肢癱瘓，七天后死亡的，即為感染成功的小鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型的建立方法取7日齡乳鼠，腦內(nèi)注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量為20μL，是通過(guò)以下方法制得的將EV71毒種，以200μL/100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的接種量接種MA104細(xì)胞，37℃、5％CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況；接種EV71后第2天，MA104細(xì)胞有約70％出現(xiàn)了凝集、皺縮，將整瓶細(xì)胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。本發(fā)明成功地建立了穩(wěn)定的腸道病毒71型感染的7日齡小鼠模型，為科研人員研究腸道病毒71型病原學(xué)、腸道病毒71型致病機(jī)制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K35/76GK101982181SQ20101053850
公開日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者孟紅, 宋楠楠, 岳盈盈, 李志會(huì), 李鵬 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所