專(zhuān)利名稱(chēng)：新的o－超家族芋螺毒素肽，其編碼多核苷酸及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的O-超家族芋螺毒素肽、其編碼多核苷酸及用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是由生活在熱帶海洋中的肉食性軟體動(dòng)物芋螺(Conus)分泌出來(lái)的，用于麻醉獵物的小肽類(lèi)毒素。它們是由6-41個(gè)氨基酸殘基組成的，富含半胱氨酸(Cys)的動(dòng)物神經(jīng)肽毒素。其毒性極大，可引起動(dòng)物出現(xiàn)驚厥、顫抖、甚至麻痹死亡。芋螺毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，生物活性強(qiáng)，作用靶位的選擇性高。既可直接用作天然藥物，又可作為藥物設(shè)計(jì)的先導(dǎo)化合物。鑒于其分子小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對(duì)受體作用范圍大、特異性強(qiáng)、可化學(xué)合成；又是基因表達(dá)的產(chǎn)物，還可在體外重組表達(dá)獲得較大量毒素。每種芋螺毒液中有約50-200種不同的芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，且不同芋螺種類(lèi)的毒素肽互不相同，不同的芋螺毒素在生物體內(nèi)的作用靶位完全不同，至少有幾萬(wàn)種芋螺毒肽具有調(diào)節(jié)各種離子通道的特殊功能，從而組成了一系列的神經(jīng)藥物源。食蟲(chóng)芋螺毒素對(duì)多種蠕蟲(chóng)有致死作用，可開(kāi)發(fā)為多肽殺蟲(chóng)劑，或轉(zhuǎn)化植物培育抗蟲(chóng)作物新品種。因此，芋螺毒素已躍居動(dòng)物神經(jīng)毒素研究的首位，成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的有力工具和新藥開(kāi)發(fā)的新來(lái)源，引起了全世界科學(xué)家們的廣泛重視。我國(guó)芋螺資源豐富，是我國(guó)海南特有的藥用海洋生物，絕大多數(shù)芋螺種類(lèi)的毒素研究尚未開(kāi)展，我國(guó)更應(yīng)加緊開(kāi)展具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的芋螺毒素基因資源的研究開(kāi)發(fā)工作，對(duì)海洋制藥工業(yè)具有特別重要的意義。本發(fā)明內(nèi)容正是適應(yīng)當(dāng)前海洋藥物芋螺毒素研究的發(fā)展趨勢(shì)和需要而取得的，具有廣闊的應(yīng)用前景。
根據(jù)芋螺毒素作用于生物體內(nèi)的不同靶位可分為3類(lèi)(1)作用于電壓門(mén)控離子通道的CTX，電壓門(mén)控離子通道又稱(chēng)電壓敏感性通道，常以通透離子(如Na+，K+，Ca2+等)命名。(2)作用于配體門(mén)控離子通道的CTX，包括煙堿受體、5HT3受體、NMDA受體。配體門(mén)控通道又稱(chēng)化學(xué)門(mén)控通道或遞質(zhì)依賴(lài)性通道，后者按相應(yīng)的受體命名。(3)作用于其他受體的CTX，CTX除了作用于離子通道以外，還有以G-蛋白為靶標(biāo)的，如芋螺加壓素和芋螺惰性素，以及2種磷脂(conodipineM和PLA2)，它們基本上不含有二硫鍵。按其作用的受體靶可將芋螺毒素分為α、ω、μ、δ等多種亞型。根據(jù)芋螺毒素基因及其前體蛋白信號(hào)肽的保守性，可將芋螺毒素分為A、O、T、M、P、I等多個(gè)超家族。每個(gè)超家族根據(jù)受體靶類(lèi)型，又可分為α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(píng)(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亞型)(見(jiàn)表1，引自J.Michael McIntosh，et al.CONUS PEPTIDES TARGETED TOSPECIFIC NICOTINIC ACETYLCHOLINE RECEPTOR SUBTYPES.AnnualReview of Biochemistry.1999，(68)59-88.)與受體有關(guān)的過(guò)程是生命調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，受體蛋白的研究鑒定，與具有特異作用和高親和性結(jié)合能力的毒素密切相關(guān)。芋螺毒素通過(guò)與神經(jīng)和肌肉細(xì)胞膜多種受體(鈉通道、鈣通道和乙酰膽堿受體等)特異性結(jié)合，影響與受體有關(guān)的一系列細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程，使受體研究從推測(cè)分析水平進(jìn)入闡明分子機(jī)理水平，成為神經(jīng)科學(xué)研究鑒定受體及其調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)分子機(jī)理的重要工具，并在頑痛、癲癇癥、心臟血管疾病、精神病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、痙攣、癌癥、艾滋病、神經(jīng)保護(hù)、中風(fēng)等疑難雜癥的治療中顯示出誘人的應(yīng)用前景。多種芋螺毒素已進(jìn)入臨床試驗(yàn)(見(jiàn)表2，引自L(fǎng)AURA NELSON.Venomous snailsOne slip，andyou′re dead....Nature，2004，429798-799).
表1 芋螺毒素超家族

表2 處于不同臨床試驗(yàn)階段的芋螺毒素

O-超家族芋螺毒素(半胱氨酸模式C-C-CC-C-C)主要作用于電壓門(mén)控離子通道(又稱(chēng)電壓敏感性通道)，包括Ca2+離子通道、Na+離子通道和K+離子通道等。
Ca2+通道為所有興奮性細(xì)胞膜的必要成分之一，分為L(zhǎng)，T，N，P和Q類(lèi)型，其中N類(lèi)型的Ca2+通道只存在于神經(jīng)元組織(如脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及外周神經(jīng)系統(tǒng))，它主要抑制神經(jīng)遞質(zhì)尤其是去甲腎上腺素從交感神經(jīng)上釋放時(shí)Ca2+的進(jìn)入。作用于Ca2+通道的CTX只有ω-CTX。ω-CTX G VI A從地紋芋螺中提取的，含有27個(gè)氨基酸、3個(gè)二硫鍵，屬于O超家族。它是選擇性抑制N類(lèi)型Ca2+通道的毒素。MVIIA是從幻芋螺中提取的ω-CTX，也是首次進(jìn)入臨床試驗(yàn)的神經(jīng)Ca2+通道拮抗劑.ω-芋螺毒素MVIIA，用于癌癥、愛(ài)滋病晚期的頑痛治療，成本比鴉片類(lèi)止痛劑大大降低，它比常用麻醉藥強(qiáng)萬(wàn)倍以上，是珍貴的海洋藥物.ω-芋螺毒由于能特異作用于多種類(lèi)型的鈣離子通道，并具有嚴(yán)格的生物活性特異性而受到神經(jīng)生物學(xué)家和藥理學(xué)家的重視，成為研究鑒定鈣離子通道的有效工具藥，同時(shí)在特異診斷試劑和新藥研制開(kāi)發(fā)方面也具有潛在的應(yīng)用前景。以Na+離子通道為靶標(biāo)的有μ-CTX、μO(píng)-CTX和δ-CTX。其中μ-CTX的半胱氨酸模式與μO(píng)-CTX和δ-CTX的不同，前者屬于M超家族，后兩者屬于O超家族。以K+離子通道為靶標(biāo)的有κA-CTX和κ-CTX。κ-CTX屬于O超家族。Na+和K+通道是研究神經(jīng)信號(hào)的重要途徑，與之相結(jié)合的芋螺毒素在神經(jīng)科學(xué)研究和新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大。
雖然已有多個(gè)O超家族的芋螺毒素肽被發(fā)現(xiàn)，但進(jìn)行深入研究的不多。絕大多數(shù)海南產(chǎn)的芋螺毒素急待研究與開(kāi)發(fā)。本發(fā)明針對(duì)的正是現(xiàn)有技術(shù)中的這一需求，對(duì)我國(guó)乃至世界海洋制藥將具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于的是從我國(guó)海南產(chǎn)的大理石芋螺(Conus marmoreusLinnaeus)、幻芋螺(Conus magus Linnaeus)、信號(hào)芋螺(Conuslittertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、獨(dú)特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、帝王芋螺(Conus ImperialisLinnaeus)、織錦芋螺(Conus textile Linnaeus)、桶形芋螺(Conusbetulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)等共12個(gè)種中分別發(fā)現(xiàn)的具有藥用功能的O-超家族芋螺毒素肽(O-superfamilyConotoxin，O-CTX)。
因此，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了新的O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)。
本發(fā)明在另一方面提供了編碼所述肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了含有所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，含有該核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體，以及被所述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了所述肽的人工合成與重組制備方法。
本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，所述芋螺毒素肽對(duì)蟑螂、棉鈴蟲(chóng)、煙青蟲(chóng)、水稻螟蟲(chóng)、甘蔗螟蟲(chóng)、荔枝椿象等害蟲(chóng)有致死作用。因此，本發(fā)明的芋螺毒素可作為多肽殺蟲(chóng)劑開(kāi)發(fā)。其基因可用于轉(zhuǎn)化微生物(例如昆蟲(chóng)桿狀病毒、大腸桿菌和酵母等)和植物，開(kāi)發(fā)出新型生物農(nóng)藥，培育出抗蟲(chóng)作物新品種。
本發(fā)明的芋螺毒素肽可通過(guò)結(jié)合電壓門(mén)控離子通道發(fā)揮作用，電壓門(mén)控離子通道又稱(chēng)電壓敏感性通道，包括Ca2+離子通道、Na+離子通道、K+離子通道等受體，具有鎮(zhèn)痛活性。它們是新藥開(kāi)發(fā)的候選藥物和先導(dǎo)藥物。
因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述肽的藥物組合物或殺蟲(chóng)劑組合物。
具體實(shí)施例方式
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX)，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)所述的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)、更優(yōu)選1-2個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)所述的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述芋螺毒素肽具有的氨基酸序列與SEQ ID NO1-70至少大約85％相同，更優(yōu)選至少大約90％相同，尤其優(yōu)選至少大約95％相同，最優(yōu)選至少大約97％相同(在本文中稱(chēng)作“同源肽”)。
為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列之間的相同程度是通過(guò)BLAST2.0蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)程序(Aaltschul等，1997，核酸研究253389-3402)并采用下列參數(shù)確定的blastall pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查詢(xún)文檔]-d prot_all，其中-p指程序名稱(chēng)，-a指將要用到的服務(wù)器數(shù)，-e指期望值，-E指延伸缺口的代價(jià)，-v指單線(xiàn)描述(one-line description)數(shù)，-b指將要顯示的比對(duì)數(shù)，-I指查詢(xún)文檔，-d指用于查詢(xún)的數(shù)據(jù)庫(kù)。
同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1-70任一所示的氨基酸序列不同之處可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)、更優(yōu)選1-3個(gè)、尤其優(yōu)選1-2個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸改變是性質(zhì)改變較小的變化，即是不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約5個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸殘基；有多達(dá)大約20-25個(gè)殘基的小連接肽；或可通過(guò)改變凈電荷或者其它功能而有助于純化的小延伸如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合區(qū)。
保守性取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)進(jìn)行的取代。通常不會(huì)改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白質(zhì)》一書(shū)，Academic Press，New York中描述過(guò)。最常見(jiàn)的替換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向進(jìn)行的替換。
本發(fā)明還包括在本發(fā)明芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括連接編碼本發(fā)明肽的編碼序列與編碼所述其它肽/多肽的編碼序列，使它們?cè)谕蛔x框中，并且融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動(dòng)子和終止子。
多核苷酸本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明所述肽的核酸序列的分離多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一序列中所包含的成熟肽編碼序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO1-35中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列，它與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列之間因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而有所不同。本發(fā)明的核酸序列包括基因組序列，以及相應(yīng)的cDNA和RNA序列。此處所用術(shù)語(yǔ)“核酸序列”應(yīng)理解為包括合成DNA在內(nèi)的所有這類(lèi)變種。
本發(fā)明還涉及編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少約為70％、優(yōu)選約80％、更優(yōu)選約90％，還要優(yōu)選的是約95％，最優(yōu)選的是大約97％同源。就本發(fā)明目的而言，兩個(gè)核酸序列間的同源程度是通過(guò)Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)80726-730)用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重對(duì)比參數(shù)缺口罰分和缺口長(zhǎng)度罰分均為10確定的。成對(duì)對(duì)比參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗口＝20。
合成與本發(fā)明所述多肽基本相似的多肽時(shí)，可能有必要對(duì)編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進(jìn)行修飾。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。這些多肽可能與從天然來(lái)源分離到的多肽在某些加工方式上不同。例如，可能希望用例如定點(diǎn)誘變來(lái)合成多肽的變體，這些變體有不同的熱穩(wěn)定性或最適pH等。可以在SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼部分的核酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建出類(lèi)似序列；并/或通過(guò)引入核苷酸取代而構(gòu)建，所述取代不會(huì)使產(chǎn)生的氨基酸序列與原核酸序列編碼的多肽不同，但它們符合酶制備所用宿主生物對(duì)密碼子的使用習(xí)慣；或通過(guò)引入會(huì)產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建。關(guān)于核苷酸取代的綜述，參見(jiàn)例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107。
本發(fā)明還涉及包含編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO71-105中任一所示的成熟肽編碼序列或其互補(bǔ)序列可雜交的核酸序列的多核苷酸。關(guān)于多核苷酸之間的雜交，在現(xiàn)有技術(shù)中有眾多的文獻(xiàn)可供參考，包括例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，1989。雜交中可以應(yīng)用各種程度的嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如中度、中度-高度，或者高度嚴(yán)謹(jǐn)條件。越嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，形成雙螺旋要求的互補(bǔ)程度越高?？梢酝ㄟ^(guò)溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間等等控制嚴(yán)謹(jǐn)程度。對(duì)于雙鏈DNA基因探針，雜交于低于DNA雜合體熔解溫度[melting temperature，Tm])20-25℃下在6X SSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進(jìn)行過(guò)夜。清洗通常如下進(jìn)行于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹(jǐn)條件清洗)。
對(duì)于寡核苷酸探針，雜交于低于雜合體的熔解溫度Tm 10-20℃下在6X SSPE、5X Denha rdt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進(jìn)行過(guò)夜。清洗通常如下進(jìn)行于雜交溫度在1X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹(jǐn)條件清洗)核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列及與之可操作連接的1或多個(gè)調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)應(yīng)理解為包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在文中定義為單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然基因，或者經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達(dá)本發(fā)明所述編碼序列必需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與表達(dá)盒同義。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在文中定義為核酸序列中直接確定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的部分。編碼序列的邊界通常是由緊鄰mRNA 5’端開(kāi)放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(對(duì)于原核細(xì)胞)和緊鄰mRNA 3’端開(kāi)放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明所述肽的分離的核酸序列，使其表達(dá)所述肽?？赡芷谕虮仨氃诓迦胼d體之前對(duì)核酸序列進(jìn)行加工，這取決于表達(dá)載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
本文中術(shù)語(yǔ)“控制序列”定義為包括表達(dá)本發(fā)明肽所必需或有利的所有組分。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼多肽的核酸序列可以是天然含有的或外來(lái)的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。為了導(dǎo)入特定的限制位點(diǎn)以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對(duì)DNA序列之編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
調(diào)控序列可以是合適的啟動(dòng)子序列，即可被表達(dá)核酸序列的宿主細(xì)胞識(shí)別的核酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細(xì)胞識(shí)別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對(duì)宿主細(xì)胞的翻譯十分重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核酸序列的5’末端。在所選宿主細(xì)胞中可發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，該區(qū)編碼一段連在多肽氨基端的氨基酸序列，能引導(dǎo)編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核酸序列編碼區(qū)的5’端可能天然含有翻譯讀框一致地與分泌多肽的編碼區(qū)片段自然連接的信號(hào)肽編碼區(qū)。或者，編碼區(qū)的5’端可含有對(duì)編碼序列是外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在正常情況下不含有信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)，可能需要添加外來(lái)信號(hào)肽編碼區(qū)?；蛘?，可以用外來(lái)的信號(hào)肽編碼區(qū)簡(jiǎn)單地替換天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽分泌。但是，任何能引導(dǎo)表達(dá)后的多肽進(jìn)入所用宿主細(xì)胞的分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是肽原編碼區(qū)，該區(qū)編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被稱(chēng)為酶原或多肽原。多肽原通常沒(méi)有活性，可以通過(guò)催化或自我催化而從多肽原切割肽原而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信號(hào)肽又有肽原區(qū)時(shí)，肽原區(qū)緊鄰多肽的氨基末端，而信號(hào)肽區(qū)則緊鄰肽原區(qū)的氨基末端。
添加能根據(jù)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)情況來(lái)調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的調(diào)控序列可能也是需要的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些能對(duì)化學(xué)或物理刺激物(包括在有調(diào)控化合物的情況下)作出反應(yīng)，從而開(kāi)放或關(guān)閉基因表達(dá)的系統(tǒng)。調(diào)控序列的其他例子是那些能使基因擴(kuò)增的調(diào)控序列。在這些例子中，應(yīng)將編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作連接在一起。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和調(diào)控序列連接在一起來(lái)制備重組表達(dá)載體，該載體可以包括1或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)，以便在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘?，可以通過(guò)將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體而表達(dá)本發(fā)明所述核酸序列。制備表達(dá)載體時(shí)，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列可操作連接。
重組表達(dá)載體可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線(xiàn)性或閉環(huán)質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立于染色體進(jìn)行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的任何機(jī)制?；蛘撸d體是一個(gè)當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有1或多個(gè)便于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個(gè)基因，其產(chǎn)物賦予對(duì)殺生物劑或病毒的抗性、對(duì)重金屬的抗性，或賦予營(yíng)養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，或保證載體在細(xì)胞中獨(dú)立于細(xì)胞基因組而進(jìn)行自主復(fù)制的元件。
就進(jìn)行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點(diǎn)，使載體能在目標(biāo)宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以帶有使其在宿主細(xì)胞中成為溫度敏感型的突變(參見(jiàn)例如，fEhrlich，1978，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)751433)。
可以向宿主細(xì)胞插入1個(gè)以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過(guò)將該序列的至少1個(gè)附加拷貝插入宿主細(xì)胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個(gè)可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記，通過(guò)在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞，挑選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細(xì)胞。
用于連接上述各元件來(lái)構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含可用來(lái)重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明所述核酸序列的重組宿主細(xì)胞?？蓪景l(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來(lái)源。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
制備方法本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明肽的方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生所述肽的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述肽的核酸序列；和(b)回收該肽。
在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在合適多肽產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達(dá)和/或分離的條件下，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開(kāi)的組成(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來(lái)制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中回收。
可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過(guò)常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過(guò)濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。
可以通過(guò)各種本領(lǐng)域已知的操作來(lái)純化本發(fā)明所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點(diǎn)聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見(jiàn)例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸序列的動(dòng)物或植物細(xì)胞，優(yōu)選小麥、玉米、水稻、大豆等植物細(xì)胞，賦予被轉(zhuǎn)化宿主新的性狀(如抗蟲(chóng)性)。這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，用此處公開(kāi)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化動(dòng)物或植物細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。
用于控制害蟲(chóng)的方法和制劑可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多種方法，使用本發(fā)明的芋螺毒素肽或多核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)控制害蟲(chóng)。這些方法包括例如將重組微生物應(yīng)用于害蟲(chóng)(或它們的所在地)、和用編碼本發(fā)明的芋螺毒素肽的基因轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。此處公開(kāi)了用于這些轉(zhuǎn)化的必要物質(zhì)，或者熟練的技術(shù)人員可以通過(guò)其它方法容易的獲得。
可以將配制的含有芋螺毒素肽、或包含本發(fā)明所述多核苷酸的重組微生物的制劑應(yīng)用于土壤。還可以將配制的產(chǎn)品作為種子覆料或根部處理或作物生長(zhǎng)周期晚期的完整植株處理應(yīng)用。制劑可以包括擴(kuò)散-增稠佐劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲(chóng)添加劑、或表面活性劑。液體制劑可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化濃縮物等等形式使用。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，殺蟲(chóng)劑濃度將由于特殊制劑的本性廣泛變化，特別是可作為濃縮物或直接使用。殺蟲(chóng)劑將以至少1％(重量計(jì))存在，而且可能是100％(重量計(jì))。干燥制劑通常有大約1-95％(重量計(jì))的殺蟲(chóng)劑，而液體制劑將通常是液相中固體重量大約1-60％。含有細(xì)胞的制劑將通常含有大約102-大約104個(gè)細(xì)胞/mg。這些制劑將以每公頃大約50mg(液體的或干的)-1kg或更多的量使用。通過(guò)噴、撒、灑、等等，可以將制劑應(yīng)用于害蟲(chóng)環(huán)境，例如土壤和植物。
藥物組合物本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽和藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。所述藥物組合物可用于緩解或治療與缺血性損傷有關(guān)的疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有治療有效量的本發(fā)明肽的藥物組合物以利于藥用的方式配制和給藥，并需考慮到個(gè)體病人的臨床狀況、運(yùn)送位點(diǎn)、給藥方法、給藥日程安排和醫(yī)生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由這些方面的考慮決定。
含治療有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物可口服、非腸道給藥、腦池內(nèi)給藥等?！八帉W(xué)可接受載體”指無(wú)毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料或任何類(lèi)型的配方輔助物。本文所用術(shù)語(yǔ)“非腸道的”表示的給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明多肽還可通過(guò)緩釋系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)亟o藥。
還可應(yīng)用本發(fā)明的芋螺毒素肽或基因作為有用的探針，來(lái)研究鑒定動(dòng)物電壓門(mén)控離子通道(包括Ca2+、Na+和K+離子通道等)受體及其調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)分子機(jī)理的重要工具；作為分子探針來(lái)確定離子通道的不同亞型；作為分子模型，設(shè)計(jì)新藥；作為多肽殺蟲(chóng)劑，開(kāi)發(fā)為新型生物農(nóng)藥等。在神經(jīng)科學(xué)受體研究，在頑痛、癲癇癥、心臟血管疾病、精神病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、痙攣、癌癥、艾滋病、神經(jīng)保護(hù)、中風(fēng)等疑難雜癥的治療中有廣闊的應(yīng)用前景下面參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。給出這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明，它們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 O-超家族芋螺毒素基因的克隆1芋螺總RNA的提取以從海南島、西沙群島等沿海采集的織錦芋螺(Conus textileLinnaeus)、桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)、疣蒿芋螺(Conuslividus Hwass)、信號(hào)芋螺(Conus littertus Linnaeus)、勇士芋螺(Conus miles Linnaeus)、獨(dú)特芋螺(Conus caracteristicus Fischer)、菖蒲芋螺(Conus vexillum Gmelin)、大尉芋螺(Conus capitaneusLinnaeus)、大理石芋螺(Conus marmoreus Linnaeus)、幻芋螺(Conusmagus L.)、玉女芋螺(Conus virgo L.)、假玉女芋螺(Conus emaciatusReeve)共12種芋螺活體為材料。用小量柱離心式組織/細(xì)胞總RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，或用Total RNA IsolationSystem試劑盒(Promega)，按操作手冊(cè)提取總RNA。下面以上海華舜產(chǎn)的RNA抽提試劑盒為例。
先把芋螺毒腺或毒管用液氮冷凍并研成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。樣品中加500μL TCL液(RNA裂解液，上海華舜)，混勻后12000rpm離心3分鐘→轉(zhuǎn)移上清并向上清液中加入250μL 75％的乙醇徹底混勻→移入RNA吸附柱中，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL RP液(去蛋白液)，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL W3液(洗滌液)，10000rpm離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→同法用W3液洗兩次10000rpm離心1分鐘→將吸附柱移入另外一個(gè)干凈的1.5mL離心管中→在吸附膜中央加入50u l純水溶解RNA，室溫凈置1分鐘10000rpm離心1分鐘→將1.5mL離心管放-70℃保存。
2 cDNA的合成以步驟1提取的總RNA為模板，分別以O(shè)ligo(dT)15和3′-RACEAdapter Primer為引物，采用兩種方法合成cDNA。分述如下。
方法1、采用ThermoScriptTM RNase H-Transcriptase試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。
反應(yīng)成分3′-RACE引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC(T)17-3’)，0.5μg，總RNA 2μg，1mmol.1-1 dNTP混合物，重蒸水，5×cDNA合成緩沖液，0.1mol.1-1 DTT，RNaseOUTTM重組核糖核酸酶抑制劑(RNaseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor)，ThermoScriptTM RT 20U。反應(yīng)總體積為20μl。反應(yīng)程序先將總RNA模板在65℃溫浴5min，再加入其他成分；反應(yīng)液于50℃溫育60min，85℃溫育5min終止反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20℃保存。
方法2、采用AMV Transcriptase試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。
反應(yīng)成分0.5μg Oligo(dT)15，2μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1mmol.1-1dNTP，20U重組RNA酶抑制劑核糖核酸酶抑制劑(RecombinantRnasin Ribonuclease Inbibitor)，25U AMV反轉(zhuǎn)錄酶，重蒸水。反應(yīng)總體積為20μl。反應(yīng)程序先將總RNA在70℃溫育10min，再加入其他反應(yīng)成分；于42℃溫育1h，95℃終止反應(yīng)5min；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20℃保存。
取5μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳檢測(cè)。
3 反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(RT-PCR)和3-RACE擴(kuò)增以步驟2合成的cDNA為模板，根據(jù)O-超家族芋螺毒素信號(hào)肽區(qū)域保守區(qū)和3’非翻譯區(qū)序列(文獻(xiàn)1 Thomas F.Duda Jr，Stephen R.Palumbi.Molecular genetics of ecological diversificationDuplication and rapid evolution of toxin genes of the venomousgastropod Conus.Evolution，1999，96(12)6820-6823.文獻(xiàn)2Silvestro G.Conticello，Yoav Gilad et al.Mechanisms forEvolving HypervariabilityThe Case of Conopeptides.MolecularBiology and Evolution.2001，18120-131.)，設(shè)計(jì)O-超家族CTX引物共8條上游引物、3條下游引物(引物配對(duì)見(jiàn)下文表3)和3-RACE接頭引物(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)，分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體積為25ul，包括cDNA模板50ng，10×PCR buffer，200uMdNTPs，1umol上游引物與下游引物或3′-RACE接頭引物(5’GGC CACGCG TCG ACT AGT AC 3’)，2mM MgCl2，1U Taq酶和去離子水。循環(huán)程序94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，50℃(或55℃)退火30秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸2分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5ul點(diǎn)樣，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
4 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序回收上述特異PCR產(chǎn)物，與T-easy載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1菌株(發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存)，利用藍(lán)白菌落和氨芐青霉素抗性挑選重組子，抽提純化重組子質(zhì)粒用于測(cè)序分析。經(jīng)序列分析比較，獲得了本發(fā)明所述的35種新型O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ IDNO1-35)。成熟肽是根據(jù)其前肽(SEQ ID NO36-70)及芋螺毒素特點(diǎn)推測(cè)而來(lái)，前肽是根據(jù)前體基因(SEQ ID NO71-105)推測(cè)而來(lái)。O-CTX編號(hào)及其來(lái)源芋螺種類(lèi)等情況列于表3。
35種O-超家族芋螺毒素成熟肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)序列見(jiàn)表4。35種O-CTX前肽(O-CTX，SEQ ID NO36-70)序列見(jiàn)表5。35種O-CTX的編碼多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)見(jiàn)表6。
表3 O-超家族芋螺毒素肽(SEQ ID NO1-35)、前肽(SEQ ID NO36-70)及其編碼多核苷酸(SEQ ID NO71-105)編號(hào)和來(lái)源


注SEQ ID NO77-86；96-105的下游引物均為3’-RACE adapter(20bp)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’
表4 O-超家族芋螺毒素肽(O-CTX，SEQ ID NO1-35)的序列

表5 35種O-超家族芋螺毒素前肽序列(SEQ ID NO36-70)


表6 O-CTX編碼多核苷酸(DNA)序列(SEQ ID NO71-105)











實(shí)施例2 O-超家族芋螺毒素MiEr93M(SEQ ID NO10)、MgJr93M(SEQ ID NO14)和CaFr179M(SEQ ID NO33)的合成根據(jù)芋螺毒素肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的氨基酸序列，采用Fmoc方法人工合成了這三種多肽。具體方法如下。
采用固相合成法中的Fmoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成儀上合成了上述三條芋螺毒素肽。Fmoc氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基為Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)，OBut(Asp)，Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink樹(shù)脂及Fmoc氨基酸，合成步驟參考儀器合成手冊(cè)進(jìn)行。為反應(yīng)完全，在哌啶脫保護(hù)及偶合時(shí)間上分別適當(dāng)延長(zhǎng)，對(duì)難接氨基酸采用雙偶合。回收線(xiàn)性肽粗品，用250*4.6mm，Hypersil ODS-2柱純化，線(xiàn)性肽純度達(dá)70％以上，并通過(guò)質(zhì)譜(MS)鑒定。MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M的分子量分別為2732.16，2797.2和3501.0。線(xiàn)性肽凍干后用于氧化折疊。
實(shí)施例3 芋螺毒素MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M線(xiàn)性肽氧化折疊純化的還原性線(xiàn)性肽MiEr93M、MgJr93M和CaFr179M在室溫下分別氧化折疊24h。氧化折疊緩沖液組成為0.1M醋酸銨(pH 7.8)，20μM充分還原的線(xiàn)性肽，還原型(GSH)和氧化型(GSSG)谷胱苷肽。緩沖液中肽∶GSH∶GSSG的濃度比例為1∶50∶5。氧化反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用TFA(trifluoroacetic acid)調(diào)pH至23以終止氧化反應(yīng)。用液相層析系統(tǒng)(Bio-Rad)純化肽。反應(yīng)混合物載入一制備層析柱(4.6×250mm，Sinochrom ODS-BP)，流速1ml/min，用0.1％TFA洗脫，直到所有的反應(yīng)液被洗提完全。溶劑A是0.1％TFA的乙腈溶液，溶劑B是0.1％TFA的水溶液。梯度洗脫(10％→100％A，90％→0％B，30分鐘)可純化出95％的氧化折疊后的活性肽。
實(shí)施例4 MiEr93M和CaFr179M抗蟲(chóng)活性的測(cè)試。
參照Xiu-hong Wang，Ross Smith et al，Structure functionstudies of ω-atracotoxin，a potent antagonist of insectvoltage-gated calcium channels.Eur.J.Biochem.264，488-494(1999)的方法，測(cè)試MiEr93M和CaFr179M的抗蟲(chóng)活性.將MiEr93M和CaFr179M分別以不同的濃度注射到蟑螂(Periplaneta americana)、棉鈴蟲(chóng)(Heliothis armigera Huber)、煙青蟲(chóng)(Heliothis assultaGuenee)、水稻螟蟲(chóng)(三化螟，Tryporyza incertulas(Walker))、甘蔗螟蟲(chóng)(Chilo infuscatellus Snellen)、荔枝椿象(Tessaratomapapillosa)的幼蟲(chóng)或若蟲(chóng)(體重30 180mg)體內(nèi)，觀察48h內(nèi)蟲(chóng)體的反應(yīng)情況。每只昆蟲(chóng)用微量注射器注射5μL到腹部中央，注射前蟲(chóng)體暫時(shí)置冰上防止昆蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)。對(duì)照同時(shí)注射5μL蒸餾水(ddH2O)或5μL昆蟲(chóng)生理鹽水.兩種毒素分別用昆蟲(chóng)生理鹽水(200mM NaCl，3.1mM KCl，5.4mM CaCl2，5mM MgCl2，2mM NaHCO3，0.1mM NaH2PO4，pH 7.2)配制。毒素濃度為10 103pmol(每克體重)。每組10只昆蟲(chóng)，記錄注射后48h內(nèi)的死亡率。計(jì)算害蟲(chóng)半致死劑量LD50。
計(jì)算公式為y＝(a-b)LD50/x LD50＝xy/(a-b)y是注射后48h樣本群體的死亡百分率，x是中毒劑量(pmol·g-1)，a是最大反應(yīng)劑量，b是最小反應(yīng)劑量。LD50是害蟲(chóng)半致死劑量。
結(jié)果表明(表7)，MiEr93M和CaFr179M對(duì)上述害蟲(chóng)的半致死劑量LD50差異不大，MiEr93M的LD50較CaFr179M的略低。MiEr93M的LD50分別為L(zhǎng)D50蟑螂75±6pmol·g-1、LD50棉鈴蟲(chóng)81±7pmol·g-1、LD50煙青蟲(chóng)66±5pmol·g-1、LD50水稻螟蟲(chóng)78±7pmol·g-1、LD50甘蔗螟蟲(chóng)68±6pmol·g-1、LD50荔枝椿象63±5pmol·g-1。
CaFr179M的LD50分別為L(zhǎng)D50蟑螂103±11pmol·g-1、LD50棉鈴蟲(chóng)108±12pmol·g-1、LD50煙青蟲(chóng)86±7pmol·g-1、LD50水稻螟蟲(chóng)94±9pmol·g-1、LD50甘蔗螟蟲(chóng)88±7pmol·g-1、LD50荔枝椿象76±5pmol·g-1。當(dāng)MiEr93M濃度達(dá)到180pmol·g-1時(shí)，當(dāng)CaFr179M濃度達(dá)到220pmol·g-1時(shí)，所試?yán)ハx(chóng)死亡率均為100％，而對(duì)照組死亡率不到6％，個(gè)別對(duì)照死亡多因注射操作引起。因此MiEr93M和CaFr179M對(duì)所試?yán)ハx(chóng)均有很強(qiáng)的致死作用，且MiEr93M殺蟲(chóng)力更強(qiáng)。
表7 MiEr93M和CaFr179M對(duì)害蟲(chóng)的半致死劑量LD50(pmol·g-1)

實(shí)施例5 測(cè)試MgJr93M的鎮(zhèn)痛活性利用小鼠熱板試驗(yàn)測(cè)定了來(lái)自幻芋螺(C.magus)的SEQ ID NO14MgJr93M肽的鎮(zhèn)痛活性.
測(cè)試用昆明小鼠體重為(20g±2g)。小鼠采用側(cè)腦室給藥，每只注射10μL含不同濃度MgJr93M毒素肽的鹽溶液(150mM NaCl)，用熱板法測(cè)量小鼠腳部受熱鎮(zhèn)痛后舔后足或抬后足并回頭時(shí)間為痛閾時(shí)間，60s為100％鎮(zhèn)痛。注射后觀察小鼠的反應(yīng)。設(shè)5個(gè)劑量濃度0、5、10、20、30ng/只，每劑量5只小鼠。結(jié)果表明(表8)MgJr93M劑量為5ng/只，鎮(zhèn)痛活性(熱板法)為55±20s，在60s附近，鎮(zhèn)痛活性明顯；當(dāng)劑量大于或等于10ng/只時(shí)，鎮(zhèn)痛活性大于60s，且作用4h以上。因此MgJr93M具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)痛活性。
表8 O-CTX MgJr93M肽對(duì)小鼠的活性

上述實(shí)施例只是為了闡明、而不是限制本發(fā)明。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地知道，可對(duì)本文所述的內(nèi)容作其它適當(dāng)?shù)男揎椇妥兓⒖稍诒景l(fā)明或其任何實(shí)施方案的范圍內(nèi)進(jìn)行這種修飾和變化。這樣的修飾和變化都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種O-超家族芋螺毒素肽，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-35中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO36-70中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、尤其優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少97％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)、更優(yōu)選1-2個(gè)、最優(yōu)選1個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)中任一所示的氨基酸序列有所不同的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的芋螺毒素肽，其具有選自SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述O-超家族芋螺毒素肽的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其包含選自下組的核苷酸序列(1)編碼SEQ ID NO1-70中任一所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)EQ ID NO71-105中任一所示的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO71-105中任一所示核苷酸序列中的相應(yīng)成熟肽編碼序列；或(4)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與上述(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
5.一種核酸構(gòu)建體，其中包含權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，以及與之可操作連接、可指導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達(dá)宿主中生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
6.一種表達(dá)載體，其中包含權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體。
7.一種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求6的表達(dá)載體。
8.權(quán)利要求7的細(xì)胞，它是原核細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞，或者真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，或植物細(xì)胞，例如小麥、玉米、水稻、大豆細(xì)胞等。
9.一種藥物組合物，其中包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種殺蟲(chóng)劑組合物，其中包含殺蟲(chóng)有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及任選的載體。
11.一種融合蛋白，其中包含權(quán)利要求1或2所述的芋螺毒素肽以及與之相融合的其它氨基酸序列。
12.一種殺滅害蟲(chóng)的方法，包括對(duì)含有所述害蟲(chóng)的位點(diǎn)使用權(quán)利要求10的殺蟲(chóng)劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的O－超家族芋螺毒素肽(O－Conotoxin，O－CTX)，編碼所述肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及重組生產(chǎn)所述肽的方法。本發(fā)明還涉及所述芋螺毒素肽的人工合成和用途。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1796412SQ20041010356
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者羅素蘭, 長(zhǎng)孫東亭, 張本, 林秋金 申請(qǐng)人:海南大學(xué)