專利名稱：可生物降解的眼角膜細(xì)胞載體膜支架的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可生物降解的眼角膜細(xì)胞載體膜支架的制造方法。
眼角膜移植術(shù)是當(dāng)今治療眼角膜盲的最有效手段，手術(shù)時(shí)，通常是將異體的角膜通過(guò)手術(shù)移植到角膜盲患者的眼上，使眼睛恢復(fù)視覺功能。但異體角膜只能來(lái)源于尸體，由于異體角膜供體的嚴(yán)重缺乏，致使大量角膜盲患者得不到及時(shí)醫(yī)治，同時(shí)異體角膜具有一定的免疫源性，有時(shí)可造成手術(shù)的失敗。因此有人通過(guò)將角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞按要求培養(yǎng)在細(xì)胞貼附的載體膜支架材料上，待形成組織后，再將這種具有生理功能的細(xì)胞組織活性支架移植入眼中，以期達(dá)到復(fù)明的目的。McCulley等(McCulley JP et al.Ophthalmology，1980；87194-201)曾用明膠薄膜作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼附載體，通過(guò)培養(yǎng)，將培養(yǎng)的兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼附生長(zhǎng)在明膠膜上，并將其移植入去掉內(nèi)皮層的兔自體角膜內(nèi)，以觀察移植的內(nèi)皮細(xì)胞生理功能和明膠膜的生物降解性。結(jié)果表明，該明膠薄膜長(zhǎng)時(shí)間不能在角膜內(nèi)生物降解，故使試驗(yàn)不能成功。Elizabeth等(Elizabeth J et al.Tissue Eng.2000；630)用帶孔的膠原海綿膜為載體，分別培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果證明細(xì)胞可在膠原海綿膜上貼附、生長(zhǎng)增殖，但膠原海綿培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞形成的組織透明度僅能達(dá)到正常角膜的50％，故達(dá)不到臨床研究的要求。另外，人羊膜被認(rèn)為是目前作為角膜細(xì)胞貼附生長(zhǎng)最好的載體，Koizumi等(Koizumi N et al.Cornea，2000；1965)用人羊膜作為角膜細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的載體，將兔角膜緣干細(xì)胞植片種植其上進(jìn)行培養(yǎng)，14天后上皮細(xì)胞覆蓋整個(gè)羊膜且貼附良好。對(duì)兔進(jìn)行自體移植可達(dá)到上皮化，但羊膜往往不能被體內(nèi)生物降解，并產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是提供一種可生物降解的眼角膜載體膜支架的制造方法，它能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)和材料的上述不足。
一種可生物降解的眼角膜載體膜支架的制造方法，其特征是以殼聚糖及N-乙酰殼聚糖的甲酸膠體溶液為原料，在平板上或凹面中制膜，干燥后，用堿液去除膜中的甲酸和增塑劑，水洗滌，干燥，再使膜片堿化，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，并將平板膜片壓制成有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架，而凹面膜片干燥后則直接成為有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所制造的膜片支架能被機(jī)體中的溶菌酶等生物降解，降解產(chǎn)物氨基葡萄糖可被機(jī)體吸收利用，形成的組織透明度能達(dá)到正常角膜的90％以上，并且沒有不良反應(yīng)。
下面通過(guò)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1(1)膠體溶液制備分別稱取殼聚糖和N-乙酰殼聚糖，它們的重量分別為1g和1.5g，加入潔凈的三角瓶或其他玻璃容器中，攪拌下加入96.5g甲酸和1g增塑劑甘油，在8～-10℃條件下溶解，放置待多糖全部溶解成膠體后，采用2#或3#砂芯漏斗過(guò)濾，除去微量不溶物，得透明清澈的膠體溶液，靜置或真空條件下脫氣。所用的殼聚糖和N-乙酰殼聚糖的分子量范圍均為200KD～800KD，兩者的重量比為1∶0.4～2，總的重量百分比為2～3％，增塑劑的重量百分濃度為0.5～5。增塑劑為甘油或丁二醇或乙二醇或丙二醇。
(2)制膜取潔凈的聚苯乙烯板或工程塑料板或玻璃平板，調(diào)整水平，量取40ml的膠體溶液，倒在300cm2平板上，使膠體均勻平整，在通風(fēng)櫥中干燥。干燥成膜后，將帶膜的平板放入0.1～1.0mol/L的NaOH或KOH溶液中，中和膜中殘余的甲酸和去除增塑劑，堿處理時(shí)間可以是2～24小時(shí)。將膜取下，放入蒸餾水中洗滌至中性，自然條件下干燥，取膜備用。
(3)帶曲度膜片的制備將制備的平膜用眼用環(huán)鉆切取一定大小的園片，浸于40～50％(重量比)的NaOH或KOH溶液中進(jìn)行堿化，堿化的膜片脫去多余堿液，浸入交聯(lián)劑中，交聯(lián)劑可以是一定濃度的戊二醛或環(huán)氧氯丙烷或乙二醇雙縮水甘油醚或丙二醇雙縮水甘油醚。將膜片放在50～90℃、壓力為3～6Kg/cm2的鋼模下壓制并經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)制成具有特殊曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架。
制成的具有特定曲度的膜支架放入蒸餾水中洗滌至中性，再轉(zhuǎn)移至50～60％(重量比)的乙醇水溶液中進(jìn)一步洗滌有機(jī)殘留物，用三蒸水、生理鹽水進(jìn)一步洗滌，于水中121℃高壓下滅菌或在75％乙醇(水溶液)中滅菌，保存于無(wú)菌的D-hanks液中備用。
實(shí)施例2(1)膠體溶液制備(同前)(2)帶曲度膜片的制備在通風(fēng)櫥中，用移液器吸取一定量的殼聚糖和N-乙酰殼聚糖及增塑劑的甲酸膠體溶液，加入在電機(jī)帶動(dòng)下能旋轉(zhuǎn)的直徑為14mm的聚四氟乙烯板的凹面中，開啟電機(jī)，旋轉(zhuǎn)速度控制在600～800轉(zhuǎn)/min，使膠體溶液在凹面中形成均勻的膠膜層，自然條件下離心干燥，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完畢，形成均勻的帶有特定曲度的膜支架。
曲度膜片的處理加工取出干燥的帶曲度的膜支架，放入0.1～1.0mol/L的NaOH或KOH溶液中，浸泡中和去除殘余的甲酸和增塑劑，放置2hr，取出放入蒸餾水中洗滌至pH6，侵入0.2％的戊二醛水溶液中交聯(lián)，再用三蒸水、生理鹽水洗滌，于水中121℃高壓下滅菌或75％乙醇水溶液中滅菌，保存于無(wú)菌的D-hanks液中備用。
本發(fā)明以天然的可被生物體降解的殼聚糖及N-乙酰化殼聚糖，作為制備角膜細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的載體材料。制備的角膜細(xì)胞培養(yǎng)貼附載體膜支架，其曲度R值分別是6.8、7.8、8.0mm，直徑為10-14mm，濕厚度為40-80um，透光度≥90％，濕含水量為60-70％，載體膜支架通透性為MW2000物質(zhì)均可自由通透。
權(quán)利要求
1.一種可生物降解的眼角膜載體膜支架的制造方法，其特征是以殼聚糖及N-乙酰殼聚糖的甲酸膠體溶液為原料，在平板上或凹面中制膜，干燥后，用堿液去除膜中的甲酸和增塑劑，水洗滌，干燥，再使膜片堿化，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，并將平板膜片壓制成有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架，而凹面膜片干燥后則直接成為有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征是以殼聚糖及N-乙酰殼聚糖的甲酸膠體溶液中前兩者的重量比為1∶0.4～2，它們總的重量百分比為2～3％，增塑劑的重量百分濃度為0.5～5，增塑劑為甘油或丁二醇或乙二醇或丙二醇。
3.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征是所述的交聯(lián)反應(yīng)用的交聯(lián)劑是戊二醛或環(huán)氧氯丙烷或乙二醇雙縮水甘油醚或丙二醇雙縮水甘油醚。
全文摘要
一種可生物降解的眼角膜載體膜支架的制造方法，其特征是以殼聚糖及N－乙酰殼聚糖的甲酸膠體溶液為原料，在平板上或凹面中制膜，干燥后，用堿液去除膜中的甲酸和增塑劑，水洗滌，干燥，再使膜片堿化，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，并將平板膜片壓制成有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架，而凹面膜片干燥后則直接成為有特定曲度的角膜細(xì)胞貼附載體膜支架。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是所制造的膜片支架能被機(jī)體中的溶菌酶等生物降解，降解產(chǎn)物氨基葡萄糖可被機(jī)體吸收利用，形成的組織透明度能達(dá)到正常角膜的90％以上，并且沒有不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61F2/14GK1513563SQ0213530
公開日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2002年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者劉萬(wàn)順, 韓寶芹, 賀君, 楊朝忠, 劉晨光, 劉成圣, 孟祥紅 申請(qǐng)人:青島海洋大學(xué)