專利名稱：作為癌癥治療劑的野生型ras的制作方法
本申請要求2001年8月24日提交的美國臨時申請系列號60/314693的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容整體納入本文中。
本發(fā)明至少部分得到國家衛(wèi)生研究院基金NO.R01CA58554和R01CA78797的支助，聯(lián)邦政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景Ras基因是存在于各種動物包括人和鼠類中的ras超基因家族的成員，該超基因家族包括50個以上的編碼結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因，這些蛋白質(zhì)具有三磷酸島嘌呤結(jié)合位點(diǎn)，在許多各種細(xì)胞內(nèi)信號傳遞通路中起著重要作用。此超家族中的ras亞家族包括H-ras、K-ras(也稱為K ras2)、N-ras、RAP和REL基因(Bredel和Pollack.1999.Brain Res Rev.29.232-49；Beaupre和Kurz rock，1999.J ClinOncol.171071-9)。人ras基因各自的染色體定位是該領(lǐng)域已知的。
三個ras基因(H-ras、K-ras和N-ras)含有6或7個外顯子，分布在基因組DNA的約7-35Kb對之間。取決于具體的ras基因，其中4或5個外顯子含有蛋白質(zhì)編碼區(qū)，這些編碼外顯子中的前三個是編碼ras蛋白質(zhì)的GDP/GTP結(jié)合和GTP酶功能的區(qū)域。這3個ras基因編碼位于細(xì)胞膜內(nèi)表面、活性GTP結(jié)合位點(diǎn)的長約189個氨基酸的p21蛋白質(zhì)。具體講，當(dāng)酪氨酸激酶受體因其配體(如生長因子或激素)的結(jié)合而被激活時，此p21-ras蛋白質(zhì)活化，啟動胞內(nèi)信號傳遞(Bredel和Pollack，1999.Curr Opin Genet Dev.474-6)。ras/Erk通路的后續(xù)下游信號傳遞可激活許多轉(zhuǎn)錄因子，它們根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)控著對外部刺激時細(xì)胞的增殖或分化。
ras/Erk通路受到幾種GTP酶活化蛋白質(zhì)的負(fù)調(diào)節(jié)。當(dāng)p21-ras和GAP之間形成蛋白復(fù)合體時，大大提高了p21-ras蛋白的弱的內(nèi)在GTP酶活性(McCormick，1995，Curr Opin Genet Dev.551-5，Ahmadian等，1996，J Biol Chem，27116409-15)。這提高了GTP酶催化GTP轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP的活性，并使活性GTPp21-ras轉(zhuǎn)變成無活性GDPp21-ras，從而中止下游信號傳遞。參與內(nèi)部信號傳遞通路的非受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶也可能激活p21-ras和ras/Erk通路(Rozakis-Adcock等，1992.Natare，360-689-92；McCormick，1993，Ciba Fonnd Wymp，1761-5；Balteasperger等，1993 Science，260，1950-2)。以上參考文獻(xiàn)中所述的許多蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)和酶活性調(diào)控著p21-ras蛋白質(zhì)和ras/Erk通路。
Ras基因的特別重要方面是它們在癌發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，ras基因野生型無致癌作用。然而，ras的各種突變，所謂“活化性”突變，導(dǎo)致ras基因變成致癌性，它們的表達(dá)導(dǎo)致動物產(chǎn)生惡性腫瘤和培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。野生型、非致癌狀態(tài)的ras基因稱為原致癌基因(proto-oncogenes)，含有激活突變(activating mutation)的Ras基因稱為致癌基因。
已在較多人類腫瘤類型中檢測到ras基因中的活化性點(diǎn)突變，比人腫瘤中其它致癌基因頻率高25-30％(Beaupre和Kurzrock，1999，J Clin Oncol，171071-9，Anderson等，1992，Environ Health Perspect，9813-24；Bos，1989，Cancer Res，494682-9；Rodenhuis和Slebos，1992，Cancer Res，522665s-69s)。例如，在40-50％的結(jié)腸癌(Bos等，1987，Natare 327293-7；Forrester等，1987，Natare327298-303；Burmer等，1991.Environ Health Perspect，9327-31)、80％的胰腺癌(Barmer等，1991.Environ Health Perpect，9377-31；Mariyama等，1989，Jpn J Cancer Res，80602-6；Shibata等，1990，Cancer Res 501279-83，Pinte等，1997，Acta Cytol，41.427-34)和30-50％的肺腺癌(Roden huis和Slebos，1992 Cancer Res 522665s-69s；Rodenhuis等，1988，Cancer Res，485738-41，Reymlds等，1991，Proc Natl Acad Sci USA，881085-9；Suznki等，1990，Oncogene 51037-43；Li等，1994，Tang Cancer；1119-27；Mills等，1995，Cancer Res 551444-7)中可測到突變。這些類型腫瘤中發(fā)現(xiàn)K-ras突變占活化性ras突變的90％以上。此外，在骨髓起源的造血干細(xì)胞腫瘤、精原瘤、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞癌和神經(jīng)母細(xì)胞癌中也找到活化性ras突變。在胃、尿道膀胱、前列腺、皮膚、甲狀腺、頭頸、子宮內(nèi)膜、肝、卵巢、腎、睪丸等癌癥中也發(fā)現(xiàn)有Ras突變。已在許多嚙齒動物系統(tǒng)自發(fā)產(chǎn)生和化學(xué)誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤中檢測到活化的ras致癌基因(Anderson等，1992，Environ Health Perspect，9813-24；Balmain和Brown，1988，Adv Cancer Res，51147-82；Guerrero和Pellicer，1987，Mutat Res，1985293-308)。例如，在小鼠肺腫瘤中測到K-ras致癌基因。
Ras中不是所有的突變都是“活化性”的，因?yàn)椴皇撬型蛔兌紝?dǎo)致ras基因成為致癌基因。Ras前癌基因的激活突變主要發(fā)生在但不總是發(fā)生在該基因的第12、13和61位密碼子，激活突變也見于密碼子59、63、116、117、119、195和146。這些突變的結(jié)果是在無外部刺激時不斷地上調(diào)細(xì)胞中的ras/Erk信號傳遞通路。因此，在細(xì)胞增殖中起著重要作用的此信號傳遞通路組成性地開通了(McCormick 1994 Curr Opn Genet Dev，471-6；Lowy和Willinmsen，1993.AnnuRev Biochum 62851-91)。突變性致癌p21和野生型p21之間生物活性最先觀察到的差異是，內(nèi)在GTP酶的活性野生型比纈氨酸-12致癌突變體高10倍。后來認(rèn)識到可利用這種內(nèi)在GTP酶活性來區(qū)別人腫瘤和野生型ras蛋白中所見到的某些p21突變類型(Trahey和McCormick，1987，Science，238542-5)。發(fā)現(xiàn)GAP后，顯示致癌性p21(密碼子12、13或61有突變)和野生型p21之間的主要生化性能區(qū)別是，GAP能誘導(dǎo)活化性p21GTP復(fù)合體中的GTP水解。野生型p21中GAP-誘導(dǎo)的水解比這些ras突變類型高1000倍(Vagel等，1988，Natare，33590-3；Gibbs等，1988，Proc Natl Acad Sci.USA，855026-30)?；罨疓TP類型中保留的突變比野生型時間長得多。突變所致的不斷信號傳輸至少部分引起了致癌作用。
活化的ras致癌基因遺傳學(xué)上稱為“支配性”基因、支配性基因突變是能產(chǎn)生其表型的突變，即使是同源性的。同一細(xì)胞還表達(dá)野生型等位基因。此突變基因產(chǎn)生的表型支配著同一基因野生型等位基因表達(dá)產(chǎn)生的表型，因?yàn)榛罨膔as等位基因是致癌性的，即使野生型等位基因也同時表達(dá)，故ras致癌基因稱為支配性突變(Barbacid，1987，Annu Rev Biochem，56779-827；Marshall 1991，Pa Med，9410)。
然而，ras致癌基因作為支配性基因的特征可能是不滿意的。編碼真正“支配性”突變的基因，如上所述在其同源性非突變等位基因表達(dá)時，產(chǎn)生正?；虮磉_(dá)水平(而非升高的或過度的表達(dá)水平)的表型。一些研究表明轉(zhuǎn)化性ras致癌基因不以正常水平而是比正常高得多的水平表達(dá)。例如，小鼠NIH/3T3細(xì)胞中以及其它用突變r(jià)as等位基因轉(zhuǎn)化的鼠類細(xì)胞中，突變r(jià)as等位基因表達(dá)水平比對照細(xì)胞中高得多(Hua等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci USA，949614-9；You等，1989.ProcNatl Acad Sci USA，863070-4，Guerrero等；1984，Proc Natl Acad Sci USA，81202-5；Spandidos和Wilkie，1984，Natare，310469-75)此外，從人腫瘤細(xì)胞系分離得到的第一個致癌性ras基因，突變性EJ H-ras 1等位基因，不僅第12個密碼子突變，還含有最后內(nèi)含子中的一個突變，與正常ras基因相比，此突變提高其表達(dá)至少10倍(Cohen和Levinson，1988，Nature，334119-24)。最后，F(xiàn)inney和Bishop(1993，Science，2601524-7)。采用同源重組以轉(zhuǎn)化性突變H-ras等位基因替代一個野生型H-ras等位基因，雖然正常和突變的H-ras基因表達(dá)相等，但雜合細(xì)胞沒被轉(zhuǎn)化，雜合性細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，該轉(zhuǎn)化細(xì)胞擴(kuò)大了突變等位基因。這些具體研究表明ras致癌基因的致癌潛力可能取決于高表達(dá)水平，與支配性突變不一致。
因?yàn)榛罨痳as致癌基因的致癌活性不能完全視為支配性突變的活性，為此需要更全面了解活化ras致癌基因的轉(zhuǎn)化活性或致癌活性，這種了解為癌癥特別是活化ras致癌基因所引起的癌癥可提供更好的治療手段。這種了解也可為ras致癌基因引起的癌癥提供更好的診斷和預(yù)后方法。
目前抗ras治療方法的優(yōu)點(diǎn)是，合成的ras蛋白作為無活性前體蛋白，必須經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾成為具有生物活性(Casey等，1989，Proc Natl Acud Sci USA，868323-7，Hancock等，1989，Cell，571167-77)。此類修飾第一步是用法呢基轉(zhuǎn)移酶(FTase)將15個碳的類異戊二烯(如法呢醇)加到CAAX基序的C末端半胱氨酸上(Hancock等，1989，Cell 571167-77)。牻牛兒基化是另一種轉(zhuǎn)錄后步驟，導(dǎo)致經(jīng)牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(GGTase-1)將20個碳的分子加到CAAX基序中。目前的抗-ras治療法正在探索選擇性干擾這些轉(zhuǎn)錄后步驟的策略(Gibbs等，1993，J Biol Cehm 2687617-20；Tamanoi，1993，Trends Biochem Sci，18349-53；Lerner等，1995，J Biol Chem 27026770-3)。這些策略的一個問題是抑制這些轉(zhuǎn)錄后步驟可能不僅抑制了活化ras蛋白的活性，而且抑制了具有腫瘤抑制作用的野生型ras蛋白。另一問題是ras蛋白以外的蛋白質(zhì)也如上述被轉(zhuǎn)錄后修飾。因此，這些步驟的抑制是非特異性的、可能影響ras以外的蛋白質(zhì)。本申請中所述的方法，表達(dá)的野生型ras不會導(dǎo)致這些缺陷。
發(fā)明概述我們發(fā)現(xiàn)野生型ras基因可抑制細(xì)胞的致癌性或轉(zhuǎn)化表型(即抑制細(xì)胞增殖)。特別是當(dāng)該致癌性或轉(zhuǎn)化表型是由活化的ras基因或由活化的ras信號傳遞通路引起時，因此，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞特別是癌細(xì)胞增殖的一種方法。所述方法包括提高細(xì)胞中一種或多種野生型ras蛋白質(zhì)的胞內(nèi)水平。一個方面，所述方法包括在細(xì)胞中引入野生型ras蛋白質(zhì)的核酸分子。引入的核酸可以是DNA，此時，該核酸還包含操作性連接于編碼野生型ras蛋白質(zhì)的序列的轉(zhuǎn)錄啟動子。引入的該核酸也可以是RNA，其編碼在細(xì)胞內(nèi)能被翻譯成多肽的野生型Ras蛋白或其片段。這兩種情況都提高了一種或多種野生型ras蛋白質(zhì)的胞內(nèi)水平并抑制了細(xì)胞增殖。當(dāng)是人體或其它動物腫瘤中細(xì)胞增殖時，抑制細(xì)胞增殖就停止或減慢了腫瘤的擴(kuò)大、減少了腫瘤的體積或甚至能從人體中消除腫瘤。
另一方面，將一種或多種野生型ras蛋白引入細(xì)胞內(nèi)提高其胞內(nèi)水平，可在野生型ras蛋白中加入一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域以促進(jìn)其引入細(xì)胞。此蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域能促進(jìn)蛋白質(zhì)攝取。這種內(nèi)化的ras蛋白可抑制攝取該蛋白的細(xì)胞增殖。通過注射或吸入途徑可有效地將含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域的ras蛋白給予人或其它動物。
本發(fā)明還涉及野生型ras蛋白或編碼一種或多種野生型ras蛋白的核酸在治療腫瘤或癌癥中的治療用途或預(yù)防腫瘤或癌形成的預(yù)防性用途。診斷為某癌癥的上述人群(即高危人群)是野生型ras預(yù)防性應(yīng)用的可能候選對象。這類人群可能處在高危險(xiǎn)中，因?yàn)榻佑|特殊的環(huán)境(如嚴(yán)重吸煙者)，因?yàn)閷δ承┌┌Y的家族性易感(如遺傳基因?qū)е乱子酶行陨?或其它原因。野生型ras的這種治療性或預(yù)防性應(yīng)用，包括給予個體治療有效量的一種或多種野生型ras蛋白質(zhì)或編碼此類蛋白質(zhì)的核酸分子。
本發(fā)明還包括通過提高細(xì)胞內(nèi)野生型ras蛋白或其生長抑制性片段的濃度來降低細(xì)胞中ERK MAP激酶活性的方法。通過引入編碼野生型ras蛋白的DNA分子并表達(dá)，或通過引入細(xì)胞一種或多種野生型ras蛋白可提高細(xì)胞內(nèi)ras的濃度。
本發(fā)明還提供特征監(jiān)定或評價(jià)人體或其它動物中癌癥的方法，在一實(shí)施例中，所述方法包括測定腫瘤細(xì)胞基因組中獲自受試者的一個或多個內(nèi)源性ras等位基因中的功能性突變的丟失。另一實(shí)施例中，所述方法包括測試腫瘤細(xì)胞中獲自受試者的一個或多個內(nèi)源性ras等位基因中功能性突變的丟失，和一個或多個ras蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平的降低。其它病例中，功能性突變的丟失導(dǎo)致產(chǎn)生丟失了野生型ras蛋白所具有的生長抑制功能的ras蛋白。因?yàn)榛罨膔as引起的大多數(shù)侵襲性癌癥含有一個活化的ras等位基因，和缺乏野生型ras生長抑制活性的第二個ras等位基因，此方法可提供這類癌癥的診斷和患這類癌癥的人或動物的預(yù)后。
本發(fā)明還涉及在雜合性ras敲除小鼠中誘導(dǎo)肺腫瘤形成的方法。
附圖簡述

圖1.采用雜合性K-ras缺陷小鼠的肺腫瘤生物學(xué)試驗(yàn)。a，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。b和d，尿烷和MUC分別處理小鼠的肺腫瘤的復(fù)數(shù)性。c和e尿烷和MUC分別處理小鼠的肺腫瘤負(fù)荷?？招闹鞬-ras+/+小鼠，黑色柱是K-ras+/+小鼠。A/J(A/J×129/Sv-K-ras)F1；129/SvlmJ(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras)F1；C57BL/6J(C57BL/6J×129/Sv-K-ras)F1。星號表示與野生型動物比較P＜0.0001。
圖2.雜合性K-ras缺陷小鼠的肺腫瘤。a和b分別為(A/J×129/Sv-K-ras+/+)F1和(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠肺部的顯微照片。注意與野生型小鼠比較；K-ras缺陷小鼠的腫瘤復(fù)數(shù)明顯增加。c和d分別為(A/J×129/Sv-K-ras+/+)F1和(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠肺腫瘤(腺瘤和癌)4倍放大的光鏡照片。e和d分別為(A/J×129/Sv-K-ras+/+)F1和(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠肺腫瘤40倍放大照片。肺泡支氣管腺瘤中的致癌細(xì)胞為單形態(tài)性，而肺泡支氣管癌中的致癌細(xì)胞為多形態(tài)性；核的大小和形狀不同，含有多個突出的核仁。
圖3.小鼠肺腫瘤染色體6上的LOH。a.(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/+)F1野生型小鼠肺腫瘤中LOH態(tài)K-ras內(nèi)含子2多態(tài)區(qū)PCR-RFLP分析的代表圖。泳道1A/J小鼠對照DNA。泳道2C57BL/6J小鼠對照DNA，泳道3-7(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/+)F1野生型腺瘤肺腫瘤。b.氯丁二烯誘導(dǎo)的B6C3F1小鼠肺腺癌LOH分析的代表圖，采用K-ras密碼子61突變(CAA→CTA)作為標(biāo)記。分圖7B6C3F1小鼠對照DNA；分圖3氯丁二烯誘導(dǎo)的B6C3F1小鼠肺腺癌無LOH；分圖1、2、4-6氯丁二烯導(dǎo)的B6C3F1小鼠肺腺癌含有LOH。c.顯示標(biāo)記D6MCO12的代表圖。泳道1C3H/HeJ小鼠對照DNA；泳道2C57BL/6J小鼠對照DNA；泳道3B6C3F1小鼠對照DNA；泳道4-18氯丁二烯誘導(dǎo)的B6C3F1小鼠肺腺癌。
圖4.野生型K-ras對轉(zhuǎn)化N1H/3T3細(xì)胞系(R16)的生長抑制。a.載體對照和K-ras4B轉(zhuǎn)染R16細(xì)胞的生長曲線。在相同條件下單用pCR3.1載體或野生型K-ras4B純化質(zhì)粒DNA1.5-2微克轉(zhuǎn)染同一代R16細(xì)胞。計(jì)數(shù)1-6天G418抗性R16細(xì)胞，各數(shù)據(jù)點(diǎn)為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。b和c.轉(zhuǎn)染的野生型K-ras4B抑制細(xì)胞集落形成。將1000個G418抗體R16細(xì)胞接種在4個平皿(10cm)每一個中，在加有10％FBS和50μg/mlG418的DMEM中培養(yǎng)12天。用10％福爾馬林液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)可見集落(直徑＞1.5mm)。星號表示與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比p＜0.05。
圖5.野生型K-ras對小鼠肺腫瘤細(xì)胞系(CM2)的生長抑制。a.載體對照和K-ras4B轉(zhuǎn)染LM2細(xì)胞的生長曲線。在相同條件下單用PCR3.1載體或野生型K-ras4B純化質(zhì)粒DNA1.5-2微克轉(zhuǎn)染同一LM2細(xì)胞。將G418抗性LM2細(xì)胞亞克隆成為穩(wěn)定的克隆。一個克隆命名為LM2-4S-7，表達(dá)較高水平轉(zhuǎn)染的野生型K-ras，稱為LM2-K-ras4BH。稱為LM2-4S-4的另一克隆表達(dá)轉(zhuǎn)染水平低3倍的野生型K-ras，命名為LM2-K-ras4BL。計(jì)數(shù)1-4天G418抗性載體對照、LM2-K-ras4BH和LM2-K-ras4BL細(xì)胞。各數(shù)據(jù)點(diǎn)為兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。星號表示與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比p＜0.05。b和c.轉(zhuǎn)染的野生型K-ras4B抑制細(xì)胞集落形成。將1000個G418抗性載體對照、LM2-K-ras4BH和LM2-K-ras4BL接種在4個平皿(10mm)中的每一個。在加有10％FBS和50μg/ml G418的CPRL1066中培養(yǎng)12天。用10％福爾馬林液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)可見集落(直徑＞1.5mm)。星號表示與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比p＜0.05。d.轉(zhuǎn)染K-ras4B克隆攜帶的獨(dú)特序列的RFPCR。泳道1-14LM2-4S-1、LM2-4S-2、LM2-4S-3、LM2-K-ras4BL、LM2-K-ras4BH、LM2-4S-8、LM2-4S-9、LM2-4S-10、LM2-4S-11、LM2-4S-L1、LM2-4S-L3、LM2-4S-L4、LM2-4S-M和載體對照。
圖6.表達(dá)野生型K-ras的LM2細(xì)胞中K-ras和ERK的活化狀態(tài)。a.Ras活化。將LM2細(xì)胞系裂解物與偶聯(lián)于與谷胱苷肽瓊脂糖的GST-RBD，或與谷胱苷肽瓊脂糖單獨(dú)培養(yǎng)(左圖)。用抗K-rasF234抗體(Santa Cruz Biotechnology)作Western印跡，檢測結(jié)合的K-ras。用K-rasV12和K-rasN17的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，裂解并進(jìn)行上述相同的結(jié)合試驗(yàn)(右圖)b.ERK活性，用抗ERK(上圖)和抗磷酸化ERK(下圖)抗體，檢測全細(xì)胞裂解液，將未經(jīng)EGF刺激的HEK293細(xì)胞作為陰性對照，經(jīng)EGF刺激的HEK293細(xì)胞作為陽性對照。免疫印跡中的雙條帶對應(yīng)于GRK1(44KD)和ERK2(42KD)。
圖7.野生型K-ras轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的裸鼠致瘤性試驗(yàn)。a和b.抑制裸鼠的腫瘤產(chǎn)生(左側(cè)為載體對照，右側(cè)為K-ras4B轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。c.測定腫瘤大小。d.測定裸鼠腫瘤最終重量。星號表示與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比p＜0.05。
圖8A.顯示非小細(xì)胞肺癌中LOH的代表性放射自顯影照片，各為自顯影圖、微衛(wèi)星標(biāo)記、箭頭、等位基因缺失；N.正常DNA；T.腫瘤DNA。各樣品的左圖為肺腫瘤無LOH。B.K-ras2基因密碼子12突變的代表性例子。左側(cè)，肺腫瘤無K-ras2突變。右側(cè)，肺腫瘤含K-ras2基因12th密碼子突變(GGT→TGT轉(zhuǎn)換)。
圖9非小細(xì)胞肺癌染色體12的LOH圖譜，有14份樣品在一個或多個基因座上顯示LOH。左側(cè)，12份樣品還保留了活化的K-ras2等位基因。右側(cè)，2份樣品不含K-ras2突變，從NCB1 Human Genome Resourse產(chǎn)生染色體12的基因圖譜。L.大細(xì)胞癌。A.腺癌。
發(fā)明詳述定義本文中“野生型”指某基因的核苷酸序列或其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該序列見于含此特定基因的大多數(shù)生物或細(xì)胞中。如果某基因或蛋白質(zhì)不是野生型，它則是突變體。突變體基因具有的核苷酸序列與野生型基因的序列不同。突變體蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列與野生型蛋白質(zhì)的序列不同。
本文中，野生型ras蛋白具有的活性，稱為“生長抑制”活性。細(xì)胞中表達(dá)野生型ras活性，或其它野生型ras活性后，衡量生長抑制是與不表達(dá)野生型ras或不表達(dá)其它野生型ras活性的細(xì)胞相比，細(xì)胞的一種或多種生長或增殖參數(shù)降低或受到抑制。對這些細(xì)胞所作的許多不同測定是顯著的生長抑制活性。例如，細(xì)胞周期時間減少，細(xì)胞分裂時間減少，G1細(xì)胞周期時像時間減少等，是野生型ras生長抑制活性的特征。如果表達(dá)野生型ras活性的細(xì)胞是腫瘤、癌或轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與對照相比軟瓊脂中集落形成效率的降低或病灶形成減少等特性測定，是野生型Ras的生長抑制活性的特征，如果表達(dá)野生型ras活性的細(xì)胞包含在人或動物的腫瘤內(nèi)或是腫瘤的一部分，腫瘤體積減少、腫瘤生長速度減慢、或轉(zhuǎn)移速度減慢等特性測定，是野生型ras生長抑制活性的特征。
本發(fā)明一重要方面是，細(xì)胞中表達(dá)野生型ras基因可抑制或阻遏細(xì)胞增殖。抑制或阻遏細(xì)胞增殖是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的術(shù)語，指減慢或停止細(xì)胞分化，使細(xì)胞數(shù)量不增加。減慢細(xì)胞生長的程度可以不同。這里，任何腫瘤細(xì)胞生長的改變都在本申請范圍內(nèi)，在本申請的實(shí)施例中將說明表明細(xì)胞生長減慢或停止的細(xì)胞特征的各種測定方法。野生型ras抑制細(xì)胞生長另一方面，包括屬于本申請范圍的腫瘤細(xì)胞的凋亡(程序性細(xì)胞死亡)和誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
本文中，“滅活突變”或“功能性突變的丟失”，指ras基因中或周圍的突變，此種突變消除或降低了該基因編碼的ras蛋白的生長抑制活性。一個例子是ras基因編碼區(qū)中的一個或多個替代，缺失，插入或重復(fù)，這些變化不導(dǎo)致該基因表達(dá)的ras蛋白數(shù)量減少，而是就每個分子而言，含這種突變的ras蛋白的生長抑制活性比不含滅活突變的ras蛋白要差，這種類型的滅活突變可能發(fā)生在ras基因前三個編碼外顯子之一或一個以上中。
滅活突變的另一個例子是ras基因中，其附近或影響ras基因的突變，此突變使ras基因不能表達(dá)ras蛋白或降低其表達(dá)量。例如，此種突變可降低ras啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，引起ras基因轉(zhuǎn)錄物的異常剪接、或減少剪接、或引起細(xì)胞內(nèi)rasmRNA或蛋白質(zhì)半衰期減少。這種情況時，雖然產(chǎn)生的ras蛋白每個分子具有與野生型ras蛋白相同的生長抑制活性，但含此種突變的細(xì)胞含有的野生型ras蛋白數(shù)量減少，ras的生長抑制活性程度降低。
其它突變導(dǎo)致整個ras等位基因缺乏或ras等位基因完全缺失，因而不能從該DNA序列產(chǎn)生ras蛋白。其它類型的突變包括ras基因序列中的內(nèi)部重復(fù)，一種類型是串聯(lián)重復(fù)。
還應(yīng)認(rèn)識到細(xì)胞中野生型ras生長抑制活性量的降低，也可能由于DNA中特異性ras基因內(nèi)或附近半胱氨酸殘基甲基化的增加或改變。細(xì)胞DNA中的這種后成性變化導(dǎo)致超甲基化是本領(lǐng)域熟知的，通常認(rèn)為會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平降低。
應(yīng)認(rèn)識到野生型ras的生長抑制活性與細(xì)胞中ERK MAP激酶活性降低相關(guān)。ERKMAP激酶是ras信號傳遞通路的下游，這是本領(lǐng)域熟知的。細(xì)胞內(nèi)野生型ras蛋白濃度升高將導(dǎo)致ERK MAP激酶活性降低(見實(shí)施例2)。
本發(fā)明還提供通過提高細(xì)胞內(nèi)野生型ras蛋白濃度來降低細(xì)胞中ERK MAP激酶活性的方法。
本文中，“激活突變”或“獲得功能性突變”，指通常發(fā)生在ras基因編碼序列中發(fā)生的能導(dǎo)致產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)化致腫瘤或致癌活性的ras蛋白質(zhì)的突變。生化性質(zhì)上，含激活突變的ras蛋白也稱活化的ras蛋白，可能降低GTP酶的活性，這樣ras蛋白被固定在活性GTP結(jié)合狀態(tài)，活化的ras蛋白也可能降低核苷酸結(jié)合親和力，因此以提高的速率，將ras結(jié)合的GDP交換成GTP，也可能是GAP蛋白的活性降低導(dǎo)致GTP結(jié)合的ras轉(zhuǎn)變成GDP結(jié)合的ras。這些情況均導(dǎo)致GTP結(jié)合的ras累積，其中的ras引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已知激活突變發(fā)生在ras基因的密碼子12、13、54、61、63、116、117、119、145和146中。這些突變發(fā)生在ras蛋白的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)或其附近。這些密碼子中的突變不是都能引起相同程度的活化，同樣，這些密碼子中的突變不都是活化性的。這些密碼子的一個或多個中的某些突變可以是功能性突變的丟失，可通過美國專利5591582中所述的一些技術(shù)檢測此激活突變，該專利中的內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)。
本文中，將DNA分子“引入”細(xì)胞，指本領(lǐng)域已知的將DNA攝入細(xì)胞的各種方法，其中一種將分離的DNA引入細(xì)胞的方法稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染通常用各種能促進(jìn)細(xì)胞攝取DNA的方法處理細(xì)胞或DNA，例如，可用化學(xué)方法處理細(xì)胞提高它們的DNA滲透性，也可以通過將DNA加入到脂質(zhì)體中來處理DNA，使細(xì)胞可內(nèi)化DNA。
也可用病毒將核酸(DNA或RNA)引入細(xì)胞，例如，可將編碼野生型ras蛋白的cDNA克隆入一病毒基因組而引入細(xì)胞。用這種病毒感染細(xì)胞，結(jié)果將該病毒基因組引入了細(xì)胞。由于克隆的基因是病毒基因組的一部分，故其與病毒基因組一齊引入了細(xì)胞。這類病毒“載體”可能含有DNA或RNA基因組。許多這類病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。基因組中克隆了野生型ras基因的病毒載體可稱為“重組”病毒。
本文中“致癌性”、“轉(zhuǎn)化的”或“致腫瘤的”，指癌細(xì)胞或惡性細(xì)胞具有的特性(即表型)，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這類特性的各種情況。致癌細(xì)胞注射到動物將形成腫瘤而動物注射非致癌細(xì)胞后不形成腫瘤，本文中所謂“致癌基因”，是引入細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)后能引起非癌細(xì)胞成為癌細(xì)胞的基因。本文中，一個這樣的致癌基因是含激活突變的ras基因，這種ras基因可稱為“活化的”ras基因。“抗致癌基因”或“腫瘤抑制”基因，是引入細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)后引起癌細(xì)胞變成非癌細(xì)胞的基因。本文中一個這樣的腫瘤抑制基因是野生型ras基因。
“瘤形成”是一種導(dǎo)致異常組織形成或生長的過程，此異常組織通過比正常組織更快的細(xì)胞增殖而生長，并能在引起新生長的刺激中止后繼續(xù)生長。
含不同拷貝數(shù)野生型ras的小鼠中腫瘤的發(fā)生率設(shè)計(jì)這些實(shí)驗(yàn)來測定野生型K-ras在肺腫瘤發(fā)生中的作用。缺乏兩種K-ras等位基因的小鼠由于胎肝缺陷和貧血，在妊娠12-14天之間不能存活而死亡(Johnson等1997，Genes Dev，112468-81)，因此不可能對它們測試。然而，雜合性K-ras缺陷小鼠是評估野生型K-ras在肺腫瘤發(fā)生中作用的另一極好選擇，因?yàn)榻黄废敌∈蟮姆文[瘤100％顯示活化的K-ras等位基因(You等，1989，Proc Natl Acad SciUSA 863070-4)。如下所述進(jìn)行了這些研究。
動物和F1雜合子的產(chǎn)生6周齡A/J，129/SvlmJ和C57BL/6J雌鼠獲自Jackson Labontories(Bar Harbor，Maine)。按先前報(bào)道(Johnson等，1997，Genes Dev.112468-81)發(fā)育成功129/Sv-K-ras+/-(K-ras“敲除”)小鼠。此敲除小鼠含有DNA結(jié)構(gòu)中一插入突變，此DNA結(jié)構(gòu)中K-ras基因含有一個neo基因(Johnson等，1997，Genes Dev.112468-81)。動物飼養(yǎng)在HEPA過濾空氣控制室的帶硬木底和防塵罩的塑料籠子中(24±1℃，12/12小時光照/黑暗循環(huán))。動物吃嚙齒動物實(shí)驗(yàn)室食物(#5001，Purina)，自由飲水。7天檢疫期后，交配動物發(fā)育成(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1和(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠產(chǎn)生的繁殖群。研究期間每月監(jiān)測所有動物的體重。
小鼠的基因型收集各種(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1和(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠剪下的尾組織，均漿，并在裂解液(鏈霉蛋白酶0.4mg/ml，10％十二烷基磺酸鈉(w/v)、10mM Tris、400mM NaCl和2mM EDTA)中31℃溫育過夜，然后氯仿抽提，冰冷乙醇沉淀。用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)給每只小鼠剪下的尾組織分離的DNA就是否存在K-ras突變，進(jìn)行基因分型。簡言之，采用一對PCR引物(oIMR0135’-CTTGGGTGGAGAGGCTATTC-3’；oIMR0145’-AGGTGAGATGACAGGAGATC-3’)擴(kuò)增neo插入物的280bp產(chǎn)物，用另一對PCR引物(oIMR0155’-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3’TCR Cd-1；oIMR165’-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3’)擴(kuò)增作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的150bp產(chǎn)物。含有兩個野生型K-ras等位基因[K-ras(+/+)]的DNA顯示只為一條150bp片段，而含有野生型K-ras等位基因和目標(biāo)突變(+/-)等位基因的DNA在PCR后顯示150bp和280bp兩條帶。重復(fù)此篩檢至少一次得以證實(shí)。使雜合子129/Sv-K-ras+/-雌鼠與A/J和C57BL/6J雄鼠交配，50％的后代小鼠具有K-ras目標(biāo)突變(tml)，其余50％只有野生型K-ras基因。
K-ras+/-小鼠中的肺腫瘤形成圖1a顯示尿烷和MNU誘導(dǎo)肺腫瘤生成的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將6周齡(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1和(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1雜交鼠根據(jù)K-ras基因型和致癌劑處理類型，隨機(jī)分成12組。尿烷(氨基甲酸乙酯，純度＞99％)和N-甲基亞硝基脲(MNU，純度99％)購自Sigma Chemical公司(圣路易斯，密蘇里州)。用于生物試驗(yàn)前刻，配制這些化學(xué)致癌劑。尿烷和MNU均溶于生理鹽水。對于尿烷處理，用于生物試驗(yàn)的100只雄鼠包括17只(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠，12只(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠，15只(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠，19只(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠和18只(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠，所有小鼠一次腹膜內(nèi)注射(i.p.)含尿烷(1mg/每克體重)的0.2ml磷酸緩沖液。
對于MNU處理組，生物試驗(yàn)用的83只雄鼠包括14只(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠、13只(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠、14只(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠、15只(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠、13只(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠和14只(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠。所有小鼠一次腹膜內(nèi)注射(1P)含MNU(50mg/每克價(jià)重)的0.2ml磷酸緩沖液。
因?yàn)樾∈螽a(chǎn)生肺腫瘤主要取決于遺傳背景的不同，采用三種不同F(xiàn)1小鼠以避免可能的品系特異性作用。用尿烷處理后18周和用MNU處理后12天，用CO2窒息處死所有12組小鼠，取出一部分肺腫瘤和正常組織，在液氮中急凍，用Tellyesniczky液固定各腫瘤的代表性部分，測定各腫瘤的三維尺寸測定腫瘤體積，用三維尺寸平均值作為直徑。確定半徑(直徑/2)并用公式體積＝(4/3)πr3(r為半徑)計(jì)算腫瘤總體積。用單程ANOVA確定對照和治療組之間每只小鼠肺腫瘤數(shù)目的差異。用雙程ANOVA確定對照和治療組之間肺腫瘤數(shù)目和大小的差異。
如圖1a所示，給6周齡(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1或(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠，野生型或雜合性K-ras敲除鼠一次腹膜內(nèi)注射1mg/每克體重劑量的尿烷。用尿烷處理后18周，三組雜合性K-ras缺陷小鼠都產(chǎn)生了比純合性野生型小鼠明顯更多更大的肺腫瘤。如圖1所示，用尿烷處理的(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1雜合性K-ras缺陷小鼠，每只肺產(chǎn)生的腫瘤比用同一致癌劑處理的野生型(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠多4倍。類似地，尿烷處理(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1和(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1雜合性K-ras缺陷小鼠，導(dǎo)致每只肺產(chǎn)生的腫瘤比它們各自的野生型同窩出生小鼠多4-5倍(圖1b)。對肺腫瘤總體的作用甚至更顯著，具有A/J×129/Sv背景、129/SvlmJ×129/Sv背景和C57BL/6J×129/Sv小鼠背景的雜合性K-ras缺陷小鼠腫瘤體積分別增加30倍、19倍和8倍(圖1c)。
雜合性K-ras缺陷性小鼠的大多數(shù)肺部大腫瘤(60％以上)是腺癌(圖2b、d和f)相反，用尿烷或N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)處理的野生型小鼠的腫瘤都是小細(xì)胞肺腺瘤(圖2a、c和e)，如圖2c和e所示，腺瘤的特征是呈單形態(tài)生長模式，通常由分化良好的細(xì)胞組成。雜合性K-ras缺陷小鼠的肺腫瘤大約60％為腺癌(圖2d和f)，小鼠肺腺癌包含的細(xì)胞分化程度不同(圖2f)，這些癌瘤顯示正常肺泡結(jié)構(gòu)完全喪失、核/漿此例提高、核聚集、細(xì)胞學(xué)非典型性、生長模式異質(zhì)性和侵入相鄰的支氣管和血管。這些結(jié)果提示丟失野生型K-ras顯著促進(jìn)了未分化惡性肺腫瘤的發(fā)育。
這些發(fā)現(xiàn)出乎意料，表明野生型K-ras等位基因在化學(xué)誘生的肺癌發(fā)生中起著腫瘤抑制劑作用。進(jìn)行了用MNU作為致癌劑的第二次肺腫瘤生物試驗(yàn)。MNU是一種直接作用的烷化劑，不需要經(jīng)過代謝的活化，而尿烷是前致癌劑需經(jīng)代謝而活化。用類似于尿烷所述的方案以MNU處理(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1或(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠。見圖1d和e，經(jīng)MNU處理的K-ras缺陷小鼠在所有這三種背景的小鼠中腫瘤復(fù)數(shù)增加6倍，腫瘤體積增加32-50倍。
肺腫瘤中的K-ras激活突變分析了上述小鼠中肺腫瘤的K-ras激活突變。用TRIyol試劑(Gibco BRL)分離肺腫瘤的DNA，用作PCR反應(yīng)的模板，并測定PCR產(chǎn)物的DNA序列。前已報(bào)道過K-ras處顯子1和2的PCR引物序列(You等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，863070-4)。還如前文所述(You等，同上)進(jìn)行了PCR反應(yīng)和PCR產(chǎn)物的直接測序。
如表1所示，對K-ras第一外顯子和第二外顯子作序列分析，揭示K-ras野生型小鼠所有分析的尿烷誘導(dǎo)腫瘤都含有密碼子61第二位的AT→TA顛換。在雜合性K-ras缺陷小鼠用尿烷處理產(chǎn)生的肺腫瘤中觀察到類似頻率和類型的K-ras突變。與此相似，野生型小鼠或雜合性K-ras缺陷小鼠的MNU誘導(dǎo)肺腫瘤都在K-ras密碼子12的第二位含有GC→AT的轉(zhuǎn)換(表1)。
表1肺腫瘤中檢測到的K-ras基因中的激活突變
小鼠肺腫瘤中遠(yuǎn)端染色體6的LOH此項(xiàng)研究中，申請人進(jìn)一步檢測了K-ras激活突變和K-ras區(qū)中標(biāo)記丟失(雜合性丟失或LOH)之間的關(guān)系，表明腫瘤中丟失了K-ras的其它野生型等位基因。
國家毒理學(xué)計(jì)劃(National Toxicology Program)(NTP)提供了B6C3F1小鼠的二組小鼠肺腫瘤供K-ras突變和LOH分析。第一組得自通過吸入而接觸0、1、2或4mg/m3V2PO5二年的小鼠，第二組得自用氯丁二烯處理的小鼠。已報(bào)道過氯丁二烯誘生腫瘤的肺腫瘤復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)和K-ras突變分析(Sills等，1999，Carcinagenesis，20657-62，1996，NTP Technical Repart 467，NIH出版號96-3957，NIEHS，NIHResearch Triangle Park.NC)。在V2PO5研究中用42個小鼠肺腫瘤進(jìn)行標(biāo)記D6MIT14的等位型分析(2個為未處理小鼠，40個為接觸V2PO5的小鼠)。D6MIT14獲自Research Genetics有限公司(Huntsville，阿拉巴馬州)。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，當(dāng)觀察到可見的差別時給等位基因丟失評分。用福爾馬林固定氯丁二烯誘導(dǎo)的肺腫瘤，石蠟包埋。因此不可能獲得D6MIT14標(biāo)記的PCR滿意結(jié)果。為評估K-ras附近的LOH，利用C57BL/6和C3H小鼠之間為多態(tài)性的一種標(biāo)記D6MCO12(引物序列D6MCO12-1F 5’GATGTCAAACGTGAGAGTGTC3’，SEQ ID NO.-和D6MCO12-1R，5’GCGCTGACTCGCTTCTTCCAT3’，SEQ ID NO.-)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)。結(jié)果用K-ras密碼子61突變(CAA→CTA)作為標(biāo)記進(jìn)一步證實(shí)。
見表2小結(jié)，檢測了五氧化釩(V2PO5)誘導(dǎo)的肺腺癌中K-ras活化情況，29個(73％)有突變。還對這些腫瘤的K-ras區(qū)標(biāo)記D6MIT14作了LOH類型分析，其中18個顯示等位基因丟失(表2)。V2PO5誘生腫瘤中最常見的K-ras突變是密碼子12的第二個堿基GA→AT轉(zhuǎn)換成GA→TA轉(zhuǎn)換(數(shù)據(jù)來顯示)圖譜中D6MIT14位于K-ras的0.5cM內(nèi)(Manenti等，1999，Genane Res，9639-46)。D6MIT14的等位丟失與腫瘤中K-ras突變密切相關(guān)。18個腫瘤中16個(89％)有等位基因丟失和K-ras突變。利用K-ras密碼子61突變(CAA→CTA)和距K-ras約5cM的D6MCO12，申請人檢測了這些樣品中的LOH水平。如圖3b和c及表2所示，19個等位基因丟失的腫瘤中16個(84％)也有K-ras突變，表明這些標(biāo)記的等位基因丟失和K-ras活化之間密切相關(guān)。這些結(jié)果還表明K-ras野生型小鼠發(fā)病率較低，肺腫瘤體積較小，是保持野生型K-ras等位基因的結(jié)果。對(A/J×129/Sv-K-ras+/-)F1、(129/SvlmJ×129/Sv-K-ras+/-)F1或(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠各6只的18個尿烷處理肺腫瘤進(jìn)行了PCR-RFLP分析，wt/wt小鼠的18個肺腫瘤沒有一個含等位基因丟失，圖3a顯示(C57BL/6J×129/Sv-K-ras+/-)F1小鼠肺腫瘤LOH態(tài)分析的代表性結(jié)果。
表2小鼠肺腫瘤中與K-ras活化相關(guān)的遠(yuǎn)端染色體6上的LOH
aLOH和K-ras突變數(shù)據(jù)引自Hegi等人(Hegi等，1994，Cancer，Res，546257-64)bK-ras突變數(shù)據(jù)引自Sills等(Sills等，1999，Carcinogenesis，20657-62)
診斷和預(yù)后試驗(yàn)本發(fā)明提供特征簽定人或動物中腫瘤或癌的方法。一方面，所述方法包括分析腫瘤或癌樣品中一種或多種ran基因的一個或多個等位基因，目的是檢測ras基因中或附近的突變。一實(shí)施例中，分析了特異性H-ras、K-ras和N-ras等位基因。另一實(shí)施例中分析了多種H-ras、K-ras、或N-ras基因的等位基因。這種分析通常包括分析腫瘤或癌細(xì)胞基因組DNA的某些基因類型，可用各種方法進(jìn)行。優(yōu)選該分析包括分析ras基因DNA序列決定簇的某些類型?；蚍中筒话ǚ治霾荒軝z出改變的基因中單個堿基對類型突變的序列。
在一種分析中，用PCR分析了從腫瘤或癌分離的DNA。選擇ras基因區(qū)域或周圍區(qū)域，制備能與此區(qū)域基因組DNA雜交的PCR引物?？芍苽鋜as基因中或ras基因周圍區(qū)域基因組序列已知的任何序列的這類引物?？捎糜趓as基因周圍區(qū)域的一組標(biāo)記是多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，它們在人類和某些動物基因中的序列和位置是本領(lǐng)域已知的。在PCR反應(yīng)中應(yīng)用這些引物擴(kuò)增啟感興趣ras基因的基因組區(qū)域。可用單次PCR反應(yīng)擴(kuò)增含ras基因的整個基因組區(qū)域，或者進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，每次擴(kuò)增感興趣ras基因的一個不同區(qū)域。優(yōu)選用PCR反應(yīng)擴(kuò)增感興趣ras基因的整個編碼區(qū)。此外，也可擴(kuò)增感興趣ras基因的內(nèi)含子和周圍的基因組區(qū)域。
進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析。PGR產(chǎn)物分析可有不同類型，分析類型通常取決于該分析試圖檢測的突變類型。例如，分析腫瘤或癌細(xì)胞基因組特定PCR產(chǎn)物的大小，與采用對照細(xì)胞DNA(即已知含野生型ras基因)作PCR的產(chǎn)物大小相比較，可檢測該基因組區(qū)域中的DNA插入或缺失。本領(lǐng)域熟知，如果兩區(qū)域之間基因組區(qū)域中存在DNA插入，當(dāng)用兩種PCR引物擴(kuò)增該基因組時，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物大小與用無插入基因組DNA作PCR所得產(chǎn)物的大小相比更大。同樣，兩種PCR引物之間基因組DNA缺失導(dǎo)致的PCR產(chǎn)物要比用不含缺失的基因組DNA獲得的對照PCR產(chǎn)物小。此種分析可檢測到與野生型基因組相比PCR產(chǎn)物尺寸的較大變化(如至少10％的變化)。通常通過比較二個或多個PCR產(chǎn)物的相對大小來確定PCR產(chǎn)物的大小。例如，將懷疑有ras突變的基因組PCR產(chǎn)物的大小與已知無ras突變的基因組PCR產(chǎn)物大小作比較。利用PCR產(chǎn)物在電場，如凝膠電泳中的遷移不難比較相對大小，瓊脂糖凝膠電泳常用于此目的。
分析PCR產(chǎn)物的另一種方法是通過測定PCR產(chǎn)物的所有或部分核苷酸序列。此分析方法檢測PCR產(chǎn)物的相對大小變化不超過10％。此方法也可檢測DNA序列中不會導(dǎo)致相對大小變化的改變。例如測定和比較獲自二種不同細(xì)胞DNA擴(kuò)增的同一PCR產(chǎn)物的序列，可檢測到DNA區(qū)域中的單個或多個核苷酸改變、替代等。DNA序列測定和PCR產(chǎn)物序列測定的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的。常采用鏈未端測序方法。常用自動化測序儀進(jìn)行DNA測序。
另一種分析類型，采用分離自腫瘤或癌細(xì)胞的RNA，優(yōu)選mRNA，作為模板在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中產(chǎn)生DNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，采用的PCR引物具有已知為待測ras基因的mRNA中的序列?？扇缟纤鲞x擇各種mRNA引物以擴(kuò)增該特定ras基因的全長mRNA序列。這可如上所述用一次或多次PCR反應(yīng)進(jìn)行。然后如所述進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析。在一種分析中，PCR產(chǎn)物的存在或缺乏，或其大小的變化與對照相比，表明ras基因組區(qū)域中有大的變化，如大的插入或缺失。還有，這種分析通常采用PCR產(chǎn)物作凝膠電泳。在另一種分析中，用本領(lǐng)域熟知的方法測定PCR產(chǎn)物的DNA序列。
也可用本領(lǐng)域熟知的其它方法測試ras基因、轉(zhuǎn)錄物的存在，或二者的變化，與野生型比較。一些這種方法包括Southen印跡、Northen印跡、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、S1核酸酶試驗(yàn)等。
除了分析rasDNA和RNA突變的方法外，也可檢測ras蛋白本身是否存在變化。例如，根據(jù)編碼特定ras蛋白質(zhì)的基因中存在的特異性突變，可采用本領(lǐng)域熟知的各種能特異性結(jié)合不同ras蛋白質(zhì)(H-ras，K-ras和N-ras)的抗體。例如可得到只有編碼該蛋白基因的特定密碼子中有激活突變才與ras蛋白結(jié)合的抗體?？刹捎闷渌挥性摰鞍踪|(zhì)上不含突變或至少無已知的特征性激活突變才與ras蛋白結(jié)合的抗體。這些差異性結(jié)合抗體作用的基礎(chǔ)是特定ras蛋白質(zhì)的構(gòu)型。例如，可導(dǎo)致某ras蛋白構(gòu)型改變的突變，或能或不能被某特異性抗體結(jié)合。許多這類抗體可購買到(如Oncogene Science)。因此通過使用這些抗體，可測定腫瘤或癌細(xì)胞中是否存在特異性ras突變蛋白，還可確定是否存在特異性突變。
可用這類抗體分析ras蛋白質(zhì)，采用本領(lǐng)域熟知的各種試驗(yàn)。例如，免疫沉淀、Western印跡和免疫組化是常用的方法。采用抗體的其它試驗(yàn)是本領(lǐng)域所知的，可運(yùn)用。某些抗體在一種或多種試驗(yàn)中可得到良好結(jié)果。
如上所述，ras基因的超甲基化可導(dǎo)致細(xì)胞中野生型ras活性表達(dá)降低。本領(lǐng)域熟知各種方法可檢測某特定基因的超甲基化。在一方法中，采用了一對限制性內(nèi)切核酸酶，它們能識別DNA中相同的核苷酸序列，但能根據(jù)甲基化序列中是否有特定核苷酸而區(qū)別性切割該序列。然后用Southen印跡分析切割的DNA，所用的探針應(yīng)跨越一個或多個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。通過與對照相比，Southen印跡上DNA條帶模式的差異，可確定腫瘤或癌細(xì)胞基因組DNA中甲基化位點(diǎn)的變化。檢測超甲基化的其它方法包括亞硫酸氫鹽處理基因組DNA以將其中的甲基化半胱氨酸改變成不同的核苷酸堿基。然后用各種技術(shù)檢測此改變的堿基，甲基化敏感的PCR是這些技術(shù)之一。其它方法包括各種DNA測序技術(shù)。這種技術(shù)之一是基因組測序?？刹捎闷渌阎椒?。
能特征鑒定腫瘤或癌細(xì)胞中ras基因、RNA或蛋白質(zhì)的這些試驗(yàn)的結(jié)果可用于診斷和預(yù)后。因?yàn)橐吧蛂as具有生長抑制活性，此活性的存在是采用上述試驗(yàn)的病人所需要的。一般，最差的情況是病人的腫瘤或癌細(xì)胞中不存在野生型ras的生長抑制活性。更理想的情況和病人更好的預(yù)后是通常其腫瘤或癌細(xì)胞膜中具有野生型ras的生長抑制活性。
作為治療或預(yù)防劑的野生型ras基因本發(fā)明還提供通過提高細(xì)胞中表達(dá)具有生長抑制活性的野生型ras蛋白質(zhì)來抑制或阻止細(xì)胞生長的方法。可用各種方法來提高這種活性的表達(dá)。這些方法通常包括將編碼野生型ras蛋白質(zhì)的多核苷酸序列引入細(xì)胞，可將DNA或RNA引入這些細(xì)胞。也可以將ras蛋白質(zhì)引入細(xì)胞。某些情況下，可給予能提高已存在于細(xì)胞中的ras基因表達(dá)野生型ras活性的藥物。
應(yīng)明白這些方法可用于治療患有可用野生型ras治療的腫瘤或癌癥的受試者。這些方法也可用于預(yù)防個體中可能形成的腫瘤或癌癥。提高ras表達(dá)的方法優(yōu)選用于患有腫瘤或癌癥而其腫瘤或癌細(xì)胞中無野生型ras活性或降低的個體。然而，本方法也可用于雖有野生型ras活性但熟知的該ras信號傳導(dǎo)通路仍被激活，從而導(dǎo)致腫瘤或癌癥的形成和生長這類情況。當(dāng)ras以外的基因或ras信號傳導(dǎo)通路以外的通路引起個體腫瘤或癌癥時，也可采用本方法。
在這些方法中，“野生型ras蛋白質(zhì)”總體指前述ras超基因家族成員編碼的任何野生型蛋白質(zhì)。更優(yōu)選所用野生型ras蛋白質(zhì)是該超家族中的ras亞家族成員編碼的蛋白(如H-ras，K-ras，N-ras)。最優(yōu)選的野生型ras蛋白是K-ras蛋白。本方法中所用的基因和蛋白質(zhì)宜為人源性的，雖然也可以是鼠源性的。這些蛋白和編碼它們的序列是本領(lǐng)域熟知的，這些基因和蛋白質(zhì)的序列可在因特網(wǎng)上生物技術(shù)信息國家中心(National Center For Biothchnology Information)提供的數(shù)據(jù)庫中或其它類似數(shù)據(jù)庫中找到。
通過一個或多個不同的試驗(yàn)測定ras蛋白、或DNA、RNA的生長抑制活性。一組這種試驗(yàn)包括將該基因或蛋白引入培養(yǎng)的細(xì)胞或動物中，然后測定該基因或蛋白對細(xì)胞生長的作用。生長抑制活性導(dǎo)致生長抑制。另一方法是將該基因或蛋白引入細(xì)胞，然后測定ERK MAP激酶的活性，可采用本領(lǐng)域熟知的生化試驗(yàn)進(jìn)行此測定。
本方法還提供對ras基因或其編碼蛋白質(zhì)的修飾，導(dǎo)致該蛋白給藥后在人體或動物中穩(wěn)定性或半衰期提高。重要的是應(yīng)指出，對野生型ras基因或蛋白質(zhì)的任何修飾都屬于本發(fā)明范圍，只要這種修飾的、縮短的、或部分的蛋白質(zhì)保留了所述抗增殖、生長抑制、抗腫瘤發(fā)生、抗致癌性、抗惡變等某些活性。
可用各種方法將野生型ras基因引入。許多這些方法是基因治療領(lǐng)域所熟知的?？捎酶鞣N方法如用編碼野生型ras活性或能刺激野生型ras活性的病毒載體轉(zhuǎn)染或感染腫瘤或癌細(xì)胞來引入基因。
本發(fā)明提供將野生型ras基因引入人或動物細(xì)胞，例如人或動物腫瘤細(xì)胞的方法。將基因引入人體或動物有各種方法。一種優(yōu)選的方法采用給予人體或動物含克隆的野生型ras基因的重組病毒。使該病毒感染腫瘤細(xì)胞將基因引入人體或動物細(xì)胞的另一方法包括直接給予人或動物編碼野生型ras的純化DNA?？赏ㄟ^注射該DNA給藥。這些方法通常用于疫苗領(lǐng)域，特別是用于所謂的“DNA疫苗”。
為了將編碼野生型ras活性的多核苷酸序列引入細(xì)胞，通常將該多核苷酸的此蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接于能促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄成mRNA，以及將此mRNA翻譯為野生型ras的序列。本領(lǐng)域進(jìn)行此種連接常用的方法是將編碼ras蛋白質(zhì)的多核苷酸序列克隆入一載體中，該載體含有能促進(jìn)其中克隆的蛋白質(zhì)編碼序列表達(dá)的序列。
表達(dá)載體通常含有促進(jìn)基因表達(dá)的序列。表達(dá)載體含有的轉(zhuǎn)錄單元包含組裝的蛋白質(zhì)編碼序列、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常包括啟動轉(zhuǎn)錄的那些元件，這類元件的類型包括啟動子和增強(qiáng)子。啟動子可以是組成性、可誘導(dǎo)性和組織特異性啟動子。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件還包括終止轉(zhuǎn)錄或提供RNA 3’端加工信號(聚腺苷酸化信號)的那些元件。翻譯調(diào)控元件是蛋白質(zhì)編碼序列的正常部分，包括翻起始密碼子和翻譯終止密碼子。該蛋白質(zhì)編碼區(qū)部分可有其它序列如引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜的信號序列。
引入細(xì)胞的ras序列在引入細(xì)胞后宜以高水平表達(dá)(即引入的多核苷酸序列在細(xì)胞中產(chǎn)生大量的ras蛋白質(zhì))。使引入的多核苷酸序列高水平表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。這些技術(shù)通常包括但不限于一旦引入細(xì)胞后提高多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。這些技術(shù)通常包括采用能使引入的多核苷酸序列高速啟動的轉(zhuǎn)錄啟動子。已有各種啟動子為本領(lǐng)域所熟知。通常這類啟動子衍生自病毒。這類啟動子可導(dǎo)致多核苷酸序列在各種類型細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄。這類啟動子可以是組成型(如人巨細(xì)胞病毒的CMV增強(qiáng)子/啟動子)、或可誘導(dǎo)性(如小鼠乳房腫瘤病毒的MMTV增強(qiáng)子/啟動子)。各種組成型和可誘導(dǎo)性啟動子和增強(qiáng)子是本領(lǐng)域知道的。也可采用能導(dǎo)致多核苷酸在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的其它啟動子，即所謂的“組織特異性啟動子。已有能在特定組織中表達(dá)的各種啟動子是本領(lǐng)域知道的。例如，已有對神經(jīng)、肝、上皮和其它細(xì)胞特異性的啟動子是本領(lǐng)域熟知的。制備這類DNA分子的方法(如重組DNA方法)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
專業(yè)上，載體指能介導(dǎo)與其連接的另一核酸或多核苷酸序列引入細(xì)胞的核酸分子。一種優(yōu)選的載體是游離體，即一種能在染色體外復(fù)制的核酸。其它類型的載體在其引入細(xì)胞時成為細(xì)胞基因組的一部分。能引導(dǎo)插入的DNA序列表達(dá)的載體稱為“表達(dá)載體”，包括質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的其它類型分子。
通常，載體含有允許ras多核苷酸插入的一個或多個限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)。載體還可含有一標(biāo)記基困，如顯性抗菌素抗性基因，其編碼的化合物能鑒定和分離已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
用于本發(fā)明的一種載體是病毒載體。病毒載體一般是基于不同病毒家族(包括痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、細(xì)小病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)的重組病毒。這些重組病毒一般包含外源性多核苷酸序列(此地是ras基因)，并且此外源性多核苷酸處在能使該外源性多核苷酸序列在病毒感染細(xì)胞中表達(dá)的啟動子控制下。
一種病毒載體是缺陷性腺病毒，其基因組中具有插入的外源性多核苷酸序列。術(shù)語“缺陷性腺病毒”指在靶細(xì)胞中不能自主復(fù)制的腺病毒。通常，缺陷性腺病毒的基因組沒有在被感染細(xì)胞中復(fù)制所必須的序列，部分或優(yōu)選完全從基因組中除去這種序列。為了能感染靶細(xì)胞，在體外制備構(gòu)建物時該缺陷性病毒應(yīng)含有最初基因組的足夠長的序列以允許病毒顆粒包裹。該病毒所含的其它序列是遺傳學(xué)上所需的“順式”序列。
另一種病毒載體是一種缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒，其基因組中具有插入的外源性多核苷酸序列。這類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是本領(lǐng)域熟知的。用于本發(fā)明的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)選沒有污染輔助病毒。輔助病毒是無復(fù)制缺陷但在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝時有時會出現(xiàn)的病毒。
也可采用無缺陷或復(fù)制活性病毒載體。這類載體保留了病毒復(fù)制所必須的序列。
其它類型的載體是質(zhì)粒載體。
一個方面，本方法包括將優(yōu)選包含在一載體中的ras多核苷酸序列引入特定的細(xì)胞，使該細(xì)胞表達(dá)升高水平的野生型ras。此地，可用本領(lǐng)域所知的各種方法將DNA分子，具體是編碼ras多核苷酸序列的DNA分子引入或轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。一種將分離的DNA引入細(xì)胞中的方法稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染通常用能促進(jìn)細(xì)胞攝取該DNA的各種方法處理細(xì)胞或DNA。例如，用化學(xué)方法處理細(xì)胞，使其允許DNA透入。也可處理DNA，例如將DNA包含在脂質(zhì)體中使細(xì)胞能內(nèi)化。優(yōu)選利用轉(zhuǎn)染將DNA引入細(xì)胞。
如上所述，可利用病毒將ras多核苷酸序列引入細(xì)胞。例如，引入細(xì)胞的多核苷酸是克隆入病毒基因組中的多核苷酸。用這類病毒感染細(xì)胞導(dǎo)致病毒基因組引入該細(xì)胞。由于克隆的多核苷酸成了病毒基因組的一部分，其就與病毒基因組一起引入了細(xì)胞。這類病毒“載體”可含有DNA或RNA基因組。許多這類病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在其基因組中含有克隆的編碼ras蛋白質(zhì)的多核苷酸的病毒載體，稱為“重組”病毒。用病毒轉(zhuǎn)運(yùn)DNA分子具體可用于將多核苷酸序列轉(zhuǎn)運(yùn)入動物的特定細(xì)胞或組織。此類技術(shù)通常為基因治療領(lǐng)域所知道。
將多核苷酸序列引入患病的人或動物的另一方法，包括直接給予人或動物純化的含編碼ras蛋白質(zhì)的多核苷酸的DNA?？赏ㄟ^注射DNA或轉(zhuǎn)染DNA進(jìn)行給藥。這些方法通常用于疫苗領(lǐng)域，特別是所謂“DNA疫苗”的給藥。
無論用何種方法給予人或動物野生型ras基因，這類方法可包括能導(dǎo)致野生型ras基因優(yōu)先進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，而較差進(jìn)入非腫瘤細(xì)胞的變化。例如，本領(lǐng)域知道能導(dǎo)致重組病毒特異性感染人或動物中某種類型細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的技術(shù)。對于病毒，可通過制備該重組病毒的細(xì)胞受體，和/或制備能識別和結(jié)合該病毒細(xì)胞受體的病毒配體來實(shí)現(xiàn)這種“靶向”。用于引入野生型ras基因到動物或人腫瘤細(xì)胞中的這類方法在本申請的范圍內(nèi)。
在基因轉(zhuǎn)移和基因治療領(lǐng)域已知將外源多核苷酸序列引入特定細(xì)胞但不引入其它細(xì)胞的方法。例如，本領(lǐng)域知道能導(dǎo)致重組病毒特異性感染人或動物中某種類型細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)的技術(shù)。對于病毒，可通過制備該重組病毒的細(xì)胞受體，和/或制備能識別和結(jié)合該病毒細(xì)胞受體的病毒配體來實(shí)現(xiàn)這種“靶向”。用于引入野生型ras基因到動物或人腫瘤細(xì)胞中的這類方法在本申請的范圍內(nèi)。
將ras多核苷酸引入細(xì)胞后，采用技術(shù)來特異性檢測細(xì)胞中是否已引入了該多核苷酸序列，和/或表達(dá)了引入的多核苷酸序列的特異性細(xì)胞。已有檢測存在的多核苷酸序列和/或多核苷酸序列表達(dá)的各種技術(shù)，是本領(lǐng)域熟知的。一些這樣的技術(shù)包括Southen印跡、Northen印跡、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、Western印跡、RNA保護(hù)、放射性碘攝取試驗(yàn)等。
野生型ras蛋白質(zhì)作為治療劑本發(fā)明另一方面提供一種通過向細(xì)胞引入ras蛋白質(zhì)來抑制或遏制細(xì)胞生長的方法。已有各種將蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的方法。本領(lǐng)域知道將蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的各種方法。在一方法中，將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于或融合于能引導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞的短肽。一組這樣的短肽稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。將蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的另一種方法是采用脂質(zhì)運(yùn)載體。例如，將蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體結(jié)合，當(dāng)該脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞或與細(xì)胞融合時能進(jìn)入細(xì)胞。已知將蛋白質(zhì)引入細(xì)胞的其它方法。顯微注射和電穿孔是這樣的二種方法。其它方法是已知的。
這些方法包括但不限于“蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“蛋白質(zhì)治療”，見Nagahara等，1998，Nat Med，41449-52發(fā)表文章和Dowdy實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的文章中的描述(Nagahara等，1998，Nat Med.41449-52；Schwarze等，1999，Science.2851569-72；Vocero-Akbani等，2000，Methods Enzymol.322508-21；Ho等，2001，Cancer Res，61474-7；Vocero-Akbani等，2001.Methods Enzymol.33236-49；Snyder和Dowdy，2001，Curr Opin Mol Ther，3147-52；Becker-Hapak等，2001，Methods，24247-56)，這些文章納入本文參考文獻(xiàn)。
在一實(shí)施例中，將人免疫缺陷病毒TAT蛋白質(zhì)(Green和Loewenstein，1998，Cell，551179-88；Frankel和Pabo，1988，Cell，551189-93)的“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”(PTD)的11個氨基酸序列融合于野生型ras蛋白質(zhì)。將該純化的融合蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面接觸，細(xì)胞即攝取野生型ras蛋白，發(fā)揮其抑制或遏制細(xì)胞生長的功能。此例中需要將融合于PTD的野生型ras蛋白引入人或動物的腫瘤細(xì)胞中，有各種方法將該蛋白給予人，優(yōu)選通過注射(如靜脈內(nèi))或氣溶膠吸入給予此蛋白。
含有融合的PTD的野生型ras蛋白宜通過將編碼野生型ras基因的DNA序列與編碼PTD的DNA序列融合來制備。宜將產(chǎn)生的ras-PTD融合基因摻入一載體，例如質(zhì)?；虿《据d體以促進(jìn)該融合基因引入生物和在生物中高水平表達(dá)，在細(xì)胞中產(chǎn)生大量的的該融合蛋白。可表達(dá)載體中所含此融合基因的一種生物是細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知道常用的其它生物。此融合蛋白在這些生物中以高水平表達(dá)后，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)從生物中純化此融合蛋白。
宜以藥物組合物形式給予人或其它動物野生型ras蛋白。適合于輸送的制劑見Renington’s Pharmaceutical Sciences，17th(Mack Publishing公司，費(fèi)城，賓西法尼亞州，1985)。這些藥物組合物適合用于各種藥物輸送系統(tǒng)(Langer，Science.2491527-1533，1990)。
組合物中的野生型ras蛋白適合于單次給藥或一系列接種。此藥物組合物可腸胃外、局部或口服給藥。腸胃外給藥宜為靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)給藥。腸胃外給藥優(yōu)選通過肝動脈導(dǎo)管或膽道插管進(jìn)入病人的肝臟。腸胃外給藥，該組合物可包含ras蛋白和適合的無菌運(yùn)載體，如水、水性緩沖液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸或無毒性非離子表面活性劑的乳液，這是本領(lǐng)域知道的。該組合物還可包含接近生理狀態(tài)的物質(zhì)如緩沖劑和濕潤劑，NaCl、KCl、CaCl2、乙酸鈉和乳酸鈉等。應(yīng)注意，除了以藥學(xué)上可接受的組合物給予ras蛋白外，也可給予作為此組合物一部分的編碼ras蛋白的DNA或RNA。
包含ras蛋白的固體組合物以常規(guī)的無毒性固體運(yùn)載體，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素或纖維素衍生物、碳酸鈉和碳酸鎂配制。對于口服給予的固體組合物，HCV樣顆粒宜含10％-95％，更優(yōu)選25％-75％的該組合物。
給予個體治療或預(yù)防有效量的ras蛋白組合物。該組合物可單劑給藥，但更多為一系列劑量在數(shù)天、數(shù)周、或甚至數(shù)月期間給藥。本文中，有效治療量是能抑制腫瘤生長或甚至導(dǎo)致腫瘤消退的劑量，此劑量也能抑制或防止腫瘤轉(zhuǎn)移。本文中，有效預(yù)防量是防止腫瘤形成的劑量。
野生型ras表達(dá)對ERK MAP激酶的作用本發(fā)明另一方面提供一種抑制ERK MAP激酶活性的方法。如上所述將編碼野生型ras蛋白的基因或野生型ras蛋白引入細(xì)胞后，產(chǎn)生對ERK MAP激酶的抑制。
實(shí)施例以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，進(jìn)一步明確本發(fā)明的范圍。本文所引用的所有參考物都納入本文參考文獻(xiàn)中。
實(shí)施例1野生型K-ras基因?qū)δ[瘤細(xì)胞系的生長抑制進(jìn)行了轉(zhuǎn)染研究，其中野生型K-ras抑制了名為R16(You等，1989，Proc NatlAcad Sci USA，863070-4)的轉(zhuǎn)化NTH/3T3細(xì)胞系的生長，和名為LM2(McDoniels-Silvers等，2001，Exp Lung Res.27297-318)的小鼠肺腫瘤細(xì)胞系的生長。這二個細(xì)胞系含有K-ras突變體等位基因。R16衍生自含有K-ras密碼子12第二位GC→AT轉(zhuǎn)換的小鼠肺腫瘤DNA轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞。R16細(xì)胞顯示高水平表達(dá)突變體K-ras(比野生型K-ras等位基因高約10倍)。LM2是尿烷誘生A/J小鼠品系肺腫瘤而建立的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系。LM2含有K-ras密碼子61第二位的AT→GC轉(zhuǎn)換。
用衍生自小鼠cDNA序列的引物從A/J小鼠正常肺分離的總mRNA作RT-PCR，分離野生型K-ras4B的全長cDNA，制備含野生型K-ras的表達(dá)載體(George等，1985，Embo J.41199-203)。通過將cDNA連接pCR3.1哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen，Carlsbad，California)，制備野生型K-ras表達(dá)構(gòu)建物。用Maxi-tip500柱(QIAGEN，Santa Clarita，California)純化此表達(dá)構(gòu)建物并測序，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
在相同條件下，用Lipofectamine(Life Technologies，Gaithersburg，馬里蘭州)以1.5-2μg以下克隆pCR3.1載體單獨(dú)和野生型K-ras4B的純化質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染同一代的R16和LM2細(xì)胞。在G418中選擇，挑選出轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。直接測定G418抗性R16細(xì)胞，并將G418抗性LM2細(xì)胞亞克隆成穩(wěn)定的克隆。用這些細(xì)胞分析生長速率和集落形成效率。用12孔板每孔接種2000個細(xì)胞測定這些細(xì)胞的生長速率。R16細(xì)胞一式二份培養(yǎng)在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)液(DMEM)加10％FBS和50μg/mlG418中。LM2細(xì)胞培養(yǎng)在CMRL1066加10％FBS和50μg/mlG418中。接種后培養(yǎng)細(xì)胞1、2、4、6和8天(圖4和5)。對于集落形成試驗(yàn)，采用4個平板，直徑10厘米，各用于一個亞克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。各平板接種1000個細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM加10％FBS和50μg/mlG418中。用10％福爾馬林緩沖液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)可見集落(直徑大于1.5mm)。在這些亞克隆中和在集落形成試驗(yàn)選出的克隆中，用轉(zhuǎn)染克隆攜帶的獨(dú)特序列作RT-PCR，監(jiān)測轉(zhuǎn)染的野生型K-ras的表達(dá)。特別是，用野生型K-ras轉(zhuǎn)染從G418抗性細(xì)胞分離的RNA，產(chǎn)生cDNA。在這些cDNA上用位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后的載體序列的特異性引物(5’TAATACGACTCACTATAGGG3’)和K-ras基因內(nèi)編碼序列(5’CTCTATCGTAGGGTCGTAC3’)進(jìn)行PCR。
如圖4a所示，野生型K-ras轉(zhuǎn)染的R16細(xì)胞顯著抑制了細(xì)胞生長(第6天80％抑制)。而空載體對照細(xì)胞中有65個以上集落生長，野生型K-ras轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞只觀察到很少的集落(不到10)，見圖4b和c。在選出的G418抗性細(xì)胞(LM2-K-ras4B H)克隆中，野生型K-ras基因轉(zhuǎn)染的LM2顯著抑制了細(xì)胞生長(第4天90％抑制)，見圖5a。LM2-K-ras4B H表達(dá)了高水平的轉(zhuǎn)染的野生型K-ras(圖5d)，而空載體對照細(xì)胞中有200個以上的集落，LM2-K-ras4B H細(xì)胞中只見到很少的集落(圖5b和c)。LM2細(xì)胞平均有30個集落表達(dá)轉(zhuǎn)染的野生型K-ras，水平低3倍(命名為LM2-K-ras4B H)，見圖5d，表明野生型K-ras的抑制作用是劑量依賴性的(圖5b-d)。
檢驗(yàn)了轉(zhuǎn)染的野生型K-ras的抑制作用是否可用致癌性K-ras蛋白表達(dá)減少來解釋。LM2細(xì)胞在K-ras的密碼子61中含有CAA→CGA突變。無法得到能識別此突變K-ras的抗體，因而采用另一方法。GTP結(jié)合而非GDP結(jié)合的Ras可與c-Raf的Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)結(jié)合，可用細(xì)菌表達(dá)的GST-RBD作為親和基質(zhì)來分離LM2細(xì)胞系中GTP結(jié)合的K-ras致癌形式。
在溫和的裂解緩沖液(10mM Tris-HCl pH-7.5，100mM NaCl，1％NP-40，5mM MgCl2，0.2mM PMSF，2μg/ml亮抑肽酶，5μg/ml抑蛋白酶肽，1mM)中裂解LM2細(xì)胞，離心澄清。用Bradford試驗(yàn)測定蛋白濃度(BioRad)，均分樣品，然后與預(yù)交聯(lián)于谷胱甘肽瓊脂糖的40μgRaf的GST-RBD(Hermann等，1995，J Biol Chem.2702901-5)培育，或單與瓊脂糖培育?；旌隙r后洗滌瓊脂糖珠并用SDS樣品處理緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。用抗K-rasF234抗體(Santa Cruz Biotechnology)作Western印跡，顯示結(jié)合的K-ras蛋白質(zhì)。
如圖6所示，在所有測試的細(xì)胞系中分離到相等量的致癌性K-ras，但轉(zhuǎn)染的野生型K-ras表達(dá)程度不同。LM2-4S-11和LM2-K-ras4BH表達(dá)了相當(dāng)高水平的轉(zhuǎn)染野生型K-ras，而LM2-4S-3、LM2-K-ras4B L、和LM2-4S-M1只有相對低水平的轉(zhuǎn)染野生型K-ras。作為陽性對照的293細(xì)胞用K-rasV12(pCDNA3-K-rasV12；GTP-結(jié)合)或K-rasN17(pCDNA3-K-rasN17；GDP-結(jié)合)轉(zhuǎn)染，只有K-rasV12與GTP-RBD結(jié)合(圖6a)。此數(shù)據(jù)顯示，致癌性K-ras的表達(dá)不受野生型過度表達(dá)的影響。
實(shí)施例2野生型K-ras抑制ERK活性這些研究測定到野生型K-ras影響ERK活性。已知MAP激酶活化在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著重要作用。用抗磷酸-ERK抗體作免疫印跡測定ERK活性。抗磷酸-ERK抗體所識別的活化環(huán)磷酸化直接調(diào)節(jié)ERK活性。ERK激酶活性直接與用抗磷酸-ERK免疫印跡檢測的信號相關(guān)。
如實(shí)施例1所述，這些研究中采用了LM2-K-ras4B和HLM2-4S-11細(xì)胞系。為分析HRK活性，分別用含10％FBS的DMEM和CMLR1066培養(yǎng)液培養(yǎng)HEK293和LM2細(xì)胞。用50ng/mlEGF刺激ERK活性10分鐘，培養(yǎng)不用EGF刺激的HEK細(xì)胞作為陰性對照，用EGF刺激的HEK293細(xì)胞作為陽性對照。如實(shí)施例1所述，直接用SDS樣品處理緩沖液裂解細(xì)胞，并用抗ERK抗體或抗磷酸-ERK抗體(Sigma Chemical公司，圣路易斯，密蘇里州)作Western印跡分析。
如圖6b所示，觀察到野生型K-ras表達(dá)與ERK活性之間反相關(guān)。LM2-K-ras4B和HLM2-4S-11細(xì)胞系具有較高水平的K-ras表達(dá)(圖5d)并顯示比載體對照細(xì)胞明顯低的ERK活性(圖6d)。相反，LM2-K-ras4B L、LM2-4S-3、和LM2-4S-M1細(xì)胞具有較低水平K-ras表達(dá)(圖5d)并顯示相對正常的ERK活性(圖6b)。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)染的野生型K-ras抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞系體外的腫瘤生長此研究顯示野生型K-ras抑制了裸鼠中R16和LM2細(xì)胞系的體外腫瘤生長。如實(shí)施例1所述，將野生型K-ras或空載體轉(zhuǎn)染入R16和LM2細(xì)胞。無胸腺小鼠(4-6周齡)獲自Jackson Laboratory(Bar Harbor，Maine)。將約1百萬個對數(shù)生長期的細(xì)胞皮下注射到裸鼠兩腹側(cè)，每種亞克隆用5只動物。每天監(jiān)測動物健康狀況和核查腫瘤大小，記錄腫瘤潛伏期(出現(xiàn)時間)和大小(mm3)。細(xì)胞注射后2-4周麻醉處死小鼠測量腫瘤重量。用RT-PCR驗(yàn)證所有裸鼠腫瘤中野生型K-ras克隆的表達(dá)。
如圖7a-d所示，注射載體對照細(xì)胞的所有5只小鼠產(chǎn)生了大腫瘤，而注射攜帶野生型K-ras的R16和LM2細(xì)胞的5只小鼠中只觀察到小腫瘤。野生型K-ras轉(zhuǎn)染組中的腫瘤(約0.3g和0.05g)比載體對照小鼠中的腫瘤(約1.9g和0.6g)明顯較小(圖7d)(p＜0.0001)。這些結(jié)果表明野生型K-ras抑制了R16和LM2細(xì)胞的致腫瘤能力。
實(shí)施例4用病毒載體將野生型K-ras基因輸送給人通過將野生型K-ras基因重組入腺病毒基因組構(gòu)建重組腺病毒。培養(yǎng)病毒并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。為測試重組K-ras腺病毒表達(dá)K-ras基因的能力，感染培養(yǎng)的細(xì)胞，制備感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物，并用K-ras蛋白的特異性抗體作免疫印跡分析該提取物是否存在K-ras蛋白。將表達(dá)K-ras的重組病毒給予患腫瘤的人，然后監(jiān)測已給予該重組腺病毒的人中腫瘤的生長。
實(shí)施例5用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)將野生型K-ras蛋白質(zhì)給予人構(gòu)建一細(xì)菌質(zhì)粒表達(dá)載體，其含有攜帶編碼人免疫缺陷病毒TAT基因(融合于野生型K-ras基因的5’端)的11個氨基酸蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域核苷酸序列的野生型K-ras基因。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，產(chǎn)生攜帶有融合于該蛋白質(zhì)氨基端的11個氨基酸PTD的野生型K-ras蛋白質(zhì)(K-rasPTD融合蛋白)。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從轉(zhuǎn)化大腸桿菌純化得到K-rasPTD融合蛋白。將該K-rasPTD融合蛋白給予患腫瘤的人，通過靜脈注射或氣溶膠吸入給藥。給予人的K-rasPTD融合蛋白包含在藥物制品中，該制品的具體給藥途徑是可接受的。
實(shí)施例6活化ras和野生型ras丟失所致癌癥的診斷通過活檢獲得人腫瘤的組織樣品。用標(biāo)準(zhǔn)方法裂解組織樣品所含細(xì)胞并分離細(xì)胞的DNA。采用能擴(kuò)增編碼K-ras蛋白的K-ras基因組序列區(qū)域的引物對分離的DNA進(jìn)行PCR，然后測定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。分析獲得的DNA序列以確定是否存在已知的激活突變，并確定K-ras中是否存在能導(dǎo)致野生型K-ras蛋白的生長抑制活性消除的其它突變。
實(shí)施例7與野生型ras丟失相關(guān)的癌癥特征分析對總共22個腺癌和8個大細(xì)胞癌作染色體22上雜合性丟失的基因型分析。這些腫瘤和它們的配對正常組織獲自O(shè)hio州立大學(xué)(Columbus，OH)病理系和Cincinnati大學(xué)(Cincinnati，OH)的Cooperative Human Tissue Network。一病理學(xué)家給所有腫瘤作了組織病理分類。按照公布的程序(Blin N& Stafford，D.W.1976，Nucleic Acid Res，32303-8)，分離每個病例的腫瘤和正常組織的高分子量DNA。用染色體12p上的8個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記D12S89、D12S358、D12S319、D12S1606、D12S1596、G60541、D12S1617和D12S1592(Research Genetics有限公司)作等位基因的丟失的PCR分析。評分8％變性聚丙烯酰胺凝膠上的所有標(biāo)記。干燥凝膠并暴光X線膠片過夜，肉眼觀察給予LOH評分。只有那些40％或以上差異的樣品評為等位基因丟失。采用PCR指導(dǎo)的序列分析，測出所有的肺腺癌和大細(xì)胞癌DNA中有K-ras2基因密碼子12突變。如M.，Wang，Y.，Stoner，G.，You，L.，Maronpot，R.，Reynolds，S.H和Anderson，M.1992，Proc Natl Acad Sci USA，895804-8所述進(jìn)行了肺腫瘤K-ras2外顯子1的PCR擴(kuò)增。K-ras2外顯子1的PCR引物序列為K-ras2-1F5’-TTTTTATTATAAGGCCTGCT-3’SEQ ID NO.-和K-ras2-1R5’-GTCCACAAAATGATTCTGAA-3’，SEQ ID NO.-。用QIA快速凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)洗脫114bpPCR產(chǎn)物。用ABI PRISM 3700 DNA分析儀(Perkin-Elmer/Applied Biosystems)檢測密碼子12的突變。
總之，分析的8個微衛(wèi)星標(biāo)記集中在K-ras2區(qū)。表3小結(jié)了各標(biāo)記的等位基因型數(shù)據(jù)。22個腺癌中的11個(50％)和8個大細(xì)胞癌中的4個(50％)發(fā)現(xiàn)有所用標(biāo)記之一的等位基因丟失。圖8a顯示染色體12p的8個微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因型分析的代表性結(jié)果。對于K-ras2突變分析，我們的數(shù)據(jù)顯示22個腺癌中的9個(40.9％)和8個大細(xì)胞癌中的3個(37.5％)在密碼子12中含有K-ras2突變(GCT→TGT，CGT，GAT，GCT，GTT轉(zhuǎn)換，圖8b，表3)。當(dāng)綜合LOH分析和K-ras2突變資料時，發(fā)現(xiàn)腺癌和大細(xì)胞癌中染色體12p上的大多數(shù)等位基因丟失與活化K-ras2突變相對應(yīng)。大約82％(11個有9個)腺癌和75％(4個有3個)大細(xì)胞癌顯示染色體12p有等位基因丟失，同時保留了活化的K-ras2等位基因。圖9顯示帶有12p上K-ras2突變和一個或多個基因座中LOH的12個腫瘤。其中腫瘤HCG0688L、5796A、HCG1595A、HCG1610L和HCG1618A顯示分析的所有信息標(biāo)記都丟失，而腫瘤363A只丟失D12S1596標(biāo)記同時在最近的信息標(biāo)記D12S319和D12S1592處保留了雜合性。腫瘤167A和5471A也顯示K-ras2所位于的標(biāo)記D12S1617/G60541的末端缺失，在最近信息標(biāo)記D12S1592處保留了雜合性(圖9)。LOH數(shù)據(jù)將LOH的最小區(qū)域定位于標(biāo)記D12S1606和D12S1617/G60541。生理基因組圖譜將K-ras2基因定位于800kb區(qū)域中這二標(biāo)記側(cè)接的一部位。結(jié)果表明人肺腺癌和大細(xì)胞癌中丟失了野生型K-ras2等位基因。
表3非小細(xì)胞肺癌染色體12上的LOH
Ia具有所選標(biāo)記信息的腫瘤數(shù)目。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞增殖的方法，其特征在于，所述方法包括提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種野生型rsa蛋白的胞內(nèi)水平。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過a)在細(xì)胞中引入含有野生型ras蛋白編碼區(qū)的核酸，和b)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)野生型ras蛋白提高細(xì)胞內(nèi)野生型ras蛋白胞內(nèi)水平。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人或其它動物的腫瘤細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸是含有能導(dǎo)致野生型ras蛋白編碼區(qū)高水平轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的DNA。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸是病毒基因組的一部分。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述野生型ras蛋白選自野生型K-ras蛋白、野生型N-ras蛋白、野生型H-ras蛋白或它們的組合。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，野生型ras蛋白的胞內(nèi)水平通過將一種或多種野生型ras蛋白引入細(xì)胞中而提高。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述細(xì)胞是人或其它動物的腫瘤細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述野生型ras蛋白還包含一蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含人免疫缺陷病毒TAT蛋白的11個氨基酸序列。
11.一種降低細(xì)胞內(nèi)ERK MAP激酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括提高細(xì)胞內(nèi)野生型ras蛋白的水平。
12.一種評價(jià)哺乳動物中某腫瘤的方法，其特征在于，所述方法包括提供該腫瘤的細(xì)胞；和測定腫瘤細(xì)胞基因組中至少一種內(nèi)源性ras等位基因中功能性突變的丟失。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，還包括測試所述細(xì)胞基因組中內(nèi)源性ras等位基因之一中的激活突變。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述功能性突變的丟失導(dǎo)致產(chǎn)生具有降低的細(xì)胞增殖活性的突變r(jià)as蛋白。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述功能性突變的丟失導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中ras蛋白的水平比正常細(xì)胞中的ras蛋白水平降低。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述功能性突變的丟失導(dǎo)致野生型ras等位基因全部或部分丟失。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，一個ras等位基因中存在功能性突變丟失，另一個ras等位基因中存在激活突變，表明預(yù)后不良。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，是功能性突變的丟失發(fā)生在ras等位基因的第一、第二或第三外顯子中。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過測定細(xì)胞內(nèi)一種或多種野生型ras蛋白的胞內(nèi)水平來檢測功能性突變的丟失。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過測定編碼一種或多種野生型ras蛋白的mRNA的胞內(nèi)水平來檢測功能性突變的丟失。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過測定細(xì)胞基因組內(nèi)一種或多種野生型ras等位基因的存在與否來檢測功能性突變的丟失。
22.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過測定細(xì)胞中一種或多種野生型ras蛋白的細(xì)胞增殖活性來檢測功能性突變的丟失。
23.一種預(yù)防或治療哺乳動物腫瘤或癌癥的方法，其特征在于，所述方法包括給予受試者野生型ras蛋白或編碼和表達(dá)野生型ras蛋白的核酸。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，將野生型ras蛋白注射到受試者的腫瘤中。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，給受試者注射編碼野生型ras蛋白的核酸。
26.一種預(yù)測人類受試者癌癥預(yù)后的方法，其特征在于，所述方法包括測定獲自受試者的腫瘤細(xì)胞中一種或多種ras等位基因中功能性突變的丟失。
27.一種誘導(dǎo)雜合性ras敲除小鼠中肺腫瘤形成的方法，其特征在于，所述方法包括給所述小鼠注射化學(xué)致癌劑。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制細(xì)胞、尤其是癌癥細(xì)胞增殖的方法。所述方法包括提高細(xì)胞中一種或多種野生型ras蛋白質(zhì)的胞內(nèi)水平。一方面，所述方法包括在細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼野生型ras蛋白的核酸。另一方面，通過在細(xì)胞中引入一種或多種野生型ras蛋白而提高一種以上ras蛋白的胞內(nèi)水平。本發(fā)明還涉及野生型ras蛋白或編碼一種或多種野生型ras蛋白的核酸在治療腫瘤或癌癥中的治療性應(yīng)用，或預(yù)防腫瘤或癌癥形成的預(yù)防性應(yīng)用。提供了特征分析或評價(jià)人或動物中癌癥的方法。在一實(shí)施例中，所述方法包括測試獲自受試者腫瘤細(xì)胞基因組中一種或多種內(nèi)源性ras等位基因的丟失。在另一實(shí)施例中，所述方法包括測試獲自受試者的腫瘤細(xì)胞中一種或多種內(nèi)源性ras等位基因中的功能性突變的丟失和一種或多種ras等位基因中的激活突變。
文檔編號A61K35/00GK1729019SQ02820723
公開日2006年2月1日 申請日期2002年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月24日
發(fā)明者M·尤, Y·王, Z·張 申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會