專利名稱：Plga豬流感dna疫苗微球的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及DNA疫苗微球的制備方法。
背景技術：
豬流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種豬的急性、傳染性呼吸道疾病， 傳播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴發(fā)。因為豬流感病毒亞型較多、抗原易發(fā)生變異和可在種間傳播，給流感疾病的預防乃至人類的健康帶來很多挑戰(zhàn)。所以豬流感在人流感和禽流感之間發(fā)揮著關鍵性作用，具有重大的公共衛(wèi)生意義。DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達質粒直接接種體內(nèi)，在體內(nèi)表達相應抗原刺激機體產(chǎn)生針對該抗原的免疫應答，產(chǎn)生保護性免疫。目前，DNA疫苗大動物實驗、 人體臨床實驗結果表明DNA疫苗存在著給藥劑量較大，生物利用度低，免疫效果個體差異大，不夠理想的缺點，極大地阻礙了 DNA疫苗的研究進展。因此如何增強DNA疫苗的免疫效果、誘導產(chǎn)生粘膜免疫等課題是當前DNA疫苗研究的國際熱點。國外DNA疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究發(fā)展十分迅速，取得了不少階段性成果，有的已進入臨床實驗。國內(nèi)DNA疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究工作開展較少，尤其是豬流感DNA疫苗黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究還尚未見有報道。DNA疫苗黏膜免疫遞送系統(tǒng)的研究結果已經(jīng)顯示出了巨大的應用潛力，微球/納米粒遞送系統(tǒng)具有靶向作用，對DNA疫苗具有保護作用， 提高細胞轉運效率，提高免疫效果并可經(jīng)口服和鼻腔給藥，誘導黏膜免疫等特點。因此，DNA 疫苗微球/納米粒黏膜免疫遞送系統(tǒng)是一個很好的遞送系統(tǒng)，將促進DNA疫苗在畜牧業(yè)和臨床的實際應用，屆時用于預防、治療、診斷動物和人的疾患，將拯救諸多病畜或病者的生命或延長其壽命，其經(jīng)濟效益和社會效益無疑是巨大的。目前，普通豬流感DNA疫苗的持續(xù)時間短，在體內(nèi)易被降解，不能夠實現(xiàn)緩釋的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)在豬流感DNA疫苗存在持續(xù)時間短，在體內(nèi)易被降解，不能緩釋的問題，而提供了 PLGA (聚乳酸/羥基乙酸共聚物)豬流感DNA疫苗微球的制備方法。PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉速為7000r/min的條件下加入20mL質量濃度為2%的聚乙烯醇，得復乳；二、復乳在轉速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 -50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA 基因重組質粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA的濃度為120 μ g/mL。
本發(fā)明以可生物降解材料聚乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)為載體，以豬流感病毒 H3N2亞型HA基因重組質粒DNA為模型藥物，采用復乳化-溶劑揮發(fā)法制備PLGA豬流感DNA 疫苗微球，通過考察超聲乳化時間、乳化器攪拌速度、PVA的濃度、油相中PLGA的濃度(m/v) 和DNA疫苗與PLGA比例(mg/mg)等影響因素，篩選出了粒徑適宜、載藥量大、包封率高、藥物穩(wěn)定性好、工藝簡便、制備成本低、工藝重現(xiàn)性好、樣品需要量少，較好保持了 DNA疫苗的活性、具有適宜釋藥速率的PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，并且本發(fā)明中的處方和工藝也可放大到生產(chǎn)應用，因而對產(chǎn)業(yè)化的應用具有指導意義。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圓整，表面光滑，粒徑為 6. 08 士 2. 34 μ m，包封率平均為60 % 士 3. 8 %，載藥量平均為5. 5 % 士 0. 5 % ；在保證DNA疫苗穩(wěn)定性的條件下具有較高的包封率，可以保持體內(nèi)最佳的藥物濃度，并且延長藥物作用的時間；因此，實現(xiàn)了藥物的緩釋、靶向給藥，具有重要的理論價值和實際應用前景，用于動物體或人體一些流行性疾病的預防、治療和診斷，市場規(guī)模巨大，必將創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球生物相容性和生物黏附性好，經(jīng)黏膜免疫大大增強了豬流感疫苗的機體局部和全身的體液免疫及細胞免疫效果；同時克服了傳統(tǒng)注射疫苗造成的順應性差、注射器和針頭導致感染、減活疫苗在儲存和運輸過程中易失活等缺點，且制備方法簡單易行，條件溫和，生產(chǎn)成本較低。 本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球可用于豬流感免疫，經(jīng)口服給藥，按體重免疫注射給藥，給藥量為95 105 μ g/100 μ L。


圖1是具體實施方式
一中PLGA豬流感DNA疫苗微球的掃描電子顯微鏡觀察圖；圖2是具體實施方式
一中超聲時間對DNA疫苗穩(wěn)定性的影響瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中M泳道=DL 15000 Markers ； 1-6泳道超聲乳化時間分別為0、6、8、0、12、14s ；圖3是具體實施方式
一中攪拌速度對DNA疫苗穩(wěn)定性的影響瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中 M 泳道=DL 15000 Markers ； 1-5 泳道攪拌速度分別為 0、6000、7000、8000、9000r/ min ；圖4是Western blot檢測蛋白在293T細胞中的表達情況，其中1泳道293T細胞對照，2泳道質粒DNA，3泳道PLGA豬流感DNA疫苗微球，4泳道空白PLGA微球；圖5是免疫鼠血清中IgG抗體檢測結果的曲線圖，其中·表示裸DNA疫苗組， 表示PLGA微球疫苗試驗組， 表示生理鹽水對照組，▲表示空白微球。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱取25mg的PLGA溶于0. 75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉速為7000r/min的條件下加入20mL質量濃度為2%的聚乙烯醇，得復乳；
二、復乳在轉速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 -50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA 基因重組質粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA的濃度為120 μ g/mL。豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒按以下步驟構建根據(jù)對豬流感病毒四川分離株HA基因的分析，采用primer軟件設計一對特異性擴增引物，上游 PBl :5，-GTGGTACCATGAAGACTATCATTGCTTTGAG-3，；下游 PB2 :5’ -TTGCG GCCGCTTACTAATACACT-CAAATG-3，。在其中分別引入KpnI和NotI酶切位點(加下劃線部分)。采用PCR方法，以重組質粒pMD-HA為模板，擴增出豬流感病毒四川分離株HA基因； PCR反應參數(shù)為先95 °C預變性4min ；后94°C變性30s，60°C退火40s，72 °C延伸2min， 進行30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。采用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的DNA片段，連接到pMDIS-T-simplevector，陽性質粒送往大連寶生物公司測序驗證正確，命名為 pMD-simpIe-HA0將pMD-simple-HA經(jīng)KpnI和NotI雙酶切之后，回收約1. 7Kb大小的DNA片段。 同時用KpnI和NotI雙酶切pcDNA3. 1 (+)，并回收；將經(jīng)過雙酶切后回收的目的DNA片段與 pcDNA3. 1 (+)的酶切回收產(chǎn)物進行連接、轉化到E. coli DH5 α克隆菌，采用氨芐抗性篩選獲得的質粒經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質粒送往大連寶生物公司測序，得到豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒。將豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒命名為pcDNA3. 1_HA。豬流感病毒H3N2 亞型HA基因重組質粒的構建方法記載于《中國農(nóng)學通報》2009年第25 (22) “豬流感H3N2 亞型HA基因真核表達載體構建及其對小鼠的免疫效果的研究”中。本實施方式步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA溶液的制備按照下述步驟1)轉化豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒的感受態(tài)菌接種到加入相應抗生素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)；形成菌落后，挑取單個菌落接種于5mL相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C搖菌培養(yǎng)8 12h ；2)按1/1000的比例將新鮮的菌液接種到500mL LB培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)搖菌培養(yǎng) 8 12h ；于37°C劇烈搖12 16h ；取1 2mL菌液用試劑盒提取后，用酶切電泳分析，以確定正確的質粒擴增；3)離心培養(yǎng)物4°C，8000r/min,離心IOmin后的沉淀物用STE溶液洗(每個500 離心管IOOmL),溶解重懸沉淀后，8000r/min、離心8min，4°C離心去上清；4)加18mL Solution I (染液I)重懸沉淀菌體，再加入ImL新配制的30mg/mL溶菌酶溶液；5)加40mL新配制的Solution II (染液II)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5 IOmin ；6)加30mL冰預冷的Solution III (染液III)，蓋緊瓶蓋，緩慢顛倒離心管數(shù)次， 以充分混勻內(nèi)容物，此時應不再出現(xiàn)分明的兩個液相；置于冰上lOmin，應形成一白色絮狀沉淀；
7) 4°C，9000r/min,離心25min ；(如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000r/min再離心 20min，然后將上清轉入另一瓶中；未形成緊密沉淀塊的原因通常是由于Solution III與細菌裂解物混合部充分)；8)用4層干凈紗布把上清濾至500mL離心管中；根據(jù)上清液的體積，加入上清液體積0. 6倍的異丙醇，混勻后室溫放置IOmin以上；9)室溫下12000r/min離心25min，棄上清，回收核酸；10) 倒掉上清，敞開瓶口倒置離心管是殘余上清流盡，于室溫用1 2mL、70%乙醇洗1 2沉淀和管壁；于室溫將離心管倒置于吸水紙上，使其殘余痕量乙醇揮發(fā)殆盡；11)用 3mL TE (pH 8. 0)溶解核酸沉淀；12)將核酸溶液轉入15mL離心管中，再加3mL冰預冷的5mol/L的LiCl溶液，充分混勻；再 4°C，12000r/min,離心 15min ；13)將上清轉移到另一個30mL離心管中，加等量的異丙醇，充分混勻，室溫 12000r/min，離心 IOmin ；14)小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后的殘留的液滴流盡；用1 2mL、 70%乙醇洗沉淀及管壁；倒掉乙醇，于室溫將離心管倒置于吸水紙上，使其殘余痕量乙醇揮發(fā)殆盡；(應使沉淀保持濕潤)15)用2mL含RNase (20 μ g/mL)的TE (pH 8. 0)溶解沉淀物，分裝到1. 5mL的微量離心管中，室溫或者37°C放置30min ；16)將質粒-RNase混合物用酚-氯仿(1 1)抽提一次，然后用氯仿抽提一次；17)加入2倍體積的無水乙醇，室溫放置30min后，12000r/min, 4°C離心20min，棄
上清；18)用1 2mL、70 %的乙醇洗滌1 2次，離心管倒置在吸水紙或者濾紙上幾分鐘，浙干，但沉淀物應濕潤；19)將質粒DNA沉淀用ImL滅菌水溶解，再加入0. 5mL PEG-MgCl2溶液；20)室溫放置30min以上，用室溫微量離心管機12000r/min離心15 20min，以回收沉淀質粒DNA ；21)沉淀用0. 5mL 70%乙醇重懸以去除微量PEG，用微量離心機13000r/min離心 5min以回收核酸；22)吸去乙醇，重復步驟21)，二次洗滌后，在離心管架上放置10 20min，使乙醇揮發(fā)；23)濕潤的質粒沉淀用500 μ L TE (pH 8. 0)溶解，以1 100用TE稀釋，用紫外分光光度計測定OD26tl和OD28tl,并計算OD26tZOD28tl比值及質粒DNA的濃度，調整濃度為2mg/ mL, _20°C保存，備用，得到豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA溶液。本實施方式步驟一中超聲乳化的時間為10s，所得初乳的乳化效果較好，且豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA的降解不明顯(如圖2所示)。本實施方式步驟一中采用7000r/min的轉速，所得復乳的乳化效果較好，且豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA的降解不明顯(如圖3所示)。本實施方式步驟一中所得復乳的油相中PLGA的濃度(m/v)為4% ；DNA疫苗與 PLGA 的比例(mg/mg)為 0. 5%。
本實施方式方法制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球在_20°C條件下保存3個月，然后電鏡觀察(如圖1所示)，PLGA豬流感DNA疫苗微球形態(tài)規(guī)貝U、外形圓整，表面光滑、分散性好，粒徑為6. 08 士 2. 34 μ m。本實施方式制 備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，加入2mL 二氯甲烷使其完全溶解， 溶解后加入5mL PBS,渦旋振蕩30min，4000r/min離心lOmin，取上清用紫外分光光度儀測定萃取出的DNA的濃度，即可計算出DNA的含量。再根據(jù)公式計算出包封率和載藥量包封率(％ ) = PLGA豬流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的測得含量+制備時豬流感DNA疫苗的理論載藥量X 100%載藥量(％ ) = PLGA豬流感DNA疫苗微球中DNA疫苗的測得含量+PLGA豬流感 DNA疫苗微球的重量X 100%結果本實施方式中制備的制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球的包封率平均為 60% 士3.8%，載藥量平均為 5.5% 士0.5%。本實施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，通過Western-blot檢測微球包裹后豬流感DNA疫苗的體外表達情況。檢測步驟如下接種293T細胞于經(jīng)多聚賴氨酸處理的六孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，次日將豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA從PLGA微球中提取出來。然后將提取出的4yg質粒轉染生長狀態(tài)良好的293T細胞，轉染方法參照脂質體轉染試劑盒(LipOfectamineTM2000reagent)說明書進行。轉染48h后，收集細胞并用 RIPA裂解液溶解，將溶解物低溫高速離心后，-20°C備用。Western blot實驗按李國新等 艮道的方法執(zhí)行(Li GX, Qiu HJ, Han CG, et al. Vaccination of plasmid DNA encoding somatostatin gene fused with GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces anti_GP5 antibodies and promotes growth performance in immunized pigs [J]. Agricultural Sciences in China. 2006,5(3) :234_240.)。上清液樣品與IX SDS上樣緩沖液混合，煮沸5min，制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，按20 μ L/ 孔點樣，在100-120V條件下電泳，電泳結束后，在半干電轉印儀上3ν條件下電轉2h，將蛋白充分轉移至硝酸纖維膜上。IXPBS洗膜5min，5%的脫脂乳4°C封閉過夜，然后用1 500稀釋的兔抗H3N2亞型豬流感病毒的陽性血清與膜在37°C孵育lh，PBST洗4次(每次5min)， 然后用1 5000稀釋的Odyssey紅外標記的第二抗體于37°C避光孵育lh，PBST洗5次后， 再用PBS洗2次，每次5min。用Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描分析。結果表明(見圖4)，微球包裹后的豬流感DNA疫苗能夠在體外培養(yǎng)的293T細胞中進行抗原表達，較好地保持了生物學活性。質粒TM主要是以非分泌形式表達，蛋白表達后大部分附著在細胞上，很少分泌到培養(yǎng)液中，其轉染后的細胞裂解液在72-lOOkDa之間檢測到了一條帶。本實施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球，通過BALB/c小鼠免疫接種試驗檢測本實施方式制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球的免疫效果。檢測步驟如下選取6-8周齡健康雌性BALB/c小鼠40只(中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供并飼養(yǎng))，隨機分成4組，分別為PLGA微球疫苗試驗組、裸DNA疫苗組、空白微球和生理鹽水對照組。肌注給藥的微球混懸于生理鹽水中。免疫前2d，各組小鼠每只脛骨前肌注0.2%的鹽酸利多卡因100 μ L，每個腿各50 μ L0免疫劑量為每只小鼠100 μ g質粒，后腿肌肉注射，共免疫3次，每次間隔3周。分別在三免后第2周、第4周、第6周、第8周斷尾采血，分離血清。采用ELISA法和血凝抑制試驗檢測抗血清抗體水平。 試驗結果(如圖5和表1所示)表明，經(jīng)PLGA微球包裹后的豬流感DNA疫苗能刺激特異性B細胞，增強體液免疫應答，產(chǎn)生的結合抗體水平有了顯著的提高，PLGA豬流感 DNA疫苗微球組體液免疫明顯高于裸豬流感DNA疫苗組，且抗體水平持續(xù)時間長起到了緩釋的作用。 表1免疫小鼠HI抗體檢測結果
權利要求
1. PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，其特征在于PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法按以下步驟制備一、稱取25mg的PLGA溶于0.75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒DNA溶液，冰浴條件下超聲乳化10s，得初乳，然后在轉速為 7000r/min的條件下加入20mL質量濃度為2%的聚乙烯醇，得復乳；二、復乳在轉速為200r/min的條件下磁力攪拌5h，然后在轉速為4000r/min的條件下離心lOmin，收集微球并用滅菌水洗滌3次，再置于-10 _50°C的條件下真空冷凍干燥，即完成PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備；其中步驟一 40 μ 1豬流感病毒Η3Ν2亞型HA基因重組質粒DNA溶液中有2mg豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA ；步驟一中豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA的濃度為120 μ g/mL。
全文摘要
PLGA豬流感DNA疫苗微球的制備方法，它涉及DNA疫苗微球的制備方法。它解決了現(xiàn)在豬流感DNA疫苗存在持續(xù)時間短，在體內(nèi)易被降解，不能緩釋的問題。方法一、PLGA溶于二氯甲烷中，加豬流感病毒H3N2亞型HA基因重組質粒DNA溶液，乳化后加聚乙烯醇，得復乳；二、復乳磁力攪拌后離心，收集微球并洗滌，再真空冷凍干燥即完成。本發(fā)明制備的PLGA豬流感DNA疫苗微球大小均勻，外形圓整，表面光滑，粒徑為6.08±2.34μm，包封率平均為60％±3.8％，載藥量平均為5.5％±0.5％；在保證DNA疫苗穩(wěn)定性的條件下具有較高的包封率，可以保持體內(nèi)最佳的藥物濃度，延長藥物作用時間，實現(xiàn)了藥物的緩釋。
文檔編號A61K9/14GK102319441SQ20111028058
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權日2011年9月21日
發(fā)明者趙凱 申請人:黑龍江大學